宋素菲，趙冬梅，白鳳媛，孫 濤，鄭繼賢，徐秋玲，劉 濤

0 引 言

代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease, MAFLD)，曾用名非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)，是基于代謝功能障礙的肝細(xì)胞脂肪變性[1]，是目前最常見(jiàn)的慢性肝病[2]。研究表明MAFLD的全球患病率為25.24%[3]，中國(guó)MAFLD的流行率為29.6%[4],至2030年中國(guó)將成為全球MAFLD患病率增幅最大的國(guó)家[5]。MAFLD已成為一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題[6]，極大加重社會(huì)負(fù)擔(dān)。

代謝組學(xué)廣泛應(yīng)用于疾病的診斷、生物標(biāo)記的表達(dá)以及生理和病理生理過(guò)程的闡明[7]。本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution tandem mass spectrometry, UHPLC-QE-MS)非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步分析MAFLD模型大鼠血清脂質(zhì)代謝標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物12只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重均為(180±20)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0013。飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度和濕度分別保持在22℃和50%，自由飲食水。

1.1.2試劑甲醇(CAS 號(hào)67-56-1)、乙腈(CAS號(hào)75-05-8)、乙酸銨(CAS號(hào)631-61-8)、氨水(CAS號(hào)1336-21-6)，均購(gòu)自德國(guó)CNW 技術(shù)公司;超純水(屈臣氏)，油紅O染色液購(gòu)自珠海貝索生物公司。

1.1.3儀器超高效液相色譜儀、高分辨質(zhì)譜、離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，天平(德國(guó)Sartorius公司)，超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)。

1.2方法

1.2.1 MAFLD模型大鼠的建立12只SD雄性大鼠正常喂養(yǎng)1周，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組和模型組各6只；正常組予普通飼料喂養(yǎng)；模型組予高脂飼料喂養(yǎng),高脂飼料由20%豬油、4%白糖、 2%奶粉、1% 膽固醇以及73 %普通飼料配制。4周成功建立MAFLD模型。

1.2.2取材造模完成后，按4 mL/kg給予1%的戊巴比妥鈉深度麻醉大鼠，取其腹主動(dòng)脈血，靜置30 min，4 ℃ ,離心半徑15 cm、3000 r/min離心10 min，將上清液分裝至EP管，放置-80 ℃超低溫冰箱中保存。取肝左葉石蠟包埋、切片。

1.2.3肝組織油紅O染色準(zhǔn)備好肝組織冰凍切片，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下觀察。

1.2.4樣品的制備與提取4 ℃解凍血清樣品，取100 μL血清樣品和400 μL提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)]，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物)在EP管混合并渦旋30 s混勻，置于冰水浴中超聲10 min，-40 ℃低溫靜置1 h，4 ℃，離心半徑8.6 cm、12 000 r/min離心15 min，取等體積樣品上清和質(zhì)控(QC)樣品轉(zhuǎn)入U(xiǎn)HPLC/MS小瓶中上機(jī)檢測(cè)[8-11]。

1.2.5UHPLC-QE-MS條件色譜條件使用Agilent 1290 (Agilent Technologies)超高效液相色譜儀，通過(guò)Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm × 100 mm, 1.7μm)液相色譜柱對(duì)血清樣品進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為水相(25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水)，B相為乙腈。采用梯度洗脫方式進(jìn)行洗脫：0～0.5 min, 95% B; 0.5～7 min, 95%～65% B; 7～8 min, 65%～40% B; 8～9 min, 40% B; 9～9.1 min, 40%～95% B; 9.1～12 min, 95% B。流動(dòng)相流速：0.5 mL/min，柱溫30 ℃，樣品盤溫度4 ℃，進(jìn)樣量為3 μL[12]。

質(zhì)譜條件Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀通過(guò)控制軟件(Xcalibur，Thermo)采集數(shù)據(jù)。參數(shù)設(shè)置為鞘氣體的流速為50 Arb，輔助氣體的流速為10 Arb，毛細(xì)管的溫度320 ℃，F(xiàn)ull MS分辨率為60 000，MS/MS分辨率為7500，NCE模式下碰撞能量為10/30/60，電離源為電噴霧電離，噴霧電壓：3500V(+)，3200V(-)。

1.2.6數(shù)據(jù)提取和處理原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)為mzXML格式，導(dǎo)入自主編寫的R程序包(內(nèi)核為XCMS)進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分歸一化等處理，并且在BiotreeDB(V2.1)自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋[13]。使用SIMCA16.0.2軟件對(duì)最終的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7數(shù)據(jù)分析利用主成分分析(PCA)觀察組內(nèi)的總體分布和組間的分散程度，進(jìn)一步采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，過(guò)濾與分類變量不相關(guān)的正交變量，最大化組間代謝物的分離，投影值大于1的變量(VIP>1)被視為差異變量。同時(shí)為檢驗(yàn)OPLS-DA模型是否過(guò)度模擬和耦合以及評(píng)估模型的統(tǒng)計(jì)顯著性，對(duì)數(shù)據(jù)模型進(jìn)行多次置換檢驗(yàn)(n=200)驗(yàn)證。本研究篩選潛在差異代謝物的條件設(shè)置為VIP>1、P<0.05，將潛在差異代謝物并導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行血清脂質(zhì)富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 病理結(jié)果分析油紅O染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，界限清晰，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)紅色脂滴生成；模型組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)腫脹，細(xì)胞間界限模糊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量大小不等的紅色脂滴。見(jiàn)圖1。

圖 1 光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝臟脂肪沉積情況(油紅O染色 ×200)

2.2多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)UPLC-QE-MS進(jìn)行血清樣品的分離和數(shù)據(jù)采集，發(fā)現(xiàn)兩組樣品的血清代謝物相似，但含量存在一定差異。PCA結(jié)果顯示正常組和模型組的代謝物出現(xiàn)明顯分離的趨勢(shì), 表明兩組之間的代謝物存在差異，見(jiàn)圖2。OPLS-DA結(jié)果顯示正負(fù)離子模式的正常組和模型組代謝物各自分布于一側(cè)，完全分離，表明兩組存在明顯的差異，血清代謝輪廓發(fā)生改變。OPLS-DA模型驗(yàn)證結(jié)果顯示正負(fù)離子模式下的R2全部在Q2之上，且Q2的回歸直線與縱軸Y的截距分別為-0.4和-0.48，表明模型不存在過(guò)擬合的現(xiàn)象，模型的建立是有效可靠的，見(jiàn)圖3。

2.3血清潛在差異代謝物篩選正負(fù)離子模式下共篩選出743種潛在差異代謝物，圖4結(jié)果顯示有85個(gè)潛在差異代謝物的相對(duì)表達(dá)量明顯改變。與正常組相比，模型組共有11個(gè)代謝物表達(dá)增加，74個(gè)代謝物表達(dá)降低。

2.4潛在差異代謝物的脂質(zhì)富集分析將83個(gè)潛在差異代謝物代入Metaboanalyst5.0進(jìn)行脂類富集分析。共有43個(gè)脂質(zhì)差異代謝物的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生改變，富集到7類脂類物質(zhì)，其中脂肪酸類、固醇脂類和甘油磷脂類顯著富集(P<0.05),見(jiàn)圖5。與其相關(guān)的主要脂質(zhì)差異代謝物及倍數(shù)變化(Fold change,FC)為：①脂肪酸類:十八烷酸(FC=1.25)、二十碳五烯酸(FC=0.38)和異丁酸(FC=0.34)；②固醇脂類:異脫氧膽酸(FC=0.14)、脫氧膽酸(FC=0.44)和?；侨パ跄懰?FC=0.13)；③與甘油磷脂類主要脂質(zhì)差異代謝物為PC(22:2(13Z,16Z)/15:0)(FC=0.21)、PC(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z))(FC=0.22)以及LysoPC(16:1(9Z)/0:0)(FC=0.42)等。

a：正離子；b：負(fù)離子

圖 3 各組血清代謝組數(shù)據(jù)OPLS-DA 得分圖及模型驗(yàn)證圖

圖 4 各組差異代謝物層次聚類分析熱力圖

3 討 論

近年來(lái)，代謝組學(xué)以系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性、高靈敏度和高通量等特點(diǎn)，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，反映生物體的某一特定時(shí)期整體的代謝變化，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物等各學(xué)科領(lǐng)域。UHPLC分離時(shí)間不超過(guò)10min，QE-MS可以在正負(fù)模式之間快速切換，能夠使用單一方法以相對(duì)快速的周期時(shí)間進(jìn)行代謝物定性定量實(shí)驗(yàn)[14]。

肝是脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所,負(fù)責(zé)調(diào)控脂質(zhì)獲取和輸出之間的穩(wěn)態(tài)平衡。當(dāng)肝內(nèi)的脂質(zhì)生成大于利用時(shí),其動(dòng)態(tài)平衡被打破,脂滴在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，導(dǎo)致脂肪肝發(fā)生[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)MAFLD血清中脂肪酸類、固醇脂類、甘油磷脂類變化顯著。

脂肪酸：二十碳五烯酸是ω-3多不飽和脂肪酸，與代謝相關(guān)性疾病密切相關(guān)[17]。二十碳五烯酸能夠提高線粒體氧化能力，減少脂質(zhì)積聚，同時(shí)維持氧化還原平衡，避免氧化應(yīng)激[18]。研究表明二十碳五烯酸可以降低高碳水化合物飲食的嚙齒動(dòng)物的體重以及甘油三酯水平，緩解葡萄糖耐量受損、胰島素抵抗以及高胰島素血癥等不良癥狀[19]。異丁酸是短鏈飽和脂肪酸，短鏈脂肪酸調(diào)控肝臟中脂質(zhì)和能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子AMPK和PPAR家族基因的表達(dá)[20]。十八碳烯酸是不飽和脂肪酸，Notarnicola等[21]研究發(fā)現(xiàn)十八碳烯酸在MAFLD中呈高水平表達(dá)，且與肝細(xì)胞受損程度呈正比。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠的二十碳烯五烯酸、異丁酸等含量均明顯下降，2-羥基戊酸、十八碳烯酸表達(dá)上升，與脂肪酸的合成代謝失調(diào)相關(guān)，造成肝臟脂肪變性和脂肪儲(chǔ)積。

固醇脂類：異脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺去氧膽酸都是次級(jí)膽汁酸。“腸-肝循環(huán)”是膽汁酸代謝的重要途徑，而MAFLD的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損[22]。初級(jí)膽汁酸由肝內(nèi)膽固醇直接生成，在腸道內(nèi)依賴腸道菌群催化生成次級(jí)膽汁酸[23]。劉凱利等[24]通過(guò)提高M(jìn)AFLD大鼠體內(nèi)次級(jí)膽汁酸含量，激活法尼醇X受體信號(hào)表達(dá)，改善MAFLD大鼠肝臟的脂肪變性。此外，MAFLD的發(fā)展和次級(jí)膽汁酸與初級(jí)膽汁酸的比例相關(guān),He等[25]研究發(fā)現(xiàn)增加次級(jí)膽汁酸與初級(jí)膽汁酸的比值可以有效改善小鼠NASH小鼠的纖維化癥狀。本研究顯示模型組異脫氧膽酸、脫氧膽酸、?；侨パ跄懰岷烤档?，可能與MAFLD膽汁酸代謝失調(diào)有關(guān)。

甘油磷脂類：本研究發(fā)現(xiàn)模型組PC(16:0/16:0)、LysoPC(16:0)以及LysoPC(14:0/0:0)表達(dá)較正常組均降低。甘油磷脂(glycerophospholipid，GPL)是生物體最重要的生物膜成分。GPL與膽堿結(jié)合生成磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)。PC是細(xì)胞膜的組成成分,參與包裝和出口VLDL。PC生物合成減少，VLDL的合成和分泌受到抑制，肝臟新生脂肪的合成增加，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積[26]。PC在磷脂酶A2的催化下生成溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,LysoPCs)[27]，LysoPCs是構(gòu)成甘油磷脂最重要的成分，它的水平與MAFLD密切相關(guān)[28]。LysoPCs含量明顯下降，導(dǎo)致甘油磷脂含量下降，脂蛋白合成不足，肝臟合成的甘油三酯不能及時(shí)輸出肝外，導(dǎo)致肝脂肪變性和炎癥。

本研究采用UHPLC-QE-MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)高脂誘導(dǎo)MAFLD模型大鼠血清差異代謝物進(jìn)行脂類富集分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸類、固醇脂類、甘油磷脂類、有機(jī)酸、聚酮化合物、鞘脂類以及脂類和類脂分子7類脂類物質(zhì)的含量發(fā)生明顯改變，其中脂肪酸類、固醇脂類和甘油磷脂類改變最為顯著，表明在MAFLD的發(fā)生初始階段，肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪儲(chǔ)積可能與脂肪酸類、固醇脂類和甘油磷脂類含量變化密切相關(guān)。