溫曉婷,張?chǎng)?李景鵬,余麗霞,周利斌,楊福

(1.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130102；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院 近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

0 引 言

人工誘變將植物的突變頻率提高了約10～1 000倍[1]，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，在提升作物產(chǎn)量[2]、改良瓜果蔬菜[3]、改造花卉[4]以及微生物育種[5]等方面取得了巨大成果。利用各種誘變技術(shù)已培育出3 000多個(gè)植物品種，其中培育的水稻品種約占25%[6]。重離子束是一種新型誘變劑，相比于誘變育種中其他誘變?cè)矗仉x子具有較高的傳能線密度(Linear Energy Transfer，簡(jiǎn)稱LET)和較高的生物學(xué)效應(yīng)(Relative Biological Effectiveness，簡(jiǎn)稱RBE)，可以在較高的存活率下獲得較高的突變率，引起更為顯著的生物學(xué)效應(yīng)[7]。重離子束的種類一般包括碳(C)、氮(N)、氖(Ne)、氬(Ar)、鐵(Fe)、氦(He)和氧(O)。我國(guó)科學(xué)家余增亮等[8]利用離子束本身具有的質(zhì)量沉積、能量沉積、電荷沉積、離子濺射、局部刻蝕和通道作用，率先將低能離子束注入技術(shù)用于水稻等農(nóng)作物的品種改良，首創(chuàng)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的低能離子束注入和低能離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)[9]。至此，離子束注入技術(shù)作為一種新方法，一個(gè)新興的交叉學(xué)科—離子束生物工程學(xué)問(wèn)世，并立即受到國(guó)內(nèi)外專家的關(guān)注。日本在重離子束輻射水稻誘變技術(shù)研發(fā)及應(yīng)用領(lǐng)域走在世界的前列，把重離子束輻射生物技術(shù)列為“人類前沿科學(xué)計(jì)劃”，成為21世紀(jì)生命科學(xué)研究的支撐技術(shù)之一[10]。重離子束主要分為能量大于MeV的高能重離子束和能量在KeV范圍內(nèi)的低能重離子束[11]。我國(guó)最初關(guān)注低能重離子束輻射對(duì)植物的影響[8]，直到近幾年才將高能重離子束輻射誘變技術(shù)應(yīng)用到農(nóng)作物育種方面，而日本這方面研究的較早，并在水稻方面開(kāi)展了研究，培育出了水稻新品種。本文簡(jiǎn)述了近些年國(guó)內(nèi)外高能重離子束輻射誘變技術(shù)在水稻育種方面的研究，重點(diǎn)介紹了高能重離子束輻射誘變水稻的原理及特點(diǎn)，輻射誘變引起的水稻各性狀的改變及水稻新品種的培育，以期為高能離子束在水稻育種中進(jìn)一步應(yīng)用提供有價(jià)值的參考。

1 高能重離子束輻射誘變水稻的分子生物學(xué)特點(diǎn)

高能重離子束是由回旋加速器產(chǎn)生的加速離子沿著粒子路徑在局部區(qū)域密集形成的高效能量沉積[12]，具有更高的傳能線密度，對(duì)目標(biāo)生物的DNA及蛋白質(zhì)等分子有更大的損傷。研究表明LET值越高，會(huì)誘導(dǎo)越復(fù)雜的雙鏈斷裂(Double strand break,DSB)[13]。DSB的修復(fù)途徑主要有兩種：同源重組(Homologous recombination,HR)和非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)[14]，NHEJ為C離子輻射植物DNA損傷的主要修復(fù)途徑[15]，可在各個(gè)細(xì)胞周期發(fā)生，該修復(fù)途徑不依賴于同源基因，因此更容易導(dǎo)致復(fù)雜的基因突變[16]。

射線與高能重離子束的誘變?cè)硐嗨疲际菍⒖焖龠\(yùn)動(dòng)的帶電粒子作用于目標(biāo)植物，但由于加速粒子沉積方式不同，產(chǎn)生了不同的誘變效果[17]。已有研究表明高能重離子束與射線的誘變效果存在顯著差異(表1)。Li等[18]通過(guò)比較誘變水稻的全基因組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，γ-射線傾向于誘導(dǎo)小的突變，而C離子束主要誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)變異(Structural variant,SVs)，后者的遺傳變異類型是遺傳多樣性的來(lái)源[19]。Yang等[20]通過(guò)比較γ-射線與C離子束對(duì)水稻的誘變特性發(fā)現(xiàn)，γ-射線誘導(dǎo)更多的多核苷酸變異(Multiple nucleotide variant,MNV)，而離子束更多的誘導(dǎo)小的插入與缺失和大片段缺失，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SVs。產(chǎn)生以上結(jié)果差異的可能原因?yàn)椋菏褂玫牟牧喜煌琜21]、輻射劑量不同[22]、測(cè)序方法和數(shù)據(jù)分析手段的不同[19]。因此，高能重離子束能產(chǎn)生更多的基因組變異類型，有更高的相對(duì)生物學(xué)效率、更寬的突變譜[23]以及更高的誘變效率[24]。

表1 高能重離子束輻射與其他物理輻射的對(duì)比

化學(xué)誘變中常用的誘變劑為烷化劑，可將堿基烷基化，發(fā)生嘌呤與嘧啶的轉(zhuǎn)化以及置換突變[30]，主要引起單核苷酸變異(Single nucleotide variant,SNV)[31]，而高能重離子束可誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的基因變異類型和更高的染色體畸變率[22]。Oono等[31]對(duì)水稻品種日本晴的突變體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，高能重離子束主要誘導(dǎo)GC>AT的轉(zhuǎn)換，占38%，其次為AT>GC，占33%，而甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,EMS)優(yōu)先烷基化鳥(niǎo)嘌呤(G)的殘基，主要誘導(dǎo)GC>AT的轉(zhuǎn)換，為93%[32]，且在Phe、Ile、Lys、Asn和Tyr的非同義位置缺少G和C，只產(chǎn)生26種氨基酸轉(zhuǎn)換類型[33]，而離子束輻射不存在特異性，可誘導(dǎo)170種氨基酸轉(zhuǎn)換類型[31]。Kazama等[14]比較了重離子束和EMS的誘變效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)重離子束主要誘導(dǎo)大片段的缺失與重排，EMS誘導(dǎo)更頻繁的滲漏突變。相較于EMS，高能重離子束有更強(qiáng)的穿透力，可更快誘導(dǎo)突變發(fā)生，并且化學(xué)誘變劑多為有毒試劑，對(duì)人體造成極大危害[17]。

低能重離子束單核能僅KeV，對(duì)植物組織的穿透深度極淺[34]，可對(duì)靶向組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁產(chǎn)生刻蝕作用，使后續(xù)離子束沿著刻蝕通道攻擊遺傳物質(zhì)[35]，而高能重離子束的單核能在MeV以上，可穿透植物組織深度達(dá)幾厘米[36]，直接作用于植物遺傳物質(zhì)，對(duì)植物基因的物理?yè)p傷更大，產(chǎn)生更豐富的基因組變異類型[37]。

因此，高能離子束較射線輻射、化學(xué)誘變劑及低能重離子束的輻射效果更好，可以產(chǎn)生各種類型的遺傳變異，以及更廣泛的突變表型。可見(jiàn)，高能重離子束在水稻育種中有很大的應(yīng)用潛力。

2 用于誘變水稻的高能重離子束種類、輻射劑量及受體材料的選擇

2.1 高能重離子束的選擇

離子束的種類很多，選擇合適的離子束對(duì)于水稻育種是非常重要的。已有研究證實(shí)不同種類的重離子束產(chǎn)生的誘變效果不同。Kazama等[14]對(duì)不同誘變處理的擬南芥進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)Ar離子束主要誘導(dǎo)染色體重排，C離子束主要誘導(dǎo)單堿基替換(Single base substitutions,SBS)和小片段的插入與缺失，產(chǎn)生差異的原因可能為Ar離子束與C離子束誘導(dǎo)的基因的修復(fù)途徑不同。Sjahril等[38]發(fā)現(xiàn)C離子束輻射產(chǎn)生更多的突變植株類型，而Ar離子束輻射的突變體后代發(fā)芽率更高。并且有研究表明C離子束輻射的相對(duì)幼苗存活率高于Ar和Fe[39]。不同的離子特性決定了LET的值，LET越高產(chǎn)生的DNA損傷越多，在需要高LET時(shí)，應(yīng)選擇較重、帶高電荷且速度較慢的離子[11]。

2.2 最佳輻射劑量的選擇

高能重離子束的不同輻射劑量有不同的誘變效果，有研究發(fā)現(xiàn)高劑量輻射抑制生長(zhǎng)，而低劑量輻射可促進(jìn)生長(zhǎng)[40]。Zhao等[41]利用不同劑量的碳(C)離子束輻射水稻，發(fā)現(xiàn)低劑量的重離子束主要誘導(dǎo)CG位點(diǎn)的高甲基化，可能激活生物的代謝、合成機(jī)制；高劑量的重離子束誘導(dǎo)CG位點(diǎn)的低甲基化，可能誘導(dǎo)植物的抗逆性。因此需選用最佳輻射劑量以獲得最大效果的突變。Yamaguchi等[29]發(fā)現(xiàn)水稻種子的存活率與輻射劑量存在“肩部”效應(yīng)曲線，通過(guò)比較輻射水稻的突變率與致死率，發(fā)現(xiàn)肩部劑量是不改變遺傳背景而獲得有用突變體的標(biāo)準(zhǔn)；并表明220 MeV和320 MeV的C離子束以及100 MeV的He離子束誘變水稻的肩部劑量分別為20 Gy、60-80 Gy以及150 Gy[17]。而一些學(xué)者認(rèn)為存活下來(lái)的植株有更大的變異幅度，將半致死率作為最佳輻射劑量[42]。最佳輻射劑量的選擇需依據(jù)突變體的萌發(fā)、早期生長(zhǎng)以及田間出苗等性狀指標(biāo)以及染色體變異和染色體分裂等細(xì)胞學(xué)形態(tài)來(lái)衡量[43]。

2.3 輻射受體材料的選擇

不同發(fā)育階段的組織對(duì)離子束的敏感性不同，一般選用的靶向材料為花藥、愈傷組織，發(fā)育中的胚和莖節(jié)、吸漲后的種子、幼芽以及干燥的種子[44]。水稻中最常用的誘變組織是種子，種子含水量直接影響其輻射敏感性，吸水種子的敏感性高于干燥種子，在125 MeV·u-1的C離子束輻射下，干種子的最佳輻射劑量是150 Gy，而吸水種子的最佳輻射劑量為20 Gy[45]。含12%～15%水分的種子有更好的誘變效果，可避免氧的增效作用，復(fù)合輻射產(chǎn)生的自由基，降低對(duì)種子的損傷，提高種子存活率[46]。

3 高能重離子束輻射誘變水稻重要性狀基因功能分析

利用高能重離子束已經(jīng)產(chǎn)生了許多具有不同優(yōu)良性狀的突變體，不僅豐富了種質(zhì)資源庫(kù)，還為進(jìn)一步探究了水稻的分子與生理機(jī)制提供基礎(chǔ)。

3.1 水稻重要農(nóng)藝性狀基因功能研究

水稻農(nóng)藝性狀的改良是提高作物產(chǎn)量的重要手段，許多研究挖掘了產(chǎn)量與性狀之間的關(guān)系，在水稻中產(chǎn)量由株高、生育期、分蘗能力、穗長(zhǎng)、粒型、結(jié)實(shí)率和每穗粒數(shù)等間接性狀以及每株穗數(shù)，每穗飽滿粒數(shù)和千粒重等直接性狀決定[47]。利用高能重離子束可對(duì)水稻的多種農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響(表2)。

表2 高能重離子束誘變水稻產(chǎn)生的表型改變

水稻的矮化增加了水稻的抗倒伏性，也更多的將光合作用產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到生殖生長(zhǎng)中，提高水稻產(chǎn)量[48]。莊楚雄等[49]利用Ar離子束輻射水稻，產(chǎn)生了由隱性基因控制的半矮桿突變表型，初步定位發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)與Semi-dwarfgene(Sd-1)不連鎖，對(duì)兩個(gè)突變株系A(chǔ)r-10和104進(jìn)行限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP)比對(duì)，推測(cè)突變位點(diǎn)位于突變熱點(diǎn)附近。Oono等[31]篩選出了由碳(C)離子束誘變產(chǎn)生的矮化突變體3098和885，利用全外顯子測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，3098突變體在Guaninenucleotide-bindingProteinAlpha-1subunit(GPA1)上存在128 kp的缺失，表現(xiàn)為Daikoku矮化(D1)特征，并推測(cè)該突變?yōu)殡s合突變，在突變體885中并沒(méi)有檢測(cè)到相關(guān)基因的突變。

水稻抽穗期是水稻重要的農(nóng)藝性狀之一，決定了品種種植地區(qū)及季節(jié)適應(yīng)性[50]。Ichitani等[51]利用220 MeV的C離子束誘變粳稻品種Taichung 65產(chǎn)生了晚抽穗突變體KGM26、KGM27，分別由純合隱性基因FLOWERINGTIME1(FLT1)和FLOWERINGTIME1(FLT2)控制。連鎖分析發(fā)現(xiàn)FLT1位于8號(hào)染色體的短臂上，推測(cè)與Earlyheadingdate3(Ehd3)在同一位點(diǎn)上；FLT2位于9號(hào)染色體著絲粒附近，是一個(gè)新的基因。Oono等[31]利用高能C離子束產(chǎn)生了早抽穗突變體786-5、IRB3517-3和IRB3790-2，早抽穗突變體786-5在M3代中純合，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)突變體的PHYTOCHROMEB基因上存在一個(gè)5bp的缺失；在IRB3517-3中與早抽穗相關(guān)的基因定位在3號(hào)染色體上，存在33.6 kb的缺失，并推測(cè)HEADINGDATE16(HD16)是假定的候選突變基因；IRB3790-2在M5代獲得純合突變株系，并在6號(hào)染色體上檢測(cè)到染色體倒位(Inversions,INV)，一個(gè)INV突變位點(diǎn)位于HEADINGDATE1(HD1)基因的第二外顯子上，該基因編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)HEADINGDATE3(HD3)基因的表達(dá)。

葉片是水稻光合作用的主要場(chǎng)所，葉片損傷也會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失[52]。Peng等[53]利用C離子束輻射產(chǎn)生了葉片異常萎蔫的突變表型，通過(guò)混合群體分離分析(Bulked segregant analysis,BSA)、分子標(biāo)記連鎖分析和MutMap分析將突變位點(diǎn)位于11號(hào)染色體上的著絲粒區(qū)域，約1 030 kb之間，同一位點(diǎn)上的6個(gè)基因發(fā)生了非同義突變，結(jié)合基因表達(dá)水平推測(cè)LOC_Os11g19810為m3基因，編碼含有PWWP結(jié)構(gòu)域的蛋白。Yamatani等[54]在C離子束輻射后代中篩選出E型持綠突變體delayedyellowing1-1(dye1-1)，精細(xì)定位表明DYE1編碼PSI天線復(fù)合體的亞單位—Lhca4，其第二外顯子上存在單堿基替換，使蛋白穩(wěn)定性降低。蛋白質(zhì)電泳分析顯示突變體的PSI-LHCI超復(fù)合體中存在嚴(yán)重缺陷，但LHCII的含量顯著上升，為研究LHCI與LHCII之間的相互作用提供了材料。Maekawa等[55]利用高能C離子束在穩(wěn)定的黃葉突變體中誘導(dǎo)產(chǎn)生了雜色黃葉突變體，且該突變體可與分離的恢復(fù)體共遺傳，通過(guò)分析推測(cè)穩(wěn)定的黃葉表型是由非自主性轉(zhuǎn)座子引起的，由離子束輻射產(chǎn)生的染色體斷裂而導(dǎo)致的低甲基化激活了沉默的自主轉(zhuǎn)座子。

通過(guò)離子束誘變產(chǎn)生了不同農(nóng)藝性狀的突變，利用正向遺傳學(xué)手段將突變表型與基因建立聯(lián)系，對(duì)挖掘水稻基因以及闡明誘變本質(zhì)具有重要的作用。

3.2 水稻主要品質(zhì)性狀的基因功能研究

隨著人們生活水平的提高，對(duì)食物的需求不僅僅局限于飽腹這一方面，粒型、淀粉含量、安全性作為衡量水稻品質(zhì)性狀的重要指標(biāo)，挖掘更多調(diào)控基因，解析其調(diào)控機(jī)制也成為近年來(lái)的熱點(diǎn)方向。利用高能重離子束誘變也可以對(duì)水稻的品質(zhì)性狀進(jìn)行改良，從而滿足人們對(duì)高品質(zhì)水稻的追求。

不同地區(qū)對(duì)水稻粒型與口感的需求不同[56]。Morita等[57]利用高能離子輻射粳稻品種日本晴，產(chǎn)生了只有籽粒長(zhǎng)度增加的longgrain1(lin1)突變體，對(duì)F2代進(jìn)行表型關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，在Os06g0675200基因(LIN1)上存在1bp的缺失，產(chǎn)生了長(zhǎng)粒突變體表型，并發(fā)現(xiàn)LIN1基因在種子植物中廣泛同源，有望通過(guò)基因滲入或CRISPR編輯技術(shù)改變粒型。程維民等[65]利用高能C離子束輻射武運(yùn)粳7號(hào)，產(chǎn)生了直鏈淀粉及蛋白含量變異的突變體，其變異系數(shù)分別為13.7%和12.8%，并將品質(zhì)性狀與農(nóng)藝性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉含量以及蛋白質(zhì)含量與水稻表型密切相關(guān)，對(duì)品種的選育有指導(dǎo)意義。

水稻中有毒物質(zhì)的積累不僅阻礙水稻的正常生長(zhǎng)，也危害人體健康。Ishikawa等[66]利用高能C離子束輻射日本水稻品種越光，得到了鎘(Cd)含量極低的突變體(lcd-kmt1，lcd-kmt2，lcd-kmt3)，對(duì)雜交突變體后代進(jìn)行連鎖分析和候選基因的圖位克隆發(fā)現(xiàn)，突變基因位于7號(hào)染色體上，編碼假定的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsNRAMP5，控制Cd離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，并開(kāi)發(fā)了檢測(cè)OsNRAMP5多態(tài)性的DNA標(biāo)記，有望通過(guò)標(biāo)記輔助選擇將該基因轉(zhuǎn)移到其它水稻品種中。Ishikawa等[67]利用高能C離子束輻射越光，得到了銫(Cs)含量是野生型一半的突變體(lcs1)，對(duì)雜交品種進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Locus,QTL)分析，與放射性元素降低相關(guān)的主效QTL定位于6號(hào)染色體上，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)是編碼SALT OVERLY SENSITIVE 2(OsSOS2)蛋白的基因發(fā)生了缺失，并且發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶lcs1與lcd-kmt2等位基因的水稻株系，有望培育具有低鎘且低銫(Cs)含量的水稻新品種。

利用高能重離子束輻射水稻能產(chǎn)生較寬的突變譜[17]，可誘導(dǎo)產(chǎn)生不同品質(zhì)性狀的突變，有利于快速篩選出有利突變進(jìn)而出培育優(yōu)質(zhì)水稻品種，且相較于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，輻射誘變所產(chǎn)生的水稻新品種更容易被人們接受。

3.3 水稻抗逆性的基因功能研究

在自然條件下，水稻會(huì)遭受包括病蟲(chóng)害、土壤鹽堿、干旱及高溫低溫等一系列的生物脅迫和非生物脅迫，提高水稻對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)性是改良水稻的一項(xiàng)重要研究。

開(kāi)發(fā)抗病水稻品種、研究抗病分子機(jī)制對(duì)提高水稻產(chǎn)量有非常重要的價(jià)值，利用高能重離子束輻射誘變技術(shù)培育出許多抗病水稻新品種[2,45,62]，但沒(méi)有進(jìn)一步的探索。而對(duì)低能重離子束誘變產(chǎn)生的抗稻瘟病突變體目前已經(jīng)進(jìn)行了較深入的研究。DNA指紋圖譜分析突變體存在多態(tài)性片段，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該片段與假病斑基因(Spl11)相關(guān)[68]。Xu等[69]利用低能N離子束(25 KeV)與中能Ne離子束(80 MeV)誘變得到的spl29、spl30、spl31和spl33突變體，這些突變體由單隱形基因控制，通過(guò)基因定位發(fā)現(xiàn)spl29和spl31為spl1的等位基因，而spl30與spl33可能為新的抗病基因，該研究為創(chuàng)建突變體文庫(kù)提供了寶貴的材料。

鹽堿和干旱是限制水稻生產(chǎn)的重要因素，培育耐鹽、耐旱水稻品種可減輕土地資源浪費(fèi)及種植區(qū)缺水造成的負(fù)面影響。Hasan等[62]利用C離子束輻射MR219，篩選出22株耐鹽和35株耐旱突變體，在M3代中發(fā)現(xiàn)了純合突變系，為研究水稻耐鹽、耐旱的生理機(jī)制提供了優(yōu)良種質(zhì)資源。Zhang等[70]利用C離子束輻射通禾899，產(chǎn)生了耐鹽堿突變品系東稻122。Ichida等[71]利用C離子束輻射日本晴，篩選出了耐鹽的水稻品系6-99，14-45和18-36。對(duì)此類突變系的調(diào)控基因及機(jī)制分析并沒(méi)有進(jìn)行深入研究，可能原因是植物的耐旱、耐鹽性是由多基因控制的，且受外界環(huán)境影響很大[72]。利用離子束誘變產(chǎn)生的此類水稻新品種，對(duì)于鹽堿地的開(kāi)發(fā)具有非常重要的作用。

溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)量造成負(fù)面影響，溫度過(guò)高會(huì)增加水稻堊白率，影響水稻外觀，進(jìn)而影響水稻的品質(zhì)性狀。Tabassum等[73]從高能C離子束輻射后代中分離出在高溫下水稻堊白率極高的溫敏粉狀胚乳(flo11-2)突變體，進(jìn)行全外顯子測(cè)序及基因檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，編碼cpHSP70-2的基因存在A>T的替換，并通過(guò)回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。flo11-2突變體是作為研究高溫對(duì)水稻影響的有用模型。水稻是冷敏感作物，溫度過(guò)低阻礙水稻生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致死亡[74]。Morita等[75]在C離子束誘變的水稻突變后代群體中發(fā)現(xiàn)了對(duì)低溫敏感的突變體csv1，在低溫下表現(xiàn)褪綠表型，進(jìn)行圖位克隆發(fā)現(xiàn)CSV1基因定位于5號(hào)染色體上，編碼假定的FAD/NAD(P)氧化還原蛋白，并且在多種植物中發(fā)現(xiàn)了CSV1同源基因，進(jìn)一步的補(bǔ)充了水稻的耐冷機(jī)制。

分析水稻突變體對(duì)于挖掘水稻基因功能具有重要的作用，高能重離子束誘變創(chuàng)制了新基因，可通過(guò)基因編輯技術(shù)應(yīng)用新基因，創(chuàng)制新的突變品種。

3.4 對(duì)其它性狀基因功能分析

遠(yuǎn)緣雜交不親和嚴(yán)重阻礙了優(yōu)良種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)，打破遠(yuǎn)緣雜交不親和性對(duì)于優(yōu)良水稻品種的研發(fā)具有非常重要的意義。Koide等[76]通過(guò)對(duì)亞洲栽培稻(Acc108)和非洲栽培稻(Acc108S1)雜交得到的種子進(jìn)行離子束誘變，得到Acc108S1M突變體，該突變體有極高的花粉育性，通過(guò)分析突變區(qū)域以及序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)突變體在S1基因座中存在5 bp的缺失，命名為SSPmut，并沒(méi)有在Acc108中發(fā)現(xiàn)同源基因，且該基因鄰近OgTPR1基因，兩基因在配子發(fā)育中共表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因以及雜交分析表明SSP-gla與其他因子在S1基因座上誘導(dǎo)不育。因此，可以通過(guò)高能重離子輻射誘變技術(shù)創(chuàng)建中性等位基因來(lái)克服遠(yuǎn)緣雜交不育性。

4 高能重離子束輻射在水稻新品種培育上的應(yīng)用

4.1 水稻輻射親本材料的選擇

一般選擇輻射敏感性強(qiáng)，綜合性狀良好，雜合基因型優(yōu)良的水稻作為親本材料。有研究表明不同水稻品種的輻射敏感性不同，輻射敏感的植株有更高的突變頻率[77]，粳稻的敏感性大于秈稻，但氣候型品種間的差異不明顯[78]；綜合性狀優(yōu)良，缺陷性狀極少的品種更容易進(jìn)行篩選，更易獲得成功[79]；輻射具有優(yōu)良雜合基因型的親本材料可以增加染色體的交換率，產(chǎn)生超親世代，提高植株的變異頻率，擴(kuò)大突變范圍[80]。

4.2 輻射后代突變體的篩選

針對(duì)不同的突變類型需選用合適的篩選手段。水稻品種的選育分為直接選育和間接選育。直接選育即對(duì)水稻的突變性狀直接進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，適用于對(duì)水稻株高、分蘗、熟期、粒型等可見(jiàn)性狀的篩選，直接選育是誘變育種中最基本也是最常用的突變篩選手段。間接選育即需借助一些手段來(lái)識(shí)別突變體。如利用基于同步輻射的傅里葉轉(zhuǎn)換紅外吸收光譜(Synchrotron radiation-based Fourier transform infrared,SR-FTIR)[81]來(lái)檢測(cè)拋光大米中的碳水化合物及蛋白質(zhì)的含量，利用凱氏定氮法[65]來(lái)檢測(cè)水稻中的蛋白質(zhì)含量以及利用毛細(xì)管耦合質(zhì)譜儀(GE-MS)篩選低草酸鹽含量的水稻突變體[82]；有些需要將突變體置于一定環(huán)境中才表現(xiàn)突變性狀，如對(duì)抗病，低溫及耐鹽堿等突變體的篩選；對(duì)突變體的分子篩選可以闡明突變的本質(zhì)，解決基因表達(dá)不充分問(wèn)題，如定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)(Targeted Induced Local Lesions in Genomes,TILLING)可直接在基因水平上對(duì)重離子束誘變后代進(jìn)行篩選[17,83]，還可通過(guò)微陣列技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)離子束誘變水稻突變體中miRNA的表達(dá)[84]，此外，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將會(huì)極大的提高了水稻選育的效率[66]。對(duì)水稻突變性狀的選擇要避免“木桶效應(yīng)”，應(yīng)選取綜合性狀優(yōu)良的水稻突變體。

4.3 輻射誘變培育的水稻品種

由高能重離子束誘變技術(shù)結(jié)合不同的選育手段已經(jīng)培育許多水稻新品種。孟加拉國(guó)原子農(nóng)業(yè)研究所利用高能C離子束輻射技術(shù)培育出矮桿、生育期短、產(chǎn)量高且耐旱的品種Binadhan-14和Binadhan-19，適宜種植于孟加拉國(guó)干旱多發(fā)的地區(qū)[85]。Ishikawa等[67]利用高能C離子束輻射日本水稻品種越光，篩選及培育得到了Cd含量極低的品種Koshihikari Kan No.1，并已經(jīng)在日本有了廣泛的種植。湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用高能重離子束誘變產(chǎn)生了低鎘含量的蓮兩優(yōu)1號(hào)，蓮兩優(yōu)100以及稻韶香100的雜交稻組合品種[86]。馬來(lái)西亞普特拉大學(xué)利用高能重離子束對(duì)MR219的輻射產(chǎn)生了有益于糖尿病患者食用的水稻ML3與ML30品種[87]。近些年，研究者所在課題組一直致力于由高能C離子束誘變產(chǎn)生水稻新突變體的研究，得到了耐鹽堿品種東稻122、東稻211、東稻812和優(yōu)質(zhì)米種東稻862，都已通過(guò)國(guó)家審定，并已累積推廣35 000 hm2。

5 存在的問(wèn)題及展望

高能重離子束誘變產(chǎn)生新的水稻突變品種，創(chuàng)制了新的種質(zhì)資源，豐富了水稻突變體庫(kù)，對(duì)于水稻的基礎(chǔ)研究以及品種改良具有非常重要的作用，但仍有亟待解決的問(wèn)題：

5.1 高能重離子束的定點(diǎn)突變

高能重離子束存在殺傷力廣、破壞性大的物理特性，產(chǎn)生了復(fù)雜的基因組變異類型，相較于精準(zhǔn)突變，誘變產(chǎn)生的突變表型更加隨機(jī)，難以得到只包含目標(biāo)性狀的突變，因此開(kāi)發(fā)應(yīng)用于水稻育種中的離子束定向誘變技術(shù)，對(duì)獲得理想突變體有非常重要的意義。

5.2 輻射誘變機(jī)理的研究

利用高能重離子束已經(jīng)產(chǎn)生了各種類型的水稻突變體，但對(duì)很多突變體的研究?jī)H僅局限于表型和現(xiàn)象的描述，并沒(méi)有進(jìn)行更加深入的探討。對(duì)水稻突變本質(zhì)進(jìn)行深入研究，不僅可以將其應(yīng)用于水稻育種中，還可以揭示雙子葉植物的分子調(diào)控機(jī)制。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及分析儀器的改進(jìn)，對(duì)于水稻分子生物學(xué)及生理生化的研究提供了基礎(chǔ)平臺(tái)。

5.3 精準(zhǔn)測(cè)序結(jié)果

為了探尋突變本質(zhì)，對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行了篩選，但由于測(cè)序深度、測(cè)序手段與數(shù)據(jù)分析工具的不同，使得到突變結(jié)果有很大的差別。測(cè)序偏差的存在，影響了數(shù)據(jù)挖掘的準(zhǔn)確性，因此就需要研究出新的方法來(lái)改變這一缺陷，且不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)挖掘流程存在差異，因此很難比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但是隨著測(cè)序技術(shù)以及分析技術(shù)的不斷發(fā)展，一旦突破了這些瓶頸，對(duì)于水稻突變體的研究將會(huì)有巨大突破。

現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入到育種的黃金階段，中央一號(hào)文件的正式公布，為育種工作提供了政策支持[88]。高能重離子束在水稻育種中的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了大量具有優(yōu)良性狀的突變體，擴(kuò)充了水稻突變體庫(kù)，并有利于未來(lái)超級(jí)稻的開(kāi)發(fā)。近年來(lái)對(duì)水稻突變體的研究開(kāi)始聚焦到分子水平，對(duì)控制表型的基因進(jìn)行了精細(xì)定位，開(kāi)發(fā)遺傳標(biāo)記，并應(yīng)用于水稻育種中。誘變育種與分子育種的結(jié)合大大縮短育種年限，提高了育種的定向性和效率，且隨著測(cè)序技術(shù)及分子育種技術(shù)的不斷發(fā)展，兩種育種技術(shù)的結(jié)合將會(huì)出現(xiàn)“1+1>2”的效果。