宋露，唐佳琦，田曉杰，卜慶云

(1.中國科學院 東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；2.中國科學院大學，北京 100049)

0 引 言

水稻是重要的糧食作物，世界上一半以上人口都以其為主食。而水稻的產量與育性密切相關，其雄性生殖器官正常的形態(tài)結構和發(fā)育是水稻繁衍過程的關鍵保障[1]。水稻雄性不育(MS，male sterility)是雄性器官發(fā)育異常，花粉不具有受精活力，但雌性器官發(fā)育和功能均正常的現象[2]。

在水稻雄性生殖器官花藥的結構中，花藥壁由外到內分別由表皮層、藥室內壁、中層和絨氈層這4層不同的細胞組成。絨氈層位于花藥壁的最內層，直接與小孢子接觸，絨氈層的正常發(fā)育能保障花粉母細胞減數分裂周期正常完成，在發(fā)育后期它分泌胼胝質降解酶來分解胼胝質，使小孢子釋放出來，并為花粉粒的進一步成熟提供營養(yǎng)，絨氈層細胞向雄配子體運輸物資的直接通道是烏氏體[3]。絨氈層的發(fā)育是一個連續(xù)的過程，主要分為2個階段：分化形成[4]和退化降解[5]。絨氈層在小孢子母細胞形成期初步形成，由次級壁細胞經過兩次分裂后形成于花藥壁的最內層[4]；從小孢子母細胞減數分裂初期至小孢子早期，絨氈層細胞質顏色開始逐漸加深，并出現細胞凋亡信號，在小孢子中期絨氈層開始退化降解，最終在成熟花粉期完全消失[5]。調控絨氈層發(fā)育的基因大多編碼轉錄因子，通過直接或間接調控絨氈層的分化形成或退化降解，進而使絨氈層的生理功能出現異常，最終導致小孢子發(fā)育受阻，引起雄性不育。因此，解析相關轉錄因子的功能是了解水稻絨氈層發(fā)育調控的重要部分。

研究發(fā)現，bHLH(basic helix-loop-helix)轉錄因子是調控水稻絨氈層發(fā)育過程中重要的轉錄因子[6]。其中，bHLH類轉錄因子UDT1(UNDEVELOPEDTAPETUM1)是調控水稻絨氈層早期發(fā)育的關鍵基因，它參與次生壁細胞向成熟絨氈層的分化過程。在減數分裂前，突變體udt1-1的花藥壁和小孢子母細胞發(fā)育相對正常，但減數分裂期絨氈層異?？张莼?，小孢子不能生成，絨氈層細胞降解延遲，最終導致無花粉型雄性不育，且無法結出可育籽粒[7]。另一編碼bHLH轉錄因子的TDR(TAPETUMDEGENERATIONRETARDATION)通過正向觸發(fā)絨氈層細胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)來調控水稻絨氈層的發(fā)育和降解，突變體tdr表現為絨氈層和中層PCD滯后以及花粉壁的缺陷，進而導致雄性完全不育[9]。UDT1和TDR都通過調控絨氈層標記基因(OsC4、OsC6和OsCP1)的表達來調節(jié)絨氈層的發(fā)育和降解，這些基因在udt1和tdr突變體中顯著下調[8-9]。EAT1(ETERNALTAPETUM1)同樣是bHLH類轉錄因子，EAT1可以在轉錄水平調控天冬氨酸蛋白酶(Aspartic protease，ASP)的表達，并可與TDR相互作用，作用于TDR的下游。eat1-1突變體的絨氈層細胞增厚，烏氏體形狀不規(guī)則，花藥發(fā)育和小孢子形成過程異常終止，造成雄性不育[10]。編碼bHLH類轉錄因子的TIP2(TDRINTERACTINGPROTEIN2)的突變體tip2影響了花藥的早期發(fā)育，其花藥壁內藥室內壁、中層、絨氈層三層細胞不能正常分化形成，后期中層和絨氈層PCD中斷，導致小孢子母細胞發(fā)育停滯，造成雄性完全不育[11-12]。這些研究結果表明，bHLH類轉錄因子影響水稻絨氈層的發(fā)育，對水稻花粉的育性產生了很大的影響。除編碼bHLH類轉錄因子的基因外，參與水稻花藥絨氈層發(fā)育調控的基因還有OsGAMYB[13-14]、PTC1(PERSISTENTTAPETALCELL1)[15]、DTC1(DEFECTIVETAPETUMCELLDEATH1)[16]、API5(APOPTOSISINHIBITOR5)[17]、EDT1(EARLIERDEGRADEDTAPETUM1)[18]、MTR1(MICROSPOREANDTAPETUMREGULATOR1)[19]、TIP3(TDRINTERACTINGPROTEIN3)[20]、BM1(BAYMAX1)[21]、OsMADS3[22]、OsMADS8[23]、OsAGO2[24]、OsALDH2b[25]等。

前人研究已經表明了UDT1/TDR功能的缺失會嚴重影響絨氈層的發(fā)育進而影響水稻的育性[7-9]，然而，UDT1/TDR過表達植株是否會影響水稻的育性目前尚不清楚，為了進一步分析UDT1/TDR基因對水稻育性的影響，本研究利用植物基因過表達技術，分別對水稻UDT1和TDR基因進行過量表達，通過對獲得的過量表達轉基因株系進行表型觀察，明確了UDT1和TDR的過表達會導致水稻育性降低，豐富了UDT1/TDR對水稻育性的調控機理，也為水稻高產、穩(wěn)產育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌株

本研究以粳稻“龍粳11”為實驗材料，獲得過表達轉基因材料。植株在哈爾濱(北緯45°)的室外，以25 cm×25 cm的植物間距種植于盆栽盒，自然長日照條件下生長。實驗所用大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株TOP10，農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105和植物載體PC1390U均由中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所水稻分子育種實驗室保存。

1.2 UDT1/TDR基因的過表達載體構建

利用超純總RNA提取試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)提取龍粳11幼穗的RNA，反轉錄成cDNA(逆轉錄試劑盒，Takara公司)作為PCR擴增模板。在Rice Genome Annotation Project網站(http://rice.uga.edu/)下載UDT1(LOC_Os07g36460)、TDR(LOC_Os02g02820)的基因序列并通過Primer 5設計引物序列。采用引物UDT1-CDS-F和UDT1-CDS-R(表1)擴增UDT1基因的編碼區(qū)(coding sequence,CDS)序列；采用引物TDR-CDS-F和TDR-CDS-R(表1)擴增TDR基因的CDS序列，PCR擴增產物與經BamHI和KpnI酶切的PC1390U載體片段連接構建載體，轉化大腸桿菌菌株TOP10，挑取單菌落于37 ℃，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后，利用快速質粒DNA小量試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)提取質粒，將酶切鑒定正確的質粒送交吉林庫美生物有限公司測序，測序驗證無誤的即為成功構建的過表達載體。

表1 本研究中所用的引物

1.3 農桿菌介導的水稻遺傳轉化

將構建的UDT1、TDR過表達載體轉化農桿菌EHA105，并利用農桿菌介導法對野生型龍粳11水稻愈傷組織進行遺傳轉化，經過濃度為60 mg·L-1的潮霉素(Hygromycin,Hyg)篩選抗性愈傷組織，分化獲得T0代過表達轉基因植株。

1.4 轉基因植株分子生物學檢測

將T0代轉基因植株種植于室外盆栽盒中，對每株T0代植株提取葉片的全基因組DNA，通過潮霉素基因特異引物HPT(表1)進行PCR檢測，產物大小為900 bp的植株為陽性轉基因植株，種植并收獲種子用于下一代種植。將T0代收獲的種子室溫浸種1 d，37 ℃催芽2 d，育秧后種植于室外盆栽盒中，在苗期提取T1代植株葉片基因組DNA，繼續(xù)利用引物HPT鑒定，選擇鑒定為陽性的株系用于后續(xù)試驗。

1.5 T1代轉基因植株UDT1/TDR基因轉錄水平表達檢測

為了檢測目的基因UDT1和TDR在野生型和過表達材料UDT1-OE/TDR-OE中的表達量，提取對照材料龍粳11和過表達轉基因植株UDT1-OE/TDR-OE的RNA，逆轉錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測目的基因表達量。實驗設置3次技術重復。

1.6 轉基因植株表型分析

穎花觀察：水稻抽穗后開花前1 d，去掉小穗的穎殼，在顯微鏡(奧林巴斯SZX16)下觀察雄蕊和雌蕊的顏色和形態(tài)。

花粉染色觀察：水稻抽穗后開花前1 d，將樣品固定在甲醛-乙酸-乙醇(FAA)溶液中，進行1% I2-KI(1%I2，8%KI，W/V)染色鏡檢，取穗部上中下各3個小穗進行觀察。鏡檢時，打開穎殼，小心剝離出花藥，置于載玻片上，滴加20 μL的I2-KI滴劑，用鑷子搗碎花藥，釋放出花粉粒，于顯微鏡(奧林巴斯BX53)下觀察花粉粒的活力。

成熟期穗部觀察：成熟期觀察水稻穗部的結實情況并統(tǒng)計結實率。

2 結果與分析

2.1 UDT1/TDR基因的過表達載體構建

采用PC1390U載體作為UDT1和TDR植物過量表達載體，該載體含有潮霉素植物選擇標記基因，以組成型啟動子CaMV35S驅動目的基因表達(圖1A)。采用基因特異引物PCR(表1)分別擴增獲得長度為704 bp(UDT1)和1659 bp(TDR)的目的條帶，PCR產物與經BamHI和KpnI酶切的PC1390U載體片段連接，對重組質粒進行酶切檢測，獲得預期大小目的片段(圖1B)，表明目的片段已成功連入PC1390U空載體中。將構建成功的重組質粒進行測序驗證后，轉化到農桿菌EHA105中，用于后續(xù)的轉基因實驗。

2.2 水稻遺傳轉化及抗性植株分子生物學檢測

采用農桿菌介導法轉化野生型龍粳11，獲得潮霉素陽性轉基因T0代UDT1-OE植株15株，TDR-OE植株17株，對其中收獲到種子的4個陽性UDT1株系和3個陽性TDR過表達株系繼續(xù)繁殖進行實驗(圖1C)，對4個陽性UDT1和3個陽性TDR過表達株系種植的T1代共90株進行潮霉素鑒定，其中陽性共76株，選擇以上T1代陽性的植株進行后續(xù)的實驗。

2.3 轉基因植株UDT1/TDR基因轉錄水平表達檢測

利用qRT-PCR方法檢測野生型龍粳11和UDT1-OE/TDR-OE陽性過表達轉基因株系T1代體內相應基因的表達水平，發(fā)現四個陽性UDT1過表達株系UDT1-OE-1、UDT1-OE-2、UDT1-OE-3、UDT1-OE-4體內UDT1表達水平均有不同程度的提高，分別提高了約6、10、44、54倍(圖1D)；三個陽性TDR過表達株系TDR-OE-1、TDR-OE-2、TDR-OE-3體內TDR表達水平均有不同程度的提高(圖1E)，分別提高了約90、150、210倍。

注：A：過表達重組載體PC1390U-UDT1/TDR示意圖。LB為DNA左邊界，Hyg為潮霉素抗性基因，CaMV 35S promoter為花椰菜病毒35S啟動子，RB為DNA右邊界；B：重組載體的雙酶切鑒定(BamHI和KpnI)。1代表1390U-UDT1陽性單克隆，2代表1390U-TDR陽性單克隆，M為DNA標記；C：T0代植株轉基因檢測。1-4代表T0 代UDT1-OE陽性植株，5-7代表T0 代表TDR-OE陽性植株，8為陰性對照，9為陽性對照，M為DNA 標記；D-E：T1代表轉基因陽性植株轉錄表達檢測。LJ11為野生型，UDT1-OE-1～UDT1-OE-4為4個UDT1過表達轉基因植株，TDR-OE-1～TDR-OE-3為3個TDR過表達轉基因植株。

2.4 UDT1、TDR過表達轉基因植株表型特征

2.4.1UDT1、TDR過表達轉基因植株結實統(tǒng)計。觀察UDT1-OE不同株系的結實率情況，發(fā)現UDT1過表達轉基因植株結實率均有不同程度的降低。其中UDT1-OE-1、UDT1-OE-2結實率顯著下降，分別為67.63%、63.54%，而UDT1-OE-3、UDT1-OE-4結實率幾乎為0(圖2A，B)。

觀察TDR-OE不同株系的結實率情況，發(fā)現TDR-OE-1、TDR-OE-2、TDR-OE-3結實率均幾乎為0(圖2C，D)。因此，過表達UDT1、TDR會導致結實率的顯著下降。

2.4.2UDT1、TDR過表達轉基因植株花粉活力統(tǒng)計。I2-KI染色實驗結果表明，野生型花藥中充滿飽滿的深藍色可育花粉，4個UDT1過表達UDT1-OE株系中，過表達倍數較低的UDT1-OE-1、UDT1-OE-2可育花粉粒比例顯著下降，分別為73.6%、69.3%(圖2E，F)，而UDT1過表達倍數較高的UDT1-OE-3、UDT1-OE-4花藥中無花粉粒釋放(圖2E，F)，進而觀察了其整個花藥的染色情況，發(fā)現野生型花藥中充滿了深藍色的可育花粉粒，而在UDT1-OE-3、UDT1-OE-4花藥中觀察不到任何花粉粒(圖2E)。

注：A-D，過表達轉基因株系與野生型成熟穗部表型(A，C)及結實率(B，D)。標尺為1 cm，數據顯示為平均值±標準誤(n=10)，統(tǒng)計學顯著性差異用不同的小寫字母表示(P<0.05，采用Tukey顯著性差異檢驗的單因素方差分析)。E-H，過表達轉基因株系與野生型的花粉育性(E，G)和花粉染色率(F，H)。(E，G)，LJ11、UDT1-OE、TDR-OE的花粉或花藥I2-KI染色，標尺為20 μm，數據顯示為平均值±標準誤(n=5)，統(tǒng)計學顯著性差異用不同的小寫字母表示(P<0.05，采用Tukey顯著性差異檢驗的單因素方差分析)。I-J，過表達轉基因株系與野生型的穎花表型。上排圖片為雄蕊表型，下排圖片為雌蕊表型，標尺為1 mm。

觀察TDR-OE不同株系的KI-I2染色情況，發(fā)現3個TDR過表達株系中均無花粉粒釋放(圖2G，H)，隨后觀察了其整個花藥的染色情況，發(fā)現野生型花藥中充滿了深藍色的可育花粉粒，而在TDR-OE-1、TDR-OE-2、TDR-OE-3花藥中均觀察不到任何花粉粒(圖2G)。UDT1、TDR的過表達會嚴重影響花粉活力進而影響水稻結實率。

2.4.3UDT1、TDR過表達轉基因植株花藥形態(tài)。在開花前1d取野生型及過表達株系UDT1-OE穎花，剝開內外穎殼，在解剖鏡下進行花藥形態(tài)特征觀察。野生型花藥飽滿，直立于花絲上，長度較長，呈現為黃色(圖2I)；UDT1過表達轉基因植株花藥形態(tài)有不同程度的變化，其中UDT1-OE-1、UDT1-OE-2表現出明顯的花藥卷曲且變短，但顏色與野生型無明顯差別(圖2I)，而UDT1基因表達量較高的UDT1-OE-3、UDT1-OE-4花藥表現出嚴重的顏色發(fā)白，長度變短，皺縮卷曲，呈半透明的絲狀(圖2I)。而UDT1-OE雌蕊的表型與LJ11無區(qū)別(圖2I)，說明UDT1只對雄性生殖器官有影響。

同時觀察過表達株系TDR-OE穎花，剝開內外穎殼，在解剖鏡下進行花藥形態(tài)特征觀察。發(fā)現TDR過表達轉基因植株花藥顏色變淺，長度變短，表面皺縮，花藥形態(tài)明顯變差(圖2J)。綜上所述，過表達UDT1、TDR會對水稻花藥的生長發(fā)育造成嚴重影響。

3 結論與討論

本研究通過構建UDT1和TDR基因過量表達載體，以黑龍江優(yōu)質粳稻品種龍粳11為背景材料，獲得了的UDT1-OE及TDR-OE過量表達轉基因水稻，通過I2-KI染色、花藥形態(tài)觀察及結實率統(tǒng)計明確了UDT1和TDR的過表達對水稻育性的影響。

水稻絨氈層的分化形成和退化降解是一個復雜的過程。根據前人對花粉產生過程的劃分，將水稻花粉產生過程的時間節(jié)點分為小孢子母細胞形成期、小孢子母細胞減數分裂期、小孢子發(fā)育早期、小孢子發(fā)育中期、小孢子發(fā)育晚期、二胞花粉發(fā)育早期、二胞花粉發(fā)育晚期、成熟花粉發(fā)育期8個時期。在小孢子母細胞形成期，花藥壁四層細胞分化形成；在小孢子母細胞減數分裂期，絨氈層的胞質開始形成濃縮狀態(tài)；小孢子發(fā)育早期，絨氈層胞質呈完全濃縮狀態(tài)；隨著小孢子的逐漸發(fā)育，絨氈層逐漸變?yōu)閹?，其在小孢子發(fā)育晚期呈瓦狀；在二胞花粉發(fā)育早期，小孢子經過有絲分裂形成了生殖細胞和營養(yǎng)細胞，此時期的絨氈層僅余下殘留組織；在成熟花粉發(fā)育期，淀粉粒等貯藏物完全充滿了整個花粉粒，絨氈層完全退化消失，僅余下次生絨氈層壁[26-27]。絨氈層細胞的分化發(fā)育對小孢子的正常發(fā)育至關重要，且在小孢子和花粉發(fā)育后期，絨氈層細胞必須適時降解以便為小孢子提供充足的營養(yǎng)物質，促進小孢子和花粉粒的成熟，保證成熟花粉的釋放。絨氈層的降解是一個細胞程序性死亡PCD的過程，PCD過程的提前或延遲都會造成雄性不育[5]。小麥中RAFTIN1基因的提前高表達會導致絨氈層PCD異常而提前降解，小孢子無法得到充足的發(fā)育所需營養(yǎng)而造成雄性不育[28]。水稻中OsGAMYB主要在花藥原基和絨氈層細胞中表達，其突變體表現為小孢子發(fā)育早期絨氈層細胞開始異常肥大，PCD過程被抑制，小孢子解體，導致花粉不育[13-14]。

絨氈層細胞適時PCD是小孢子正常發(fā)育的重要保障[3]。UDT1主要參與次生壁細胞向成熟絨氈層的分化，處于減數分裂期的udt1絨氈層不能正常降解并呈空泡化，小孢子發(fā)育過程受阻、花粉囊內無法產生花粉細胞，從而影響花粉活力[7]。tdr突變體主要表現為絨氈層細胞質表現出染色不加深，不濃縮等PCD異常的超微結構特征，且TUNEL試驗和彗星試驗結果表明，tdr絨氈層PCD信號微弱，說明其未能降解；對小孢子發(fā)育階段的tdr突變體花藥進行轉錄分析時，發(fā)現編碼半胱氨酸蛋白酶的OsCP1和編碼半胱氨酸蛋白酶抑制劑的OsC6，而半胱氨酸蛋白酶與細胞凋亡密切相關，表明TDR與水稻花藥絨氈層的 PCD過程密切相關[9]。絨氈層細胞的PCD對于其發(fā)育及降解過程十分重要，PCD過程的提前或延遲發(fā)生都會造成雄性不育[5]。前人的研究已經揭示了UDT1、TDR的功能缺失會引起花藥絨氈層PCD的異常，從而導致雄性不育。而我們發(fā)現UDT1、TDR過量表達也能導致雄性不育的表型，這可能是由于UDT1、TDR在水稻花藥中的表達是一個十分精細的過程，過高或過低的表達量都會對花藥育性造成影響，UDT1、TDR的過表達植株絨氈層細胞PCD可能提前發(fā)生，從而導致了不育的表型。因此我們推測，UDT1、TDR亦可能是通過影響絨氈層PCD的適時發(fā)生來影響育性的。

本研究進一步揭示了UDT1、TDR在水稻中的功能，即UDT1或TDR過量表達植株花藥發(fā)育受損，長度變短，顏色發(fā)白，質地變差，進而影響了可育花粉比例，導致了結實率的顯著下降，甚至出現不育的表型。在UDT1-OE的4個株系中，雄性不育表型的嚴重程度隨著UDT1表達量的提高而增大(圖1D，1E，2A，2B，2E，2F，2I)，三個TDR-OE表達倍數均在90以上，均表現出不結實、無花粉等雄性完全不育表型(圖1D，1E，2C，2D，2G，2H，2J)。綜上所述，UDT1、TDR在水稻雄性生殖發(fā)育中起著不可或缺的作用，本研究對豐富花粉發(fā)育新機制和創(chuàng)制新類型不育種質資源具有重要意義。