周銀麗，韋福翠，張德剛，楊 偉，胡先奇

(1.紅河學(xué)院云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自 661100; 2.紅河學(xué)院商學(xué)院，云南 蒙自 661100; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

【研究意義】蒙自享有石榴之鄉(xiāng)的美名[1]，但是隨著果樹年齡的增長，病害危害的程度也大幅度增加，傳統(tǒng)耕作輪換制度對于多年生的果樹不切實(shí)際，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用與產(chǎn)品的品質(zhì)和土壤微生態(tài)平衡又相矛盾[2]，嚴(yán)重限制了石榴產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的間作、套作方式在調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，提高經(jīng)濟(jì)效益等方面的作用得到廣泛認(rèn)可[3]，可以起到增產(chǎn)、提高養(yǎng)分資源利用率、增加農(nóng)田生物多樣性的作用[4]，間作可提高石榴枯萎病土壤的微生物群落碳代謝的能力，對石榴枯萎病害土壤有一定的修復(fù)作用[5]，并且向著高肥力的方向發(fā)展[6]，同時大量的研究表明間作可以改變土壤真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[7]，促進(jìn)微生物群落向更好的趨勢發(fā)展[8]。已有研究表明石榴枯萎病病菌主要從傷口侵入石榴根部[9]，進(jìn)而在木質(zhì)部擴(kuò)展危害，所以石榴根際微生物對枯萎病的傳播蔓延影響尤為重要。石榴枯萎病是一種土傳真菌病害，病原菌甘薯長喙殼菌(Ceratocystisfimbriata)在土壤中分布廣泛，主要引起甘薯黑斑病、石榴枯萎病[10]。自1999年在中國云南省蒙自縣爆發(fā)石榴枯萎病以來[11]，相關(guān)的防治研究就在不斷探索中[12-13]。【本研究切入點(diǎn)】土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能是影響連作障礙的重要因素，石榴園土壤微生物群落及其功能是解析石榴連作障礙的關(guān)鍵因素?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用高通量測序的方法研究蒙自石榴枯萎病土壤樣品(MZD)、間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)、蒙自健康石榴土壤樣品(MZ)的真菌多樣性，比較健康石榴根際真菌與石榴枯萎病根際真菌及間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際真菌多樣性的差異，初步探索通過間作桃樹改變石榴園的真菌生物多樣性控制石榴枯萎病的機(jī)理，為開展微生態(tài)調(diào)控土傳病害的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 石榴根際土樣的采集

石榴根際土樣采集方法同文獻(xiàn)[12]。

1.2 石榴根際土壤基因組DNA的提取及文庫構(gòu)建

用OMEGA試劑盒提取土壤基因組DNA，PCR擴(kuò)增土壤真菌 ITS1區(qū)，引物ITS5-1737F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITS2-2043R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR產(chǎn)物用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測并回收。構(gòu)建好的文庫檢測合格后使用MiSeq進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

對Illumina MiSeq測序平臺得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，除去干擾分析的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)[14-16]?；谟行?shù)據(jù)(Clean Data)進(jìn)行系列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種類型根際土壤真菌的OTU分析及物種注釋

基于OTUs中的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋分析[17]，統(tǒng)計(jì)每個樣品在各分類水平上的序列數(shù)目，3種土壤MZD、MZ、MZP在界水平上的平均序列數(shù)目分別為35 697、37 048、34 888；MZD、MZ、MZP在門水平上的平均序列數(shù)目分別為32 865、34 698、28 714；MZD、MZ、MZP在綱水平上的平均序列數(shù)目分別為31 119、30 723、27 622；MZD、MZ、MZP在目水平上的平均序列數(shù)目分別為31 117、30 722、27 622；MZD、MZ、MZP在科水平上的平均序列數(shù)目分別為30 996、30 617、27 051；MZD、MZ、MZP在屬水平上的平均序列數(shù)目分別為30 901、30 514、27002。

基于物種注釋結(jié)果，最大相對豐度排名前十的科(Family)分別是：叢赤殼科(Nectriaceae)，Un--s-Fungi sp，Un--s-Ascomycota sp MA5351，毛殼菌科(Chaetomiaceae)，肉座菌科(Hypocreaceae)，發(fā)菌科(Trichocomaceae)，被孢霉科(Mortierellaceae)，Un--s-Trechisporales sp，Un--s-Ascomycota sp，Un--s-Xylariales sp。生成的物種相對豐度分布柱形圖見圖1，其中豐度較高的是叢赤殼科，約占25%。

圖1 科水平上豐度前10的物種相對豐度

根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果，3種不同土壤樣品之間OTUs的特有、共有信息用韋恩圖展示(圖2)?？菸∈裢寥?MZD)、健康石榴土壤(MZ)、間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)的OTUs數(shù)分別為1174、1076、1007個，健康石榴土壤(MZ)特有OTUs數(shù)為47個，間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)特有OTUs數(shù)為94個，枯萎病石榴土壤(MZD)特有OTUs數(shù)為152個，枯萎病石榴土壤(MZD)、健康石榴土壤(MZ)、間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)共有的OTUs數(shù)為635個。

圖2 不同類型土壤真菌的韋恩圖

2.2 3種類型根際土壤真菌微生物多樣性及物種豐度聚類

2.2.1 門水平上3種類型根際土壤真菌多樣性 MZP、MZD、MZ 3種根際土壤真菌多樣性在門水平上的豐度比較見圖3，MZP3中Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-Fungi_sp、球囊菌門(Glomeromycota)相對豐度較高，Un--s-fungal_endophyte、子囊菌門(Ascomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025相對豐度較低；MZP1中擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-fungal_sp WEF9相對豐度較高，子囊菌門(Ascomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025、Un--s-fungal_sp F490a相對豐度較低；MZP2中Un--s-fungal_endophyte sp ECD_2008、Un--s-fungal_endophyte、Un--s-fungal_endophyte sp AP053相對豐度較高，Un--s-fungal_sp 7 RU025、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)相對豐度較低；MZ3中Un--s-fungal_sp ARIZ AZ0515、Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_sp TRN436相對豐度較高，Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_endophyte、Un--s-fungal_sp KRP24相對豐度較低；MZD3中Un--s-fungal_sp NLR_2013、Un--s-fungal_sp FF_2011、Un--s-fungal_endophyte相對豐度較高，Un--s-fungal_sp F490a、Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_sp TRN436相對豐度較低；MZD2中Un--s-fungal_sp KRP24、Un--s-root_associated_fungal sp EP1_6、Un--s-fungal_endophyte sp SS_1519相對豐度較高，Un--s-fungal_sp F490a、Un--s-fungal_sp WEF9、Un--s-fungal_sp TRN436相對豐度較低；MZD1中Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_sp ASR_213、Un--s-fungal_sp F490a相對豐度較高，Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-Fungi_sp相對豐度較低；MZ2中Un--s-Rickiella_edulis、Un--s-fungal_sp ARIZ L453、Un--s-fungal_sp ASR_213相對豐度較高，Un--s-fungal_sp FF_2011、Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_sp F174相對豐度較低；MZ1中子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025相對豐度較高，Un--s-fungal_sp KRP24、Un--s-fungal_endophyte sp AP053、Un--s-fungal_sp WEF9相對豐度較低。

圖3 門水平上3種類型根際土壤真菌的物種豐度聚類圖

2.2.2 屬水平上3種類型根際土壤真菌多樣性 在屬的分類水平，共鑒定到481屬真菌，對3種類型土壤鑒定到的真菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，3種類型土壤的真菌在屬的分類水平上存在顯著差異性：石榴枯萎病根際土壤(MZD)與間作桃樹修復(fù)枯萎病石榴土壤(MZP)差異顯著的真菌屬有47個:包括Un--s-Fungisp.，Un--s-Chaetomiaceaesp.，F(xiàn)usicolla，Un--s-Mortierellalessp.，Un--s-Hypocrealessp.，Un--s-Lasiosphaeriaceaesp.，Remersonia，Un--s-Herpotrichiellaceaesp.，Un--s-Microascalessp.，翅孢殼屬(Emericellopsis)，殼針孢屬(Septoria)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，Wardomycopsis，透孢黑團(tuán)殼屬(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉屬(Mortierella)等;間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病土壤(MZP)與蒙自健康石榴土壤樣品(MZ)真菌差異顯著的屬有21個：Fusicolla，Un--s-Hypocrealessp.，Un--s-Cordycipitaceaesp.，Un--s-Microascalessp.，殼針孢屬(Septoria)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，透孢黑團(tuán)殼屬(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉屬(Mortierella)等(表1)。

表1 屬水平上3種類型根際土壤真菌多樣性部分統(tǒng)計(jì)

2.3 3種類型土壤根際真菌群落組成的主成分分析

為了能夠更加直觀地揭示在石榴園枯萎病發(fā)生區(qū)間作桃樹對土壤真菌群落組成結(jié)構(gòu)的影響，用PCA(Principal Component Analysis，PCA)分析了3種類型土壤根際真菌群落組成[18]，結(jié)果見圖4，對樣品差異的貢獻(xiàn)值第一主成分為24.54%，第二主成分為15.71%，栽種桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP1、MZP2、MZP3)的真菌微生物群落組成基本聚在了一起，群落組成較相似；健康石榴根際土壤樣品(MZ1、MZ2、MZ3)的真菌微生物群落組成距離較近，也基本聚在了一起；3個石榴枯萎病根際土壤樣品(MZD1、MZD2、MZD3)的真菌微生物群落組成差異相對較大，在PC2軸上的距離相對較遠(yuǎn)，分析原因可能與3個土壤樣品采樣地域跨度較大有關(guān)。土壤真菌群落組成在石榴枯萎病根際與栽種桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際組成差異較大，在PC1軸上距離相對較遠(yuǎn)。PCA的分析結(jié)果說明，間作桃樹能較大程度改變石榴枯萎病根際土壤真菌的群落組成。

圖4 3種土壤真菌的 PCA 分析

3 討 論

已有的研究表明，病害發(fā)生在一定程度上受土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響[19]，病菌侵染甚至可通過改變相對豐度和菌種組成影響根系內(nèi)生菌根真菌群落結(jié)構(gòu)[20]。利用高通量測序方法研究土壤根際真菌多樣性近年來有較多報道，楊光柱等[21]分析了蘋果樹土壤根際真菌多樣性，結(jié)果表明患病土樣中部分有益菌低于健康土壤，蘋果根腐病病原菌高于健康土壤，說明根際土壤真菌群落的平衡被打破會影響土壤的健康。王琪等[22]分析了間作蠶豆與單作羌活根際土壤微生物活性，結(jié)果表明蠶豆間作有效改善土壤微環(huán)境，促進(jìn)羌活次生代謝產(chǎn)物的積累，提高羌活藥材產(chǎn)量和質(zhì)量，有研究表明小麥蠶豆間作能不同程度增加小麥、蠶豆生物量和磷素吸收累積[23]，提高土壤微生物代謝活性[24]，甘蔗玉米間作可提高土壤微生物多樣性[25]，西瓜套作大蒜對西瓜有一定的促生作用，且減少了西瓜枯萎病發(fā)病率[26]，玉米大豆帶狀套作體系中，植株氮、磷、鉀養(yǎng)分吸收總量比相應(yīng)單作提高，帶狀套作提高了玉米大豆對養(yǎng)分的吸收利用，有套作產(chǎn)量優(yōu)勢[27]，間作能改善梔子根際微生物群落結(jié)構(gòu)，同時提高土壤綜合肥力[28]。之前的研究表明石榴根際細(xì)菌的多樣性間作桃樹之后也得到了改善[12]，本文的研究表明真菌群落組成在間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)與石榴枯萎病根際土壤樣品(MZD)之間差異較大，在屬的分類水平上，2種類型土壤有47個屬的真菌存在顯著差異，說明石榴枯萎病根際的真菌多樣性及土壤微生態(tài)平衡能通過間作桃樹得到改善。

4 結(jié) 論

真菌群落組成在間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)與石榴枯萎病根際土壤(MZD)之間有差異較大，石榴枯萎病根際土壤真菌的群落組成通過間作桃樹能較大程度改變。3種類型根際土壤共鑒定到481種真菌屬，間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病土壤(MZP)與蒙自健康石榴土壤樣品(MZ)真菌差異顯著的屬有21個:殼針孢屬(Septoria)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，透孢黑團(tuán)殼屬(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉屬(Mortierella)等。石榴石榴枯萎病根際土壤(MZD)與間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病土壤(MZP)差異顯著的真菌屬有47個:翅孢殼屬(Emericellopsis)，殼針孢屬(Septoria)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，Wardomycopsis，透孢黑團(tuán)殼屬(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉屬(Mortierella)等。2種根際土壤中的真菌差異顯著，說明在石榴枯萎病發(fā)生園區(qū)土壤真菌的群落組成及多樣性能通過間作桃樹得到改善，為應(yīng)用間作桃樹改善石榴枯萎病土壤的真菌多樣性控制石榴枯萎病的發(fā)生及擴(kuò)散提供的參考。