簡敏菲,何旭芬,彭雨露,朱 宏,雷 雯,叢明旸

(江西師范大學生命科學學院,江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室,江西 南昌 330022)

0 引言

隨著工農(nóng)業(yè)與社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，越來越多的工業(yè)活動導致土壤資源受到嚴重污染與破壞[1],土壤重金屬污染問題日趨嚴重[2].在土壤中的重金屬污染物主要有鎘、鉛、銅、鋅、錫、鎳、鈷、銻、汞和鉍等[3],相比于其他重金屬,鎘(Cd)具有更強的遷移性、持久性、隱蔽性與毒效性，易積累在土壤中被植物根系吸收累積、影響植物的生長及生理生態(tài)等[4].同時,Cd易通過食物鏈被攝入人體并可能導致腎、肝、肺、骨骼和生殖器官等部位中毒,并對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等產(chǎn)生有害影響[5],甚至引發(fā)癌癥，對人類健康構(gòu)成嚴重危害[6].

國內(nèi)外針對土壤鎘污染的修復(fù)進行了諸多嘗試，傳統(tǒng)方法主要有物理客土法、玻璃化法、電動修復(fù)法、化學淋洗法、改良劑固定法等[7],這些方法大多存在修復(fù)成本高、易產(chǎn)生二次污染、導致土壤退化等缺陷，不適合大范圍使用[8];生物法(如植物法)對吸收重金屬有一定效果，但也存在超積累植物品種的適應(yīng)性、修復(fù)周期長和效率低等瓶頸問題[9].有關(guān)重金屬污染土壤的聯(lián)合修復(fù)技術(shù)也已開展相關(guān)研究，主要有生物聯(lián)合技術(shù)[10]、物理化學聯(lián)合技術(shù)和物理化學-生物聯(lián)合技術(shù)[11]、生物炭-生物聯(lián)合技術(shù)等方面[12],但各種修復(fù)技術(shù)之間的相互作用效應(yīng)及其機制仍需深入研究[13].生物炭-生物聯(lián)合技術(shù)是當前修復(fù)土壤重金屬污染問題的研究熱點，盆栽模擬法是探索植物修復(fù)重金屬污染土壤的主要研究手段.

生物炭是生物質(zhì)在限氧條件下通過熱化學裂解轉(zhuǎn)化而成的炭基固體材料[14],具有豐富的含氧官能團、比表面積大、孔隙發(fā)達且吸附力強等特點[15],能改善土壤質(zhì)量促進植物生長,并能吸附固定在土壤中的重金屬離子從而減輕植物的吸收量，還能改變土壤的酸度提高土壤pH值，這有助于將土壤中的重金屬從有效態(tài)轉(zhuǎn)化成無效態(tài)，從而顯著降低土壤中重金屬的生物有效性,并具有省時省力、資源廣泛、不易造成二次污染等特點而被廣泛應(yīng)用于土壤重金屬污染的修復(fù)中.如Cui Liqiang等[16]和張燕等[17]研究秸稈生物炭對鎘污染的稻田土壤修復(fù),研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):在土壤中的鎘從酸可提取態(tài)及可還原態(tài)逐漸向可氧化態(tài)及殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化；魯秀國等[18]發(fā)現(xiàn):在施加質(zhì)量分數(shù)為10%的核桃殼生物炭后，在土壤中鎘的有效利用性顯著降低；牛曉叢等[19]探究了用秸稈生物炭和酵素渣鈍化修復(fù)土壤中的Pb、Cd、Zn，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):施加質(zhì)量分數(shù)為5%的酵素渣和質(zhì)量分數(shù)為5%的秸稈生物炭能顯著降低土壤鎘的生物有效性；汪玉瑛等[20]和安梅等[21]研究生物炭對Cd污染土壤修復(fù)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):生物炭將土壤中Cd從酸可提取態(tài)、可還原物質(zhì)結(jié)合態(tài)向可氧化態(tài)、殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化，有效降低了鎘的生物可利用性.另外,生物炭緩解鎘污染對植物安全性及生長方面的影響也有相關(guān)報道,如在鎘污染土壤中施加玉米秸稈生物炭可以緩解鎘對植物的株高、生物量、葉綠素含量和抗氧化酶活性的抑制作用,并降低鎘積累對植物造成的影響[22].而生物炭對重金屬的固定效應(yīng)取決于生物炭的性質(zhì)及其制備原料[23],因為生物炭的制備材料及制備條件不同,所以其理化性質(zhì)也存在差異,對土壤鎘污染的修復(fù)效果也有所不同.玉米秸稈生物炭比其他材料制備的生物炭具有孔隙發(fā)達、較高的陽離子交換量、良好的結(jié)構(gòu)功能和廣泛的材料來源等優(yōu)點,是農(nóng)業(yè)廢棄物有效利用的重要途徑.

紫花地丁(Violaphilippica)別名又稱光瓣堇菜、野堇菜、地丁菜和遼堇菜等，是堇菜科(Violaceae)堇菜屬(Viola)的一種多年生草本植物,廣泛生長于郊野、路旁、荒地、草叢和灌叢等[24].花紫色，耐寒、耐貧瘠、耐旱、不擇土、適應(yīng)性極強，具有一定的藥用和觀賞價值.已有研究報道堇菜屬植物對土壤鎘具有一定的富集能力及耐受性，如寶山堇菜(V.baoshanensis)、早開堇菜(V.prionantha)、紫花地丁等均對土壤鎘具有較強的富集作用和耐受性[25-26],這表明紫花地丁是修復(fù)土壤重金屬鎘污染的一種良好植物材料.目前有關(guān)紫花地丁的化學成分及繁殖特性等方面的研究也有相關(guān)報道[27-28],但有關(guān)生物炭對在土壤鎘污染條件下紫花地丁修復(fù)方面的研究鮮見報道.本文以紫花地丁為供試材料,研究施加生物炭對在鎘污染土壤中紫花地丁生長及生理生態(tài)的影響,以期為生物炭修復(fù)土壤重金屬污染問題提供理論和數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設(shè)計

1.1.1 供試材料 供試土壤采自江西師范大學校園內(nèi)未受污染的0～20 cm深的表層土,經(jīng)室內(nèi)自然風干處理，剔除粗枝、根、葉和碎石等雜質(zhì)，將土塊粉碎后過4 mm篩,經(jīng)混勻后保存、備用.供試植物采自江西師范大學校園內(nèi)長勢基本一致、株高約5 cm的紫花地丁幼苗，經(jīng)室內(nèi)馴化培養(yǎng)7 d后備用.供試生物炭購自鄭州邦金環(huán)保科技有限公司生產(chǎn)的玉米秸稈生物炭，經(jīng)在450～500 ℃條件下制備而成，粒徑為1～2 mm,pH值為8.86.

1.1.2 在土壤中鎘溶液施加處理 在供試土壤經(jīng)除雜處理后測定其pH值、鎘含量背景值及其他主要理化指標，然后均分成3組樣.選用CdCl2·2.5H2O(分析純)配制鎘添加溶液，參照文獻[26,29]報道的鎘污染土壤現(xiàn)狀,分別設(shè)置3個梯度:0 mg·kg-1(0施加,CK組)、5 mg·kg-1(中濃度組,M組)和10 mg·kg-1(高濃度組,H組),將它們分別施加CdCl2溶液至上述3組土樣中,經(jīng)攪拌均勻后分裝入口徑為23 cm×底徑14 cm×高18 cm的實驗盆中,每個梯度處理組各分裝20盆等量平行樣,共60盆,每盆裝入2.5 kg處理土壤,各盆底部均放入濾紙及托盤防止土壤和重金屬流失,置于室內(nèi)避光馴化平衡14 d.

1.1.3 在鎘污染土壤中生物炭施加與植物培養(yǎng) 參照文獻[20,30-31]的方法,生物炭施加按在土壤中生物炭質(zhì)量分數(shù)設(shè)置,分別選取0%(0)、2%(2)、4%(4)和6%(6)共4個水平,將生物炭分別施加至上述3組鎘處理土壤中,將60盆處理成12組,各處理組代碼分別如表1所示,每組5個平行.在每盆土樣均勻攪拌并穩(wěn)定14 d后，移植生長一致的紫花地丁幼苗，每盆7株，置于室內(nèi)培養(yǎng)，每日設(shè)置光照12 h，控制溫度為(25±1) ℃，在培養(yǎng)期間，以稱質(zhì)量法定量加入蒸餾水，并重復(fù)利用底部托盤中的水，各盆每隔2 d加入等質(zhì)量的蒸餾水，確保土壤持水量為60%；在培養(yǎng)45 d后，采集各組植物樣及土壤樣，經(jīng)處理并測定相關(guān)指標.

表1 在鎘污染土壤中生物炭施加試驗設(shè)計與處理組對應(yīng)代碼

1.2 測定方法

1.2.1 植物株高 在培養(yǎng)處理45 d后,隨機采收各組紫花地丁植株，用卷尺(精確到0.1 cm)測量每株植物株高，每平行樣分別采集3株，統(tǒng)計每處理組株高平均值.

1.2.2 植物生物量 將測定株高后的植株體用自來水洗凈植物全株泥土后,用超純水沖洗全株2～3遍，隨后用吸水紙吸干植株表面的水分，測定單株鮮質(zhì)量；在室內(nèi)自然風干后于65 ℃下烘干至恒質(zhì)量,用電子天平稱其鮮質(zhì)量和干質(zhì)量(精確到0.1 mg),統(tǒng)計各處理組每株植物鮮質(zhì)量平均值.

1.2.3 葉綠素含量 采集并稱取各盆供試植物樣完全展開葉0.1 g于研缽中，全程在避光條件下進行.加入5 mL 100%的二甲基亞砜(DMSO)進行研磨,在4 ℃、轉(zhuǎn)速為7 000 rpm的條件下離心20 min,并用二甲基亞砜定容至10 mL,分別在645 nm和663 nm波長下測定其吸光度值[32],參照Arnon方法[33]計算葉綠素各指標,分別為葉綠素a(Chlorophylla,Ca,mg·L-1)、葉綠素b(Chlorophyll b,Cb,mg·L-1)和葉綠素總量(Total chlorophyll,Ct,mg·L-1),計算公式為Ca=12.70A663-2.69A645,Cb=22.90A645-4.68A663,Ct=8.02A663+20.21A645.

1.2.4 抗逆酶活性 分別選擇超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 、過氧化物酶(Peroxidase,POD)及過氧化氫酶(Catalase,CAT)等3種抗逆酶指標進行測定.

從各培養(yǎng)盆中取出受試植物紫花地丁，準確稱取每平行樣葉片各0.1 g,分別加入0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值為7.8,內(nèi)含0.1%二硫蘇糖醇(DTT)和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)),為防止酶活性失活，在-20 ℃下預(yù)冷處理研缽，并于冰浴上迅速研磨成勻漿，采用臺式高速冷凍離心機(盧湘儀BIORIDGE(TGL-16M))在4 ℃、轉(zhuǎn)速為7 000 rpm條件下離心20 min,提取上清液測定酶活指標.采用氮藍四唑法測定SOD瞬時值[34];采用愈木創(chuàng)酚法測定POD值,每隔30 s記錄1次,吸光度以在1 min內(nèi)A470上升0.1 為1個活性單位；采用紫外分光光度吸收法測定CAT，每隔1 min記錄1次，以在1 min內(nèi)A240下降0.1為1個酶活力單位[35].

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2019軟件進行數(shù)據(jù)整理,并利用SPSS19.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,使用單因素ANOVA進行方差分析,并用最小顯著差異法(LSD)分析(α=0.05),對生物炭施加下在鎘污染土壤中紫花地丁的生理生長指標變化進行差異性比較.計算結(jié)果均采用平均值±標準差表示,采用Origin18.0軟件進行制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭對鎘污染土壤中紫花地丁生長的影響

2.1.1 在不同條件下紫花地丁株高的變化特征 在不同處理條件下紫花地丁株高的變化如圖1所示.未受鎘污染的CK0組紫花地丁株高高于有鎘污染處理各組的；而未施加生物炭的M0組和H0組間的植株高無統(tǒng)計學意義上顯著性差異.在施加不同量生物炭后，未受鎘污染的CK2組和CK4組的紫花地丁株高高于CK0組的；在相同生物炭量施加條件下，H2組與CK2組相比植株高無統(tǒng)計學意義上顯著性差異，2組株高均顯著高于M2組；CK4組的株高顯著高于H4組，M4組的株高高于H4組；在施加不同量的生物炭后，M組的株高均高于未施加生物炭的M0組的，在不同量生物炭施加條件下各組株高變化無統(tǒng)計學意義上顯著性差異；H2組株高顯著高于其他各處理組的.

2.1.2 在不同條件下紫花地丁鮮質(zhì)量的變化特征在不同處理條件下紫花地丁的鮮質(zhì)量變化如圖2所示.在無鎘污染條件下CK0組紫花地丁鮮質(zhì)量顯著高于有鎘污染處理各組的；在未施加生物炭條件下，紫花地丁的鮮質(zhì)量隨鎘含量的增加呈顯著下降趨勢.在施加不同量的生物炭后，無鎘污染的CK組中紫花地丁的鮮質(zhì)量有一定增加，但效果并不顯著；CK各組紫花地丁鮮質(zhì)量均顯著高于M組和H組在相同生物炭量施加條件下紫花地丁的鮮質(zhì)量.在有鎘污染的M組與H組中施加不同比例的生物炭后，分別以在M2或H2條件下的紫花地丁鮮質(zhì)量為最高，且均顯著高于其他各處理組的.隨著生物炭施加量的增加，M組與H組在鎘污染條件下紫花地丁的鮮質(zhì)量均呈下降趨勢；除2%生物炭的施加組外，在相同生物炭量施加條件下，M組紫花地丁的鮮質(zhì)量顯著高于H組的.

注:不同字母表示差異顯著(P<0.05).以下各圖均同.

圖2 生物炭施加對鎘污染土壤中紫花地丁生物量的影響

2.2 生物炭施加對鎘污染土壤中紫花地丁主要生理指標的影響

2.2.1 紫花地丁葉綠素的變化特征 在不同處理條件下紫花地丁各種葉綠素含量和葉綠素a/b(Ca/Cb)的變化分別如圖3(a)、(b)所示.在未施加生物炭條件下，與CK0相比，在不同強度鎘污染土壤中紫花地丁Ca和Ct均顯著降低；但Cb的變化不顯著；M0組Ca/Cb的變化不顯著，H0組的Ca/Cb顯著升高.CK各組紫花地丁的Ca和Ct均隨生物炭量施加量增加而顯著提高，CK2組的Ca和Ct變化量最顯著；施加不同量生物炭對CK組紫花地丁的Cb含量有顯著影響，且隨著生物炭量增加各CK組植物的Cb呈緩慢增加趨勢；而Ca/Cb的變化總體上隨生物炭量增加呈下降趨勢，Ca/Cb的變化在2%生物炭的施加條件下不顯著，但在4%和6%生物炭的施加條件下的變化較顯著.

在不同強度鎘污染土壤中施加不同量生物炭后，中污染(M2、M4)組和高污染(H2、H4)組的Ca和Ct含量均顯著高于M0或H0的，而Cb含量均未產(chǎn)生顯著變化；M6組和H6組植物的Ca和Ct均呈下降趨勢，且與M0或H0組相比，M6和H6這2組的Ca含量、H6組的Ct含量值均無顯著變化，僅M6組和H4組的Cb含量顯著提高.

在CK各組中紫花地丁的Ca/Cb值隨生物炭量的增加呈下降趨勢，但CK2組的變化不顯著，而CK4和CK6組的變化較一致且均顯著低于CK0組的；M組或H組紫花地丁的Ca/Cb值隨生物炭施加量的增加表現(xiàn)出不一致的變化，M組Ca/Cb值隨生物炭量增加呈先顯著上升后顯著下降趨勢，M4組達最高；而在H組中施加生物炭量后，紫花地丁的Ca/Cb值均顯著低于H0組的，且不同施加量各組間無統(tǒng)計學意義上顯著性差異.

圖3 生物炭施加對鎘污染土壤中紫花地丁各種葉綠素的影響

2.2.2 紫花地丁抗逆酶活性的變化 在不同處理條件下紫花地丁的SOD、CAT和POD這3種抗逆酶的酶活性的變化如圖4所示.在未施加生物炭條件下，M0組紫花地丁的SOD、CAT和POD抗氧化酶活性均顯著高于CK0對照組和H0組對應(yīng)的指標值；H0組植物的SOD和POD值顯著高于CK0組對應(yīng)的指標值，而CAT指標無顯著變化.在CK各組中，隨著生物炭施加量的增加，紫花地丁各抗氧化指標值呈不同變化，但并未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律，總體上表現(xiàn)出生物炭的施加降低了紫花地丁的SOD酶活性，并提高了CAT的酶活性，而POD活性隨生物炭量的增加呈緩慢增加趨勢，且CK4組的SOD和CAT指標值均顯著高于CK各組的.

在鎘污染土壤中施加不同量的生物炭后，隨著生物炭量的施加，M組和H組紫花地丁的SOD值均呈先升后降趨勢，以在M2組和H2組條件下的SOD值為最高，均顯著高于未施加生物炭的M0組或H0組的；在相同量生物炭施加條件下，H組的SOD值顯著高于M組，且H組和M組的SOD值均顯著高于CK0組的.在不同強度鎘污染處理組中，不同量生物炭施加對植株體CAT的影響并不顯著，對H組的POD活性影響也不顯著，但M組的POD值在施加不同量生物炭后呈現(xiàn)顯著變化，M2組和M4組的POD值均顯著低于M0組的，而M6組的POD值顯著高于M0組的.在相同量生物炭的施加條件下，受污染各組的POD值均顯著高于對應(yīng)的未受污染各組的.

圖4 生物炭施加對鎘污染土壤中紫花地丁抗氧化酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

生物炭在土壤改良中有諸多作用，通過向土壤中釋放K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+和Na+等可交換態(tài)離子為植物生長提供營養(yǎng)元素[36],從而促進植物的正常生長[37].通過表面特殊的多孔結(jié)構(gòu)吸附重金屬等污染物[38],這有利于緩解重金屬對植物的毒害作用[39].

本文研究發(fā)現(xiàn):在不同鎘污染土壤中施加不同量玉米秸稈生物炭后，紫花地丁的株高及鮮質(zhì)量均有所提高，這表明生物炭能促進植株體生長并減緩重金屬鎘對紫花地丁的毒害影響；在鎘污染較高濃度處理土壤中，在低適量(質(zhì)量分數(shù)2%～4%)生物炭施加條件下，紫花地丁的鮮質(zhì)量和株高均顯著高于未施加生物炭的高鎘污染組的，這表明適量生物炭施加有助于緩解鎘污染對紫花地丁生長的影響，這與蔣欣梅等[40]和郭軍康等[41]研究發(fā)現(xiàn)施用一定量的生物炭能增加蔬菜生物量的結(jié)果相一致.李康[29]研究也發(fā)現(xiàn)施加低適量玉米骨生物炭能提高龍葵(Solanumnigrum)的株高和干質(zhì)量；黃連喜等[42]研究發(fā)現(xiàn)生物炭可對土壤重金屬產(chǎn)生鈍化作用，促進蔬菜的生長，這些結(jié)果均與本文的結(jié)果較一致.此外,當施加質(zhì)量分數(shù)為4%的生物炭時，對照組CK4的紫花地丁鮮質(zhì)量和株高顯著高于受鎘污染的處理組M4組和H4組的，這表明在無鎘污染影響下，相同量生物炭施加更有利于植物的鮮質(zhì)量和株高增加，這與王義祥等[43]的研究結(jié)果較一致.但隨著生物炭施加量繼續(xù)增加紫花地丁的鮮質(zhì)量和株高反而會出現(xiàn)下降，可能原因是:在土壤孔隙中吸附生物炭也會趨于飽和，繼續(xù)提高生物炭施加量會影響紫花地丁根系對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收[40],或者是生物炭過量導致土壤電解質(zhì)濃度增高，導致紫花地丁在一定程度上失去水分，從而影響紫花地丁的生長[22].

本文研究還發(fā)現(xiàn):與未施加生物炭的鎘污染組(M0或H0)相比，在施加質(zhì)量分數(shù)為2%或4%的生物炭的條件下，中污染(M2、M4)組和高污染(H2、H4)組的Ca和Ct含量均顯著升高，而Cb含量均未產(chǎn)生顯著變化.低適量的生物炭施加能有效緩解鎘對紫花地丁葉綠素的影響，顯著增加葉綠素總量Ct.不同處理組紫花地丁的Ca/Cb值呈無規(guī)則變化，M組呈先升后降趨勢，而CK組和H組的Ca/Cb值隨生物炭施加量增加呈下降趨勢，這表明Ca比Cb對鎘污染脅迫更敏感，也可能原因是:植物葉片衰老導致，或者其他環(huán)境因素導致的結(jié)果[44];還可能原因是:在葉綠素的提取中，由于研磨充分性問題而沒有使葉片中全部葉綠素被提取出來[45].

當環(huán)境遭到其他因素破壞時，植物體內(nèi)正常的代謝平衡會失調(diào)，從而會導致大量活性氧產(chǎn)生并積累，引起膜脂過氧化，對植物造成傷害[46].而抗氧化酶是一種清除劑，用以消除植物體內(nèi)過多的活性氧從而達到平衡.本文研究發(fā)現(xiàn)紫花地丁在不同Cd污染影響下，植株體內(nèi)抗氧化酶SOD與POD均呈顯著增加趨勢，主要原因是鎘進入紫花地丁植株體后導致其活性氧增加，需依靠抗氧化酶的活性清除植株體內(nèi)過多的活性氧.在鎘污染土壤中施加生物炭后，隨著生物炭施加量的增加,紫花地丁植株體的抗氧化酶活性呈下降趨勢.在施加低適量生物炭(質(zhì)量分數(shù)為2%或4%)條件下，植物體的CAT和POD酶活性最低，在施加質(zhì)量分數(shù)為6%的生物炭時紫花地丁的SOD酶活性最低，這表明一定量的玉米秸稈生物炭能激活紫花地丁的應(yīng)激機制以抵抗鎘污染脅迫，并緩解鎘破壞紫花地丁的膜脂氧化過程，活性氧的產(chǎn)生減少，進而緩解鎘對紫花地丁的脅迫效應(yīng)，降低抗氧化酶的活性[40].金睿等[47]也發(fā)現(xiàn)生物炭能緩解鎘對南瓜幼苗的膜質(zhì)化，其抗氧化酶的酶活性也呈下降趨勢，這與本文的研究結(jié)果相一致.但只有在適量生物炭的施加條件下才有助于紫花地丁抵抗外界環(huán)境的影響，施加過量的生物炭也會對紫花地丁的生長產(chǎn)生不利影響，由于過量生物炭會產(chǎn)生一些礦物質(zhì)并導致土壤營養(yǎng)及其結(jié)構(gòu)特征發(fā)生改變，因而影響植物的正常生長[48].

綜上分析,在盆栽模擬條件下不同鎘污染土壤中施加不同質(zhì)量分數(shù)的生物炭對紫花地丁的生長與生理生態(tài)均有一定影響.低適量玉米秸稈生物炭施加能顯著增加高濃度鎘污染處理土壤中紫花地丁的株高和鮮質(zhì)量，并顯著增加在不同鎘污染條件下紫花地丁的葉綠素a和葉綠素總量.低適量生物炭能激活紫花地丁的應(yīng)激機制以抵抗鎘污染脅迫，緩解鎘破壞紫花地丁的膜脂氧化過程，減少活性氧的產(chǎn)生，降低鎘對紫花地丁的脅迫.