劉莉彬，祝啟張，梁漢峰，李肖肖，寧克壯，鄧 輝

（1. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2. 安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012）

大別山區(qū)的安徽省霍山縣，為石斛屬（Dendrobium） 植物分布區(qū)域的最北端，其生在多附生于云霧繚繞的懸崖峭壁上和古樹上，其中霍山石斛（Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng）為該地區(qū)特有種。隨著組培技術(shù)和栽培技術(shù)的發(fā)展，不同產(chǎn)區(qū)培育的石斛與霍山石斛在市場(chǎng)上一起流通銷售，造成了市場(chǎng)混亂。因此，不同種的石斛或者其他產(chǎn)地的霍山石斛與大別山產(chǎn)的霍山石斛在內(nèi)在成分上有何區(qū)別，需要進(jìn)行檢測(cè)確定，以利區(qū)分。用超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC） 選取霍山石斛中黃酮組分，建立其最優(yōu)檢測(cè)條件，為霍山石斛中黃酮組分的含量和分布差異，提供快速可行的檢測(cè)方法[1-3]。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

HH-4C 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器制造有限公司產(chǎn)品；DGX-90738-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海和呈儀器制造有限公司產(chǎn)品；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，中國上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FA1204N 型電子天平，滬制MC 精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品； FS200S-3 新型密封粉碎機(jī)，浙江溫州瑞安市百信藥機(jī)器械廠產(chǎn)品；超高效液相色譜儀，美國Agilent 公司產(chǎn)品；二極管陣列檢測(cè)器，美國Agilent 公司產(chǎn)品；圓底燒瓶；玻璃瓶；回流提取裝置。

1.2 材料和試劑

1.2.1 試驗(yàn)材料

霍山石斛，鑒定人：陳乃富教授。

1.2.2 試驗(yàn)試劑

甲醇（色譜純）、甲醇（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；乙腈（色譜純），上海星可生化有限公司提供；乙醇、實(shí)驗(yàn)室制雙蒸水、娃哈哈礦泉水（色譜用水）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

霍山石斛→烘干→粉碎→過60 目篩→回流提取→蒸發(fā)濃縮→微孔濾膜過濾→上樣→UPLC 檢測(cè)→圖譜分析。

1.3.2 霍山石斛黃酮組分的提取

取新鮮的霍山石斛鮮條洗凈，置于120 ℃烘箱中殺青2 min，再置于70 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量。使用粉碎機(jī)對(duì)烘干的霍山石斛進(jìn)行粉碎至粉末狀，過60 目篩，裝于密封袋保存，備用。精密稱取1.00 g霍山石斛粉末3 份，分別標(biāo)為供試品1 號(hào)、供試品2 號(hào)、供試品3 號(hào)，置于250 mL 圓底燒瓶中。供試品1 號(hào)中加入70% （V/V） 甲醇100 mL，供試品2 號(hào)中加入70%（V/V） 乙醇100 mL，供試品3 號(hào)中加入70%（V/V） 丙酮100 mL。70 ℃下水浴回流提取3 h，過濾，取濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，收集浸膏待用[4-7]。

1.3.3 霍山石斛黃酮組分的預(yù)處理

分別取全部浸膏，用100 mL 甲醇（色譜純） 溶解，并通過0.45 μm 微孔濾膜過濾，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液補(bǔ)充至100 mL 備用。

1.3.4 霍山石斛黃酮組分的UPLC 色譜條件優(yōu)化

進(jìn)行UPLC 檢測(cè)時(shí)，水（娃哈哈）、甲醇（色譜純） 和乙腈（色譜純） 均用0.22 μm 微孔濾膜的超濾儀器進(jìn)行超濾。檢測(cè)條件設(shè)為UPLC-C18柱，流速0.25 mL/min，檢測(cè)波長200～400 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5 μL，選用乙腈-甲酸水和甲醇-甲酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，梯度洗脫，甲醇（10%～90%，0～20 min） -0.3%甲酸水（90%～10%，0～20 min）[8-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的確立

試驗(yàn)比較了3 種不同的提取方式：冷凝回流提取法、索氏提取法和超聲波提取法。因冷凝回流法提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便，所以最終選用冷凝回流法作為霍山石斛黃酮組分的提取方法。將圓底燒瓶置于70 ℃水浴鍋內(nèi)回流提取3 次，每次1 h，合并提取液。過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)濾液進(jìn)行濃縮，濃縮至浸膏狀，用少量甲醇（色譜純） 溶解并通過0.45 μm 微孔濾膜過濾，再用0.22 μm 微孔濾膜過濾，收集濾液，用甲醇（色譜純） 補(bǔ)充至100 mL 備用。

2.2 檢測(cè)波長的確立

UPLC 檢測(cè)過程中，使用DAD 二極管陣列檢測(cè)器對(duì)黃酮組分進(jìn)行檢測(cè)，顯示在波長200～400 nm 處有出峰，收集出峰液，經(jīng)化學(xué)顯色法[11]證明均為黃酮類組分。在波長250 nm 處有最大出峰，但對(duì)圖譜分析，在波長230 nm 處出峰多，且各峰值總體較高，吸收強(qiáng)度好，區(qū)分度明顯，無雜峰影響，因此檢測(cè)波長選擇230 nm。

2.3 流動(dòng)相和洗脫時(shí)間的確立

采用甲醇（色譜純） 和乙腈（色譜純） 作為流動(dòng)相洗脫供試品。分別為A（0.3%甲酸水- 甲醇）流動(dòng)相體系和B（0.3%甲酸水-乙腈） 流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，A 流動(dòng)相體系洗脫分離效果較好。

A 流動(dòng)相體系洗脫供試品時(shí)間見表1，B 流動(dòng)相體系洗脫供試品時(shí)間見表2。

表1 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品時(shí)間

表2 B 流動(dòng)相體系洗脫供試品時(shí)間

2.4 指紋圖譜的分析

2.4.1 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)

A 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)的UPLC 指紋圖譜見圖1，A 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖見圖2。

由圖1 和圖2 可知，波長為230 nm 時(shí)，在0.606 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是1 000 mAU，在29.985 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是2 500 mAU。波長為250 nm 時(shí)，在0.606 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是500 mAU，在29.985 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第3 個(gè)組分峰的峰值是1 500 mAU。波長為260 nm 時(shí)，在0.606 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是550 mAU，在29.985 min時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是600 mAU。在200～300 nm 處基線平穩(wěn)無雜峰。

圖1 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)的UPLC 指紋圖譜

圖2 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖

2.4.2 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)

A 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)的UPLC 指紋圖譜見圖3，A 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖見圖4。

由圖3 和圖4 可知，波長為230 nm 時(shí)，在0.606 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是1 600 mAU，在30.005 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是200 mAU。波長為250 nm 時(shí)，在0.605 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是600 mAU，在30.005 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是200 mAU。波長為260 nm 時(shí)，在0.604 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是620 mAU，在30.005 min時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是100 mAU。在200～230 nm 的波長范圍內(nèi)基線漂移，230～270 nm 波長范圍內(nèi)基線平穩(wěn)，270～400 nm 有雜峰。

圖3 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)的UPLC 指紋圖譜

圖4 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖

2.4.3 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)

A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)的UPLC 指紋圖譜見圖5，A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖見圖6。

由圖5 和圖6 可知，波長為230 nm 時(shí)，在0.458 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是2 800 mAU，在31.624 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是500 mAU。波長為250 nm 時(shí)，在0.458 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是2 500 mAU，在31.624 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是300 mAU。波長為260 nm 時(shí)，在0.459 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是2 400 mAU，在31.624 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是100 mAU。在波長200～220 nm 無第2 個(gè)組分峰，波長大于300 nm 時(shí)，無第2 個(gè)組分峰。

圖5 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)的UPLC 指紋圖譜

圖6 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖

2.4.4 B 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)

B 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)的UPLC 指紋圖譜見圖7，A 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖見圖8。

由圖7 和圖8 可知，波長為230 nm 時(shí)，在0.468 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是2 600 mAU，在31.627 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是1 200 mAU。波長為250 nm 時(shí)，在0.468 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是1 280 mAU，在31.627 min時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是200 mAU。波長為260 nm 時(shí)，在0.429 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是1 300 mAU，在31.627 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是100 mAU。在200～230 nm 波長范圍內(nèi)，基線漂移嚴(yán)重，在230～400 nm 波長范圍內(nèi)，第2 個(gè)組分峰峰值低。

圖7 B 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)的UPLC 指紋圖譜

圖8 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品1 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖

2.4.5 B 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)

B 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)的UPLC 指紋圖譜見圖9，B 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖見圖10。

由圖9 和圖10 可知，波長為230 nm 時(shí)，在0.606 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是1 600 mAU，在30.005 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是200 mAU。波長為250 nm 時(shí)，在0.606 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是600 mAU，在30.005 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是200 mAU。波長為260 nm 時(shí)，在0.604 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是620 mAU，在30.005 min時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是100 mAU。在200～230 nm 波長范圍內(nèi)有雜峰，270～400 nm 范圍內(nèi)有雜峰。

圖9 B 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)的UPLC 指紋圖譜

圖10 B 流動(dòng)相體系洗脫供試品2 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖

2.4.6 B 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)

A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)的UPLC 指紋圖譜見圖11，A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖見圖12。

由圖11 和圖12 可知，波長為230 nm 時(shí)，在0.603 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是1 250 mAU，在30.008 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是100 mAU。波長為250 nm 時(shí)，在0.602 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是350 mAU，在30.008 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是150 mAU。波長為260 nm 時(shí)，在0.602 min 時(shí)出現(xiàn)了第1 個(gè)溶劑峰，第1 個(gè)溶劑峰的峰值是350 mAU，在30.608 min 時(shí)出現(xiàn)了第2 個(gè)組分峰，第2 個(gè)組分峰的峰值是100 mAU。在200～400 nm 波長范圍內(nèi)指紋圖譜基線漂移嚴(yán)重。

圖11 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)的UPLC 指紋圖譜

圖12 A 流動(dòng)相體系洗脫供試品3 號(hào)的UPLC 指紋圖譜3D 圖

3 結(jié)論

UPLC 分析見表3。

表3 UPLC 分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，使用冷凝回流法提取出黃酮組分，70%甲醇70 ℃下回流提取3 h 效果最佳，甲醇（色譜純） 作為流動(dòng)相洗脫供試品1 號(hào)，檢測(cè)波長在230 nm 處，UPLC 圖譜有2 個(gè)峰，2 個(gè)峰的收集液經(jīng)化學(xué)顯色法[11]證明均為黃酮類組分，且2 個(gè)峰峰值都較高，圖譜的基線平穩(wěn)。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的出峰時(shí)間也靠近30 min。

A 流動(dòng)相體系洗脫標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的UPLC 指紋圖譜見圖13，流動(dòng)相體系洗脫標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的UPLC 指紋圖譜3D 圖見圖14。

圖13 A 流動(dòng)相體系洗脫標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的UPLC 指紋圖譜

圖14 流動(dòng)相體系洗脫標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的UPLC 指紋圖譜3D 圖

綜上所述，研究建立了專屬性強(qiáng)、分離度高、穩(wěn)定性好的霍山石斛黃酮組分的UPLC 指紋圖譜分析鑒別方法，并確定霍山石斛黃酮組分最佳提取方法和洗脫檢測(cè)方法，霍山石斛黃酮組分UPLC 圖譜的建立條件的優(yōu)化有助于建立霍山石斛相似度評(píng)價(jià)的黃酮組分共有指紋圖譜，并用于霍山石斛的質(zhì)量鑒定和組效學(xué)關(guān)系探究，為其質(zhì)量控制及進(jìn)一步的藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。