田夏瓊，關(guān)統(tǒng)偉，王淑英，汪蘭云，張迎春, 李 峻

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都 610039；2.西寧市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，西寧 810016；3.青海魯源農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，西寧 810000)

【研究意義】20世紀以來，為提高農(nóng)作物產(chǎn)量，化肥被長期使用，這種依賴已經(jīng)導(dǎo)致日益嚴重的農(nóng)業(yè)問題[1]，如土壤中微量元素含量下降、土壤結(jié)構(gòu)被破壞等[2]。由于高原土壤水土流失，養(yǎng)分貧瘠等問題較嚴重，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力持續(xù)下降[3]，迫切需要有效的施肥制度來改善突然質(zhì)量?！厩叭搜芯窟M展】化肥與有機肥配施已被認為是修復(fù)被破壞土壤以及維持土壤可持續(xù)利用的有效施肥措施[4]。有機肥處理能提高土壤中有機物質(zhì)的含量[5]，保證農(nóng)作物生長養(yǎng)分的持久供給。此外，在化肥的基礎(chǔ)上施加有機肥能增強農(nóng)作物抗病蟲和抵抗不良環(huán)境的能力，同時，對分解土壤中難溶的磷、鉀化合物，促進營養(yǎng)元素的吸收和有機碳的穩(wěn)定也都有重要作用[6]。土壤細菌作為連接土壤和植物的紐帶，是維持土壤肥力可持續(xù)性以及評價土壤質(zhì)量的潛在指標[7-8]，且對土壤生態(tài)系統(tǒng)有很好的調(diào)節(jié)作用[9]。細菌豐富度和多樣性是土壤細菌群落的關(guān)鍵指標，很容易受到施肥制度的影響[10]，已有學(xué)者闡述了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與施肥方式的關(guān)聯(lián)。施用有機肥能提高土壤細菌多樣性，化肥則使細菌多樣性顯著降低[11]。相比化肥，有機肥可以迅速提高土壤細菌數(shù)量和種類，從而改善土壤的生態(tài)環(huán)境[12]。在農(nóng)田中適當添加有機肥可促進細菌的活動和作物生長，對植物根際細菌的擴散和活性也有積極影響[13]。此外，土壤環(huán)境因子也是引起土壤微生物結(jié)構(gòu)改變的重要指標[14]。據(jù)報道，土壤含水量、有機質(zhì)及全氮是影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子[15]。因此系統(tǒng)的探究增施不同處理對土壤養(yǎng)分及細菌群落的影響以及兩者之間的關(guān)系對制定最佳施肥方式，提高土壤質(zhì)量具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c】當前，有機肥對土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響多為常年田間試驗[16]，針對短期大量增施有機肥對高原農(nóng)業(yè)土壤的微生物群落和土壤養(yǎng)分的影響尚少見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文以青海西寧的農(nóng)業(yè)土壤為研究對象，探究短期大量增施有機肥對高原土壤理化性質(zhì)和土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在明確在短期有機肥作用下是否可以快速提高土壤養(yǎng)分并且優(yōu)化細菌群落結(jié)構(gòu)，為農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗區(qū)位于青海省西寧市多巴鎮(zhèn)(36°38′43′′N, 101°35′36′′E)，地處湟水河中游，是黃土高原與青藏高原過渡地帶，屬青藏高原山川地帶。試驗地點海拔2201～2822 m，年平均氣溫4.6 ℃，晝夜溫差大，年最厚凍土層1.5 m，年平均降水量570 mm，全年無霜期140～150 d。試驗前土壤pH 8.72，有機質(zhì)11.3 g/kg，全氮0.82 g/kg，速效磷85.60 mg/kg，速效鉀142.72 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗區(qū)土壤有3種施肥處理：①對照(XN001)：施加100%常規(guī)復(fù)合化肥1000 kg/hm2(氮)；②處理1(XN002)：50%常規(guī)復(fù)合化肥+有機肥；③處理2(XN003)：25%常規(guī)復(fù)合化肥+有機肥。有機肥和化肥均以底肥的形式一次性施入。每種處理的施肥量由表1所示。試驗處理土壤面積為90 m2；每個處理設(shè)置3個重復(fù)；農(nóng)作物為西葫蘆。2018年開始，連續(xù)施肥2年后采集土樣進行土壤化學(xué)性質(zhì)檢測及高通量測序。本試驗施用的有機肥和復(fù)合化肥均由成都華宏生物科技有限公司提供。

表1 不同施肥處理的養(yǎng)分投入量

1.3 樣品采集

采樣時間為2020年8月，使用五點法進行采樣，收集3個重復(fù)樣本的采樣點土壤(1～30 cm)土層，每個處理共計15個土樣；去除根系、雜草等雜質(zhì)，再將其充分混合后。將每個土壤樣本平均分成兩份，一份置于-80 ℃冰箱保存，用于DNA 的提??；另一份自然風干過篩后用于理化指標的測定。

1.4 土壤理化參數(shù)測定

土壤pH測定采用酸度計法(土水比1.0∶2.5)；土壤全氮的測定采用半微量凱氏定氮法；土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的測定采用0.01 mol/L CaCl2浸提—流動分析儀測定；土壤有效磷的測定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法；有效鉀的測定采用1 mol/L NH4Ac浸提—原子吸收火焰光度法；有機質(zhì)測定采用濃硫酸—重鉻酸鉀消煮—硫酸亞鐵滴定法[17]。所有理化性質(zhì)的測定重復(fù)3次，結(jié)果用平均標準偏差表示。

1.5 土壤DNA提取和PCR擴增

采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取土壤DNA，具體操作按說明書使用。所提取的總DNA于-20 ℃保藏備用。

PCR所用的引物為測序平臺的V3～V4通用引物341F(5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA ATTCCA-3′)，第一輪擴增體系如下：2×Taqmaster Mix 15 μL，Bar-PCR primer F(10 μmol/L)1 μL，Primer R(10 μmol/L)1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，H2O add to 30 μL。第一輪反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；5個循環(huán)(94 ℃ 30 min，45 ℃20 s，65 ℃30 s)；25個循環(huán)(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃延伸5 min。第二輪擴增體系為：2×Taqmaster Mix 15 μL，Primer F(10 μmol/L)1 μL，Primer R(10 μmol/L)1 μL，PCR products(上一輪)20 ng，H2O add to 30 μL。第一輪反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；5個循環(huán)(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃延伸5 min。

1.6 高通量測序及數(shù)據(jù)處理

PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。所有序列都保存在NCBI的SRA(Sequence Reads Archive)數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號為SRR10559325、SRR10559324和SRR10559323。對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行質(zhì)控過濾；使用Usearch 5.2.236去除預(yù)處理后序列中非擴增區(qū)域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并調(diào)用Uchime 4.2.40進行鑒定嵌合體，得到最終有效數(shù)據(jù)；Microsoft Excel 2019對數(shù)據(jù)進行整理；用Mothur 1.30.1分析細菌群落的豐富度和多樣性；SPSS 21.0進行Pearson相關(guān)性分析；PICRUST軟件用于KEGG功能預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增施有機肥對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

不同施肥處理對土壤的化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生了影響(表2)。土壤pH由8.41降至7.62，在3種處理下差異顯著。在XN003處理下，土壤中有機質(zhì)、全氮、有效磷、有效鉀含量顯著高于XN001，分別提高了117.21%、51.72%、27.45%、20.92%。有效銅、有效鐵含量也隨著有機肥的施用而增加。

表2 不同施肥處理對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

2.2 增施有機肥對土壤細菌豐度和多樣性的影響

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)可用來反映微生物群落物種豐富度，數(shù)值越大，表明群落豐富度越高。由表3得出，XN002處理下的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)比XN001分別高出0.44%、0.04%。XN003表現(xiàn)出的豐富度指數(shù)最高，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)分別為19363.59、30121.25，比XN001高出6.69%和4.45%。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用來估算樣本中的微生物的多樣性，前者數(shù)值越大，后者數(shù)值越小說明群落多樣性越高。發(fā)現(xiàn)在XN002處理下，Shannon 指數(shù)降低，Simpson 指數(shù)升高，土壤細菌多樣性相比對照有所下降。XN003處理下的土壤細菌多樣性有一定提高，但差別不大，提高了0.1個單位。

表3 不同樣本土壤細菌Alpha指數(shù)差異

2.3 增施有機肥對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

3個樣本共歸類到30個門(圖1)，XN001、XN002、XN003處理下分別歸類到26、27、28個門。占比較高(相對豐度>5%)的5個菌門，包括變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，平均相對豐度分別為42.36%、11.66%、10.62%、10.39%、5.20%。其中，變形菌門在XN002和XN003處理下的相對豐度相比XN001分別高出20.7%和13.97%。酸桿菌門在XN001處理下的豐度為11.90%，在XN003處理下為14.89%，比XN001處理提高了3.99%。放線菌門在XN001處理的相對豐度為16.49%，XN002處理為9.01%，XN003處理為5.66%，分別降低了7.48%和10.83%。門水平上相對豐度在1%以上的細菌的有浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)，分別占比3.17%、2.51%、1.59%、1.22%。施加有機肥降低了放線菌門的豐度，提高了變形菌門、酸桿菌門的豐度。

圖1 細菌在門水平上的相對豐度

3個樣本共歸類到501個屬(圖2)，XN001處理下歸類到357個屬，XN002處理下有402個屬，XN003處理下有362個屬。占比例較高(相對豐度>5%)的2個菌屬是鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和芽單胞菌屬(Gemmatimonas)，分別平均占到所有菌屬的6.20%和5.20%。鞘氨醇單胞菌屬在XN001處理下的相對豐度為4.78%，在XN002和XN003處理下的相對豐度分別為6.32%和7.51%，提高了1.54%和2.73%。芽單胞菌屬的相對豐度在XN001處理下為6.95%，XN002和XN003處理分別比XN001處理減少了4.19%和1.05%。在屬水平上相對豐度大于1%的有溶桿菌屬(Lysobacter)、藤黃色單胞菌屬(Luteimonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、GP6、Ohtaekwangia、GP4、GP16、GP7。鞘氨醇單胞菌屬在3種處理中都是相對豐度較高的屬，有機肥施用量越大，鞘氨醇單胞菌屬和假單胞菌屬的相對豐度越高。除此之外，其他類群的相對豐度也發(fā)生變化，施用有機肥均降低了芽單胞菌屬的相對豐度，增加了假單胞菌屬、溶桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度。

圖2 細菌在屬水平上的相對豐度

2.4 土壤細菌多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性

由Pearson相關(guān)性分析(表4)發(fā)現(xiàn)，土壤細菌群落的豐富度和多樣性與有機質(zhì)、全氮、有效磷、有效鉀、有效銅、有效鐵呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在0.074～0.953。細菌豐富度與有機質(zhì)的相關(guān)性最高，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)與有機質(zhì)的相關(guān)系數(shù)分別為0.953、0.936，與其他環(huán)境因子的相關(guān)性也較強。土壤細菌的豐富度和多樣性與pH呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在0.149～0.877。其中多樣性指數(shù)(香農(nóng)指數(shù))與有機質(zhì)、pH、全氮、有效磷和有效銅的相關(guān)性較強。

表4 土壤細菌群落α-多樣性指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)之間的Pearson相關(guān)性

2.5 KEGG功能預(yù)測

2.5.1 XN001和XN002處理土樣 KEGG 代謝途徑差異分析 本研究通過對檢測到的329個3級KEGG直系同源物的整理，比較了不同施肥方式下KEGG代謝途徑的主要功能基因(圖3)，發(fā)現(xiàn)增施有機肥處理與對照組處理下的土壤細菌代謝功能差異顯著。在XN002處理下,谷胱甘肽代謝、孔隙離子通道、乙醛酸和二羧酸代謝、光合作用蛋白等功能基因的豐度明顯高于對照組。葉綠素等功能基因豐度在小范圍有所下降。以上結(jié)果表明增施有機肥處理影響了土壤的代謝途徑，一部分有益功能基因的表達增強，代謝途徑得到進一步推動。

圖3 增施有機肥(XN001→XN002)處理下KEGG代謝途徑差異

2.5.2 XN002和XN003處理土樣 KEGG 代謝途徑差異分析 以XN003施肥方案處理的土壤細菌KEGG代謝途徑變化顯著(圖4)。分析發(fā)現(xiàn)，XN003與XN002相比，復(fù)制、重組和修復(fù)功能得到較強的提升。此外，嘌呤嘧啶代謝、糖基轉(zhuǎn)移酶等功能基因也有一定程度的上調(diào)。而一些疾病合成以及丙酮酸代謝等功能基因的豐度小幅度降低。值得關(guān)注的是，在進一步大量增施有機肥的情況下，乙醛酸和二羧酸代謝基因有一定范圍內(nèi)的下調(diào)。

圖4 增施有機肥(XN002→XN003)處理下KEGG代謝途徑差異

3 討 論

3.1 大量增施有機肥對土壤養(yǎng)分的影響

土壤有機質(zhì)能反應(yīng)土壤肥力高低，在農(nóng)作物生長中發(fā)揮重要作用[18]。Wang等[19]通過20年長期田間試驗發(fā)現(xiàn)在有機肥處理下，有機質(zhì)含量從8 g/kg增加到約16 g/kg，提高了100%。本研究結(jié)果顯示在2年有機肥處理下，有機質(zhì)含量水平提高了117.21%，一定程度上驗證了通過短期增施有機肥提高土壤肥力的可行性。土壤pH受施肥制度的影響[20]，在pH大于8.11的堿性土壤中，長期施用有機肥使其pH降至7.82[21]，而在弱酸性土壤條件下，施加有機肥則使土壤pH從6.73恢復(fù)至7.07[22]。本實驗顯示增施有機肥使得強堿性土壤(pH=8.41)恢復(fù)至接近中性(pH=7.62)，這可能歸因于施肥刺激硝化反應(yīng)和H+的釋放[23]，另一方面可能是由于有機肥中有機酸積累所致[24]。綜合以上分析，有機肥可能具有調(diào)節(jié)土壤酸堿性的潛力，其中的調(diào)節(jié)機制在未來值得進一步研究。此外，土壤的有效鉀、有效磷、全氮含量在增施有機肥處理下均明顯提升，與前人給出的研究結(jié)果一致[25-26]。通常，氮、磷、鉀等是控制生物圈中有機物循環(huán)的主要營養(yǎng)元素[27]，其中磷還被認為是土壤代謝途徑的關(guān)鍵元素[28]，本研究發(fā)現(xiàn)的一部分代謝途徑的增強可能在一定程度上得益于以上微量元素含量的增加。而銅和鐵能促進農(nóng)作物的光合作用和提高農(nóng)作物抗病、抗寒、抗旱和抗熱的能力，增施有機肥提高了土壤中有效銅和有效鐵含量，且含量值低于對土壤造成重金屬污染的臨界值(12.23 mg/kg)[29]，這對高原農(nóng)作物的生長有積極作用。

3.2 細菌群落結(jié)構(gòu)受施肥制度的影響

本研究通過對3種施肥方式下土壤細菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，在短期條件下，有機肥的增施的確影響了土壤的細菌群落。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)的變化都反映了土壤細菌豐富度在短期內(nèi)與有機肥施加量成正比關(guān)系，這一結(jié)論符合眾多研究有機肥對細菌群落結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果[30]。然而在多樣性方面，有機肥似乎發(fā)揮了反作用。在XN002處理下，細菌多樣性明顯降低，XN003處理下細菌多樣性與對照基本保持一致，這與Tian等[31]的研究結(jié)果類似。細菌多樣性降低的情況可能與有機肥施用量有關(guān)，大量的有機肥本身帶入的細菌刺激了土壤細菌群落的穩(wěn)定性，導(dǎo)致某些對外源細菌類群有抵抗作用的微生物大量繁殖，從而促使了細菌多樣性的下降，這也解釋了2級水平上外源生物降解和代謝等功能基因的上調(diào)。盡管短期有機肥施加對細菌多樣性的影響并不顯著，但幾種有益菌豐度的增加還是為土壤質(zhì)量帶來了積極影響。酸桿菌門和變形桿菌門在有機肥處理下的豐度高于化肥處理，這將為有機碳、氮、磷和硫化合物的轉(zhuǎn)化提供動力[32]。另外，酸桿菌門對銅和鎳等重金屬有很強的耐受性[33]，對被重金屬污染的土壤可能起到一定的修復(fù)作用。優(yōu)勢的變形菌門則可提高土壤細菌對測試樣本高原不良環(huán)境的變化適應(yīng)能力[34]。鞘氨醇單胞菌屬以代謝復(fù)雜的有機污染物而聞名[35]，這對減少土壤污染，推進污染物降解和提高土壤質(zhì)量做出了貢獻。假單胞菌屬具有的防病害功能[36]，也在一定程度上起到對農(nóng)作物健康生長的保護作用。

3.3 細菌群落與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)土壤pH、有機質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀、有效銅、有效鐵含量影響了細菌群落結(jié)構(gòu)，其中有機質(zhì)是驅(qū)動細菌群落結(jié)構(gòu)變化的最重要因素。有機質(zhì)能被分解為土壤細菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，在養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)生作用[37]，因此，土壤細菌的豐富度和多樣性與有機質(zhì)呈強烈的正相關(guān)。眾多研究表明pH也是影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的又一重要因素[38-39]。本研究中，土壤細菌豐富度與pH呈強烈負相關(guān)，pH下降促進了土壤細菌豐度的提高。這可能是由于土壤中原本存在一部分對pH有強烈依賴的細菌，這或許可以很好的解釋放線菌門豐度的降低，因為放線菌被報道通常存在于極端土壤條件下，對pH要求極高[40]。此外，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與全氮、有效磷、有效鉀、有效銅和有效鐵含量均呈正相關(guān)，這與前人研究結(jié)果不謀而合[41]。因此，可以推測通過農(nóng)田土壤施用有機肥能夠改變土壤的環(huán)境因子，進而影響土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)，反之，細菌也為分解養(yǎng)分做出貢獻[42]，這種良性循環(huán)營造了可持續(xù)土壤生態(tài)環(huán)境。

3.4 增施有機肥對細菌功能的影響

KEGG代謝途徑分析結(jié)果表明，短期增施有機肥可增強土壤細菌的代謝以及傳輸?shù)裙δ堋＿@與長期有機肥處理下的土壤代謝途徑結(jié)果相似[43]，表明有機肥對土壤代謝途徑的有利影響并不受到時間的限制。銅綠假單胞菌和嗜冷假單胞菌已被報道可促進γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的分泌，從而合成谷胱甘肽[44-45]。本研究有機肥的增施使得豐度提高的假單胞菌作為介導(dǎo)，促進了谷胱甘肽的代謝，其在抵抗外源物質(zhì)對農(nóng)作物毒害方面發(fā)揮著重要作用[46]。此外，孔隙離子通道功能基因的加強使得農(nóng)作物能夠更好的吸收或外排礦物質(zhì)營養(yǎng)素，以維持營養(yǎng)平衡并調(diào)節(jié)生理功能。糖類物質(zhì)對光合作用的反饋尤其重要，有機肥增施刺激糖類物質(zhì)釋放可能是光合作用蛋白基因?qū)τ袡C肥敏感的原因[47-48]。乙醛酸和二羧酸代謝連接著嘌呤代謝、甘氨酸和蘇氨酸等代謝，在平衡植物及微生物代謝發(fā)揮關(guān)鍵作用[49]，XN003處理降低了乙醛酸和二羧酸代謝基因豐度，對土壤的養(yǎng)分循環(huán)和生態(tài)穩(wěn)定有不利影響。

4 結(jié) 論

有機肥替代部分化肥后，土壤養(yǎng)分含量和細菌多樣性得到了提高。土壤細菌豐富度以及功能基因豐度在持續(xù)大量有機肥(XN003)刺激下表現(xiàn)出削弱的趨勢。因此，在本研究條件下，以50%的化肥配施30 000 kg/hm2的有機肥足夠讓高原土壤的養(yǎng)分含量提高，并改善土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果反映出了短期大量增施有機肥在施肥方案上的潛力，然而未來還需在本研究的基礎(chǔ)上對有機肥與化肥的精準配施比做更深入的研究，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)支持。