早期胃癌(early gastric cancer，EGC)定義為局限于黏膜層或黏膜下層的腫瘤，無論是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。目前，對(duì)于T1a的黏膜內(nèi)癌主要采取內(nèi)鏡黏膜下剝離和內(nèi)鏡下黏膜切除，但對(duì)于T1b的黏膜下癌，指南仍推薦胃切除聯(lián)合淋巴結(jié)清掃術(shù)

。隨著手術(shù)理念逐步趨于微創(chuàng)化、精準(zhǔn)化和個(gè)體化，EGC的手術(shù)治療也逐步向局部切除聯(lián)合區(qū)域淋巴結(jié)清掃的方向發(fā)展。然而，由于缺乏合適的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，EGC在縮小手術(shù)方面的可行性和安全性尚未達(dá)成一致

。為了解決這一問題，首先需要一種用于手術(shù)的模擬人類EGC的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。如今，小鼠胃癌模型的制作已相當(dāng)成熟，但在如何精準(zhǔn)制備小鼠EGC模型的方面仍缺少相關(guān)報(bào)道

。同時(shí)，當(dāng)下的小鼠胃癌模型多應(yīng)用于抗腫瘤藥物治療和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程等方面的研究

，在手術(shù)治療方面仍存在明顯的空缺。

試驗(yàn)原料為產(chǎn)自遼寧寬甸的天然菱鎂礦，其主要化學(xué)組成為：MgO(47.61%)、CaO(0.50%)、SiO2(0.66%)，純度約為99.58%。將菱鎂礦于750 ℃的馬弗爐中煅燒3.0 h后獲得輕燒氧化鎂，其MgO含量為96.89%。

本研究中，我們首先建立了一種裸鼠EGC原位移植模型，然后在該模型上分別行顯微鏡輔助下胃楔形切除術(shù)(microscopic assisted wedge gastrectomy，MAWG)和顯微鏡輔助下開關(guān)腹術(shù)(microscopic assisted open & close surgery，MAOCS)，比較兩組的腫瘤生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，用于評(píng)估MAWG的技術(shù)可行性和腫瘤學(xué)安全性。本研究中的裸鼠模型是研究EGC的有效工具，并且MAWG可能為后續(xù)裸鼠EGC的縮小手術(shù)提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

SNU638鼠源性胃癌細(xì)胞由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供；6～8周齡，BALB/c品系裸鼠共12只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼有，由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室代為購買。SMZ-B2/T2體視顯微鏡、異氟烷吸入麻醉藥和動(dòng)物麻醉系統(tǒng)由大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：所有實(shí)驗(yàn)裸鼠均獨(dú)籠飼養(yǎng)在無菌、安靜的環(huán)境中；設(shè)置溫度(21±2)℃、濕度(50±10)%和照明(12 h/12 h光暗循環(huán))。實(shí)驗(yàn)開始前所有裸鼠均保持1周的適應(yīng)期，禁止一切刺激性操作。所有小鼠的操作和治療均是按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》中規(guī)定的程序進(jìn)行的。該實(shí)驗(yàn)方案已獲得大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):2022-020-1)。在研究結(jié)束時(shí)，所有裸鼠在全身麻醉下處死。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：SNU638鼠源性胃癌細(xì)胞接種于100 π培養(yǎng)皿中，并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO

、含質(zhì)量濃度為100 g/L小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)傳代培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)細(xì)胞融合為80%～90%時(shí)，經(jīng)過PBS潤(rùn)洗細(xì)胞、胰酶(0.25% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA)消化后，1 500 r/min，4 ℃，離心5 min。然后補(bǔ)加無血清的培養(yǎng)基，洗滌3次。顯微鏡下計(jì)數(shù)，用無小牛血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4×10

ml

，制備成1 ml細(xì)胞懸液。將制備的細(xì)胞懸液放置冰浴中保存，備30 min內(nèi)完成接種。

德國垃圾管理方面的政策法規(guī)可追溯至20世紀(jì)70年代初期。當(dāng)時(shí)建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)不一的垃圾堆放場(chǎng)和垃圾填埋場(chǎng)遍布整個(gè)國家，雖然絕大多數(shù)在郊外，但是隨著這些垃圾堆放場(chǎng)對(duì)地下水資源的危害被逐步證實(shí)，政府開始重新考慮當(dāng)時(shí)立法的可行性。

肌肉的絞痛，韌帶、關(guān)節(jié)囊的鈍痛，神經(jīng)根的放射痛，神經(jīng)的閃電樣銳痛，交感神經(jīng)的灼痛，骨的深部痛，骨折的劇痛，脈管系統(tǒng)的彌散性痛……不管發(fā)生在什么地方，骨骼肌肉系統(tǒng)疾病與疼痛關(guān)系友好。

1.2.3 研究設(shè)計(jì)：首先，建立裸鼠EGC原位移植模型。飼養(yǎng)3周后，將所有裸鼠隨機(jī)分成兩組(每組6只)，研究組行MAWG，對(duì)照組行MAOCS。術(shù)后觀察4周，觀察期結(jié)束后將所有實(shí)驗(yàn)裸鼠處死，立即行解剖和組織病理學(xué)檢查。

(1)建立裸鼠EGC模型：實(shí)驗(yàn)裸鼠用小動(dòng)物麻醉機(jī)異氟烷吸入麻醉(氧氣1～2 L/min+異氟烷1.5～3.0 L/min)，固定、備皮、消毒、鋪巾，全程無菌操作，并在顯微鏡輔助下進(jìn)行。首先，在上腹正中部位取5～10 mm切口進(jìn)入腹腔，利用無損傷鑷確認(rèn)裸鼠胃體并將其外置。然后，用31號(hào)無損傷針頭，迷路進(jìn)針0.2 mm，將SNU638細(xì)胞懸液50 μl(細(xì)胞數(shù)為2×10

)緩慢注入裸鼠的胃體大彎側(cè)的黏膜下層。確認(rèn)注射部位無滲漏后，將胃送入腹腔，用4-0縫線逐層關(guān)腹，單純吸氧至裸鼠蘇醒，獨(dú)籠飼養(yǎng)。

(2)建立MAWG模型：手術(shù)前夜移除飼料。麻醉消毒及開腹顯露同上述，全程無菌操作，并在顯微鏡輔助下進(jìn)行。首先，在胃壁下用濕潤(rùn)的無菌鹽水紗布保護(hù)，確認(rèn)腫瘤的位置，標(biāo)記距離腫瘤約5 mm的范圍。然后，用裸鼠專用腸鉗楔形夾閉標(biāo)記部位的遠(yuǎn)近端胃壁，楔形切除以腫瘤為中心半徑約5 mm的胃壁，殘端消毒，采用10-0血管縫合線端-端吻合胃壁(見圖1A～1B)。最后，松開腸鉗，確認(rèn)吻合部位縫合完整、血運(yùn)良好、無出血、無滲漏后，將胃送回腹腔，逐層關(guān)腹，后續(xù)處置同上。

即孟子認(rèn)為小孩的“良知”“良能”會(huì)促使其敬愛其父母兄長(zhǎng)的。孟子的“良知”“良能”就是陸九淵的“本心”。所以陸九淵的“本心”也同樣具有發(fā)動(dòng)道德行為的能力。這樣我們就可以認(rèn)為“本心”除了是一種積極的精神，同時(shí)也是一種能動(dòng)的精神。

(3)建立MAOCS模型：術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉消毒及術(shù)后處置同前，僅行單純開關(guān)腹手術(shù)。

1.2.5 組織病理學(xué)檢測(cè)：對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。用4% PFA固定標(biāo)本，脫水、透明和石臘包埋，將其切成4 μm厚的切片，再用蘇木精-伊紅染色(HE染色)。采用相位收縮顯微鏡對(duì)染色切片進(jìn)行評(píng)估。

1.2.4 解剖裸鼠和觀察指標(biāo)：常規(guī)觀察記錄實(shí)驗(yàn)裸鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)和體質(zhì)量情況。手術(shù)4周后，在全麻狀態(tài)下處死所有實(shí)驗(yàn)裸鼠后立即解剖，記錄吻合口及周圍組織、血性腹水、淋巴結(jié)及腹腔內(nèi)臟器轉(zhuǎn)移的情況，凡可疑病灶均取材送檢。

老崔看到他，搖下了車窗玻璃，說，你找我有事嗎？馮一余說，沒事，我散步呢，看到這個(gè)車?yán)镉辛凉猓詾槭鞘裁茨?，不料是你，你怎么坐在車?yán)?？老崔笑笑說，我不坐在車?yán)镒谀睦锬?？馮一余說，你等人啊？老崔說，我不等人，我等想法。馮一余笑道，你等什么想法呢？老崔說，我等停車的想法，我家小區(qū)車停滿了，我這會(huì)兒回去，也停不了車，我得等怎么停車的想法想出來了，才能開車回去。

2 結(jié)果

SNU638鼠源性胃癌細(xì)胞移植3周后，裸鼠胃壁上可見腫瘤組織生長(zhǎng)，呈不規(guī)則狀，質(zhì)地較硬，病理檢測(cè)見腫瘤細(xì)胞均位于黏膜下層，手術(shù)切緣陰性(見圖1C～1D)。制模過程順利，術(shù)后兩組裸鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)和體質(zhì)量均無差異，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無裸鼠死亡。裸鼠EGC原位移植模型成功率為100%(12/12)，MAWG模型和MAOCS模型的手術(shù)成功率均為100%(6/6，6/6)。

老福慢吞吞地回答：“根據(jù)法律，如果你姑媽沒留下遺囑，找個(gè)律師，按法律分配；如果有遺囑就按遺囑辦。所以我不能告訴你們能得到多少，還是得由你姑媽決定。”

手術(shù)4周后，在全麻下處死所有實(shí)驗(yàn)裸鼠并立即解剖。研究組裸鼠解剖見吻合口愈合良好，胃壁無腫瘤組織，胃周無淋巴結(jié)腫大，無血性腹水，無其他臟器轉(zhuǎn)移病灶(見圖2A～2B)；對(duì)照組裸鼠解剖見胃體部有一長(zhǎng)徑約4 mm的腫物，明顯突出胃壁，部分裸鼠可見有第3組、第5組、第12組、第16組淋巴結(jié)腫大，無血性腹水，無其他臟器轉(zhuǎn)移病灶(見圖2D～2E)。取胃體、胃周淋巴結(jié)及可疑組織行病理學(xué)檢測(cè)。研究組裸鼠吻合口處無腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(見圖2C)，而對(duì)照組裸鼠見腫瘤細(xì)胞侵及漿膜下層(見圖2F)；研究組裸鼠的淋巴轉(zhuǎn)移率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

<0.05)(見圖3)。研究組裸鼠EGC模型全部達(dá)到根治性切除，近期未見腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

3 討論

建立穩(wěn)定可靠的裸鼠EGC模型是驗(yàn)證MAWG可行性和安全性的前提。長(zhǎng)期誘導(dǎo)造模

和基因工程造模

均可準(zhǔn)確地建立EGC模型，但其制模周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)成本高、成功率偏低，大大降低了實(shí)驗(yàn)效率。Yamaguchi等

采用細(xì)胞懸液原位種植的方法將AZ521人胃癌細(xì)胞系注入胃竇漿膜下層，6周后小鼠全部出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上做出了改進(jìn)，選用來源于原發(fā)性腫瘤和具有高轉(zhuǎn)移潛能的SNU638鼠源性胃癌細(xì)胞系

，將細(xì)胞懸液注入胃體黏膜下層沉積，靠近黏膜層，即人類胃癌的起始部位，3周后行MAWG，病理檢測(cè)僅在黏膜下層有腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；術(shù)后4周處死所有裸鼠行解剖和病理檢測(cè)，研究組無腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果證實(shí)：(1)該裸鼠EGC模型制作周期短(3周)，成瘤率高(100%)，模擬了人胃癌細(xì)胞在體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為，值得推廣應(yīng)用；(2)MAWG模型組達(dá)到了對(duì)裸鼠EGC的根治性切除，驗(yàn)證了該技術(shù)在手術(shù)操作上的可行性，在近期腫瘤學(xué)行為上的安全性。但由于小鼠自身?xiàng)l件的限制，使本實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵的制模過程存在較高的操作難度，并且缺少對(duì)裸鼠術(shù)后長(zhǎng)期生存率和腫瘤復(fù)發(fā)率等方面的進(jìn)一步探索。

制作裸鼠EGC模型的難點(diǎn)在于腫瘤細(xì)胞的注射，其部位、深度、角度、劑量、速度、針頭粗細(xì)和實(shí)驗(yàn)員熟練度等均能影響制模的成功率。Busuttil等

在顯微鏡下用29 g U-100胰島素注射器將50 μl細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)為0.5×10

)成功注入胃竇部的漿膜下層。本實(shí)驗(yàn)制模的優(yōu)勢(shì)在于：(1)小鼠胃體大彎側(cè)胃壁較厚，活動(dòng)度大，易于術(shù)野暴露和手術(shù)操作；(2)選用31號(hào)無損傷針頭，迷路進(jìn)針，將50 μl細(xì)胞懸液緩慢注射(約20 s)，可以防止因壓力過大而發(fā)生腫瘤細(xì)胞的滲漏；(3)進(jìn)針深度0.2 mm，可以將腫瘤細(xì)胞直接注入黏膜下層，過深則易注入胃腔內(nèi)，過淺則易造成進(jìn)展期胃癌模型。

MAWG的關(guān)鍵是要達(dá)到腫瘤的根治性切除和避免裸鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡。研究組在術(shù)后4周對(duì)胃體、胃周淋巴結(jié)和腹部臟器行病理檢測(cè)，均無腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，從而驗(yàn)證該手術(shù)達(dá)到了對(duì)侵及黏膜下層EGC的根治性切除。此外，吻合技術(shù)和無菌操作則是影響實(shí)驗(yàn)中裸鼠生存的重要因素。本手術(shù)優(yōu)勢(shì)和技巧在于：(1)選用可放大40倍的體視顯微鏡、小動(dòng)物麻醉機(jī)、裸鼠專用腸鉗和電刀；(2)楔形切除以腫瘤為中心5 mm范圍的胃壁，既可以保證手術(shù)切緣的陰性，又可以充分保留胃的正常解剖和生理功能；(3)采用10-0血管縫合線連續(xù)全層端-端吻合胃壁，針距2～3 mm，避免發(fā)生出血、梗阻、吻合口瘺等術(shù)后并發(fā)癥，但實(shí)驗(yàn)前需要在顯微鏡下利用膠皮手套反復(fù)練習(xí)縫合技巧。近年來，有研究采用熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞系

，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的定位和監(jiān)測(cè)。這使得在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們可以在熒光腹腔鏡輔助下直觀準(zhǔn)確地辨認(rèn)腫瘤的位置、大小以及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，從而更科學(xué)地實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的精準(zhǔn)切除。

本實(shí)驗(yàn)中，我們通過解剖和病理學(xué)檢測(cè)來驗(yàn)證MAWG的近期療效，以至于無法長(zhǎng)期觀察裸鼠術(shù)后的生存率和腫瘤復(fù)發(fā)率。但近年來，隨著小動(dòng)物PET/CT、生物發(fā)光成像、磁共振成像等技術(shù)逐漸成熟，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在活體動(dòng)物上對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

。這不僅有助于我們對(duì)模型成瘤率的早期判斷，還有助于我們繼續(xù)觀察裸鼠術(shù)后12周內(nèi)的生存率和腫瘤復(fù)發(fā)率。目前有研究

表明，微轉(zhuǎn)移與腫瘤的早期復(fù)發(fā)以及預(yù)后顯著相關(guān)，但常規(guī)的影像學(xué)檢查和病理學(xué)檢查對(duì)微轉(zhuǎn)移灶的敏感性相對(duì)較低。令人感興趣的是，Kelly等

對(duì)胰腺癌術(shù)后的腹腔灌洗液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，其陽性率明顯高于常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查。有鑒于此，在以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取裸鼠的骨髓、肝臟等器官行RT-PCR檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)EGC精準(zhǔn)切除術(shù)后是否存在微轉(zhuǎn)移做出準(zhǔn)確的評(píng)估，從而進(jìn)一步判斷手術(shù)在腫瘤學(xué)行為上的安全性。

綜上所述，制作裸鼠EGC模型和MAWG模型均需要熟練、精準(zhǔn)的外科操作，并且其術(shù)后長(zhǎng)期生存率和腫瘤復(fù)發(fā)率有待進(jìn)一步研究，但本實(shí)驗(yàn)為裸鼠EGC的模型建立和手術(shù)治療提供了一個(gè)新的研究方向。同樣，對(duì)于進(jìn)展期胃癌，按照本實(shí)驗(yàn)類似的方法，也可以在裸鼠模型上進(jìn)行手術(shù)方式的改進(jìn)和以手術(shù)為主多學(xué)科綜合治療的探索。

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