李哲,蔡方舟,李丹,陳倩,苑一真,王衛(wèi)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物研究所,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗室,衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室,北京 100021)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、甲型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)等慢性病毒感染威脅全球人類健康,是全球公共安全的重要威脅[1-2],亟待研發(fā)能有效抑制慢性病毒感染的策略。具有高頻突變特點(diǎn)的廣譜中和抗體(broadly neutralizing antibodies,bNAbs)被證明可抑制特定病毒的多種突變毒株[3],成為控制慢性病毒感染的希望所在。體細(xì)胞高突變(somatic hypermutation,SHM)是指抗體可變區(qū)(variable region,V)基因發(fā)生高頻率點(diǎn)突變[4],增加抗體基因的遺傳多樣性和親和力[5],是bNAbs 誘導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此,SHM 為抗體親和力成熟和抗體多樣性的產(chǎn)生提供了分子基礎(chǔ),也是優(yōu)化抗體依賴性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[6]。

盡管進(jìn)行了多年的深入研究,但影響抗體基因發(fā)生SHM 以及SHM 靶向機(jī)制尚不清楚,原因之一是缺乏可用于SHM 研究的動物模型。建立可用于SHM 研究的動物模型具有重要意義,淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒克隆13 (lymphocytic choriomeningitis virus clone 13,LCMV-CL13)感染,作為全身性慢性病毒感染模型被廣泛使用,并被用于研究驅(qū)動人類慢性病毒感染的機(jī)制[7-8]。為了深入探究SHM 發(fā)生機(jī)制,本文使用LCMV-CL13 病毒尾靜脈感染C57BL/6N 小鼠,分析感染小鼠中出現(xiàn)持續(xù)的生發(fā)中心(germinal center,GC)反應(yīng),及B 細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)V 基因的突變情況,分析其作為B 細(xì)胞受體高頻突變研究模型的可能性,以期為SHM 實(shí)驗研究提供借鑒,同時為抗體生成、進(jìn)化機(jī)制研究奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

80 只SPF 級雌性C57BL/6N 小鼠,周齡為6～8 周,體重約18～22 g,購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】。實(shí)驗動物的飼養(yǎng)及實(shí)驗操作在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物研究所動物生物安全二級實(shí)驗室(ABSL-2)【SYXK(京)2019-0039】進(jìn)行。飼養(yǎng)及實(shí)驗環(huán)境:室內(nèi)溫度22～25℃,濕度40%～70%,12 h 光照/黑暗循環(huán);動物在籠內(nèi)自由攝食飲水。本實(shí)驗過程遵循3R 原則,已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物研究所實(shí)驗動物使用與管理委員會(IACUC)的批準(zhǔn)(WW21001)。

1.1.2 病毒株

淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒克隆13 株(lymphocytic choriomeningitis virus clone13,LCMVCL13)由第三軍醫(yī)大學(xué)葉麗林教授贈送,由本課題組擴(kuò)增。擴(kuò)增后的病毒液經(jīng)RNA 提取及PCR 擴(kuò)增后送由中美泰和公司測序鑒定為目的序列,噬斑法檢測病毒滴度為1.72 × 107PFU/mL。

1.1.3 主要試劑與儀器

RPMI 1640 培養(yǎng)基(Gibco:C22400500BT)、PBS(Gibco:C10010500BT)、GK1.5 抗體(Bio X cell:BE0003-1-100)、抗凝劑(索萊寶:G0280)、RNA 提取試劑盒(RNeasy Mini Kit:74104)、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit:K1632)、實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒(TB Green?Premix Ex TaqTMII:RR820A)、總RNA 提取試劑盒(Mag MAXTMmir VanaTMTotal RNA Isolation Kit:A27828)、BCR 建庫試劑盒(KC-DigitalTMStranded BCR-seq Library Prep Kit for Illumina,DT0811-02,Seq Health)、紅細(xì)胞裂解液(BD FACSTMLysing Solution:349202),流式抗體及染色方案見表1。

表1 抗體使用一覽表Table 1 List of used antibodies

高速冷凍型離心機(jī)(SCILOGEX,美國)、多用途冷卻離心機(jī)(HITACHI,日本)、普通PCR 儀T100TMThermal Cycler(Bio-Rad,美國),實(shí)時熒光定量PCR儀Quant StudioTM3 Real-Time PCR System(Applied BiosystemsTM,美國)、流式儀型號為BD FACS Aria II(BD,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及感染

80 只C57BL/6N 小鼠分成兩組。其中70 只為實(shí)驗組,用于感染模型構(gòu)建;10 只設(shè)立為對照組。實(shí)驗組C57BL/6N 小鼠感染前1 d 腹腔注射500 μg CD4 抗體,感染當(dāng)天經(jīng)尾靜脈注射LCMV-CL13 病毒2 × 106PFU,感染后第2 天再次經(jīng)腹腔注射500 μg CD4 抗體[9];對照組小鼠經(jīng)腹腔及尾靜脈注射同等體積的PBS。

1.2.2 LCMV-CL13 感染小鼠體重監(jiān)測

C57BL/6N 小鼠感染后,每日觀察小鼠臨床表現(xiàn),包括一般狀況、體態(tài)、毛發(fā)、飲食、活動、排便等。感染后前15 d 每天稱重1 次,感染15 d 后每4 d 稱重1 次。

1.2.3 組織采集

病毒感染后第10、20、30、40、50、60、70 天收集動物血液及組織樣本。具體地,從小鼠眼眶靜脈叢取血100 μL 置于裝有10 μL EDTA.2K 抗凝劑(10X)的EP 管中,用于流式檢測;排盡血液后,脫頸椎處死小鼠收集腸、腎、肝、腦組織,用于病毒載量檢測;收集脾充分研磨制備單細(xì)胞懸液,用于流式檢測。

1.2.4 組織病毒載量檢測

使用RNA 試劑盒提取小鼠腸、腎、肝、腦組織RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA,采用SYBR Green 染料法檢測組織中LCMV-CL13 病毒載量[9]。

1.2.5 外周血淋巴細(xì)胞比例檢測

取小鼠外周血100 μL 置于流式管中,同時加入流式熒光抗體CD45-FITC、CD3-PerCP/Cyanine5.5、CD4-PE、CD8a-APC 和CD19-PE/Cyanine7 各5～10 μL,室溫避光孵育30 min,裂解紅細(xì)胞,PBS 洗滌2次,2%多聚甲醛固定,流式上機(jī)檢測熒光信號。

1.2.6 脾淋巴細(xì)胞比例檢測

取小鼠脾置于RPMI 1640 不完全培養(yǎng)基充分研磨,經(jīng)70 μm 濾網(wǎng)過濾、裂解紅細(xì)胞,制備獲得單細(xì)胞懸液。加入流式熒光抗體CD45R/B220-FITC、CD19-PerCP/Cyanine5.5、GL7-PE、CD95(FAS)-APC各5～10 μL;冰上避光孵育20 min,2%多聚甲醛固定,流式上機(jī)檢測熒光信號。采用Flow Jo V10 對多色流式細(xì)胞儀上機(jī)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.7 免疫組庫建庫、測序

制備小鼠脾單細(xì)胞懸液,分離淋巴細(xì)胞,由武漢康測科技有限公司進(jìn)行建庫、測序。具體地,提取細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄獲取單鏈cDNA、UID(Unique Identifier)標(biāo)記、使用免疫球蛋白亞型(IgM、IgA、IgG、IgD、IgE、IgK 和IgL) 的 特異 性引 物(gene specific primer,GSP)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和文庫構(gòu)建,運(yùn)用高通量測序技術(shù)檢測靶向擴(kuò)增后B 細(xì)胞CDR3區(qū)域[10]。

1.2.8 生物信息學(xué)分析

首先,使用MiXCR(v3.0.3)軟件[11],將糾錯和去重后的數(shù)據(jù)與國際免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫IMGT(http://www.imgt.org)的V、D、J 基因片段進(jìn)行比對[12]。獲取比對結(jié)果并開展后續(xù)深度分析。其次,數(shù)據(jù)多樣性指標(biāo)至關(guān)重要,多樣性與免疫應(yīng)答密切相關(guān)[13]。采用Shannon entropy 指數(shù)[14]計算樣本IGH 組成多樣性,Shannon entropy 值越大,說明樣本多樣性越高。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LCMV-CL13 病毒在小鼠體內(nèi)維持慢性感染狀態(tài)

為了解LCMV-CL13 病毒對C57BL/6N 小鼠的致病情況,每天觀察小鼠疾病表現(xiàn),監(jiān)測體重變化,小鼠感染后第7 天出現(xiàn)明顯疾病表現(xiàn),如豎毛、弓背、體重下降等癥狀,感染后21 d 體征逐漸恢復(fù);在感染后32 d 體重下降最為明顯,并再次出現(xiàn)明顯豎毛、弓背、體重下降等癥狀,感染后40 d 體征逐漸恢復(fù),可能受自身免疫反應(yīng)影響[15],感染后實(shí)驗組動物較對照組體重明顯下降(P＜0.0001),說明病毒感染可對小鼠致病(圖1A)。為檢測LCMV-CL13病毒在C57BL/6N 小鼠體內(nèi)的復(fù)制擴(kuò)增情況,每10 d采集小鼠腸、腎、肝、腦組織提取病毒RNA,使用實(shí)時熒光定量PCR 測定病毒載量。根據(jù)組織病毒載量結(jié)果,感染可分為急性感染期(0～10 d)及平臺期(10～70 d)(圖1B)。急性感染期,小鼠組織病毒載量迅速上升,在腸(7 × 106copies/μL)、肝(4.5 × 107copies/μL)組織維持高水平復(fù)制;而后組織病毒載量逐漸降低并保持在106copies/μL 水平(圖1C、1E),進(jìn)入平臺期,主要在腎(3.5 × 107copies/μL)、腦(4.5 × 106copies/μL)組織維持高水平復(fù)制;之后在腎組織病毒載量逐漸降低并保持在107copies/μL 水平復(fù)制,在腦組織中病毒載量逐漸升高并保持在6 × 106copies/μL 水平復(fù)制(圖1D、1F)。綜上結(jié)果表明,LCMV-CL13 病毒可在C57BL/6N 小鼠維持較高水平的病毒載量及慢性感染。

圖1 LCMV-CL13 小鼠感染模型體重、組織病毒載量的動態(tài)變化Note.A.Changes in body weight of C57BL/6N mice after infection with LCMV-CL13.B.The tissue viral load trend of C57BL/6N mice infected with LCMV-CL13.C、D、E、F.Viral load in the intestine,kidney,liver,and brain tissues of C57BL/6N mice infected with LCMV-CL13.Compared with the negative control group,*P ＜0.05,**P ＜0.01,***P ＜0.001,****P ＜0.0001.Figure 1 Dynamic changes of body weight and tissue viral load of LCMV-CL13 mouse infection model

2.2 病毒感染引起CD8+T 細(xì)胞耗竭、CD19+B 細(xì)胞增加

為了解LCMV-CL13 慢性感染是否會導(dǎo)致小鼠外周血適應(yīng)性免疫細(xì)胞(CD4+T、CD8+T 及CD19+B細(xì)胞)的動態(tài)變化,在不同時間點(diǎn)收集外周血進(jìn)行流式檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未感染狀態(tài)相比,GK1.5抗體先清除CD4+T 細(xì)胞,感染后20 d 開始CD4+T細(xì)胞比例隨感染時間延長而恢復(fù),感染后第70 天可達(dá)到13.15% ± 0.72%(圖2)。CD8+T 細(xì)胞比例先降低后增加;在感染后10 d 占比(9.49% ±1.31%),隨著感染的持續(xù),感染后40 d 降低最明顯(2.17% ± 0.40%);隨之CD8+T 細(xì)胞比例開始升高,感染后70 d CD8+T 細(xì)胞比例可達(dá)到(6.65% ±0.52%)(圖2),但未恢復(fù)到正常水平。CD19+B 細(xì)胞比例在感染前40 d 無明顯變化,感染后40 d 比例逐漸升高,感染后70 d 達(dá)到(40.32% ± 0.46%)(圖2),顯著高于未感染狀態(tài)。綜上所述,GK1.5 抗體注射成功耗竭了小鼠體內(nèi)CD4+T 細(xì)胞,幫助病毒感染;CD8+T 細(xì)胞在感染過程出現(xiàn)持續(xù)耗竭,后隨著CD4+T 細(xì)胞比例增加而部分恢復(fù);CD19+B 細(xì)胞比例受慢性病毒感染影響逐漸增加,提示病毒誘發(fā)了顯著的體液免疫反應(yīng)。

圖2 感染后不同時間點(diǎn),病毒拷貝數(shù)與外周血CD4+T、CD8+T、CD19+ B 細(xì)胞比例變化Figure 2 Trend of virus RNA copies and the proportion of CD4+ T,CD8+ T,and CD19+ B cells in the peripheral blood at different time points after infection

2.3 病毒感染誘導(dǎo)GC B 細(xì)胞比例增加

生發(fā)中心是免疫反應(yīng)發(fā)生時,B 細(xì)胞在其中增殖、生長和突變的特殊區(qū)域。為了研究B 細(xì)胞的成熟及BCR 的突變,本文研究了LCMV-CL13 感染后脾生發(fā)中心B 細(xì)胞的變化趨勢,我們對LCMV-CL13慢性感染小鼠脾中特異性GC B 細(xì)胞(B220+CD19+GL7+FAS+)進(jìn)行流式檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),急性期感染中,GC B 細(xì)胞比例急劇下降,感染后第40～70 天,GC B 細(xì)胞比例由(2.28% ± 2.68%) 增加至(10.03% ± 0.60%)(圖3)。提示我們LCMV-CL13病毒感染初期可能對脾產(chǎn)生急性損傷,感染平臺期尤其感染后30～70 d,GC B 細(xì)胞增加速率較快,提示這一時期病毒特異性GC B 細(xì)胞增殖較快,發(fā)生針對病毒的體液免疫反應(yīng)。

圖3 感染后不同時間點(diǎn),病毒拷貝數(shù)與脾中GC B(B220+CD19+GL7+FAS+)細(xì)胞比例變化Figure 3 Trend of virus RNA copies and the proportion of GC B cell (B220+CD19+GL7+FAS+) in the spleen at different time points after infection

2.4 樣品多樣性及V 基因使用頻率、突變率分析

BCR 是一種長在B 淋巴細(xì)胞表面的免疫球蛋白分子(immunoglobulin,Ig),由重鏈及輕鏈構(gòu)成,與抗體同屬于免疫球蛋白家族。BCR 庫多樣性主要受免疫球蛋白基因中V、D、J 基因片段重組及V-D-J連接時發(fā)生核苷酸突變、插入或刪除的影響。我們采用香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)為組間多樣性的評價指標(biāo)。分析感染后30 d 與感染后60 d IGH、IGL 多樣性以及V 基因使用頻率、突變率(圖4),重鏈多樣性具有顯著性差異(P＜0.01)(圖4A),輕鏈多樣性無顯著性差異(圖4B),重鏈V 區(qū)基因片段中,感染后60 d 組IGHV6-3、IGHV1-58、IGHV3-6 基因使用頻率高于感染后30 d組(P＜0.05),其他基因則在感染后30 d 組表達(dá)更多或兩組表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4C,4D)。輕鏈V 區(qū)基因片段中,感染后60 d組基因使用頻率與感染后30 d 組無顯著性差異(圖4E,4F)?？赡苁歉腥竞?0 d 形成了針對抗原的特異性克隆。SHM 定義為V 基因片段的突變頻率,CDR3 區(qū)是抗原識別的重要部位,其特異性是被認(rèn)為是SHM 突變的結(jié)果。為了確定此小鼠模型是否發(fā)生SHM,本實(shí)驗分析不同時間點(diǎn)CDR3 區(qū)域V 基因突變率。突變率采用每10 000 個堿基中發(fā)生突變的堿基數(shù)量表示。如圖4G,4H 所示,感染后60 d相比于感染后30 d,重鏈V 基因突變率有顯著性升高(P＜0.05),且突變率CDR3(60 d)/CDR3(30 d)約為1.7 倍。結(jié)果證明:感染時間的增加,V 區(qū)基因點(diǎn)突變增高。綜上,提示Ig 基因發(fā)生SHM,且突變產(chǎn)生針病毒的特異性克隆,造成多樣性降低。

圖4 分析感染后30、60 d 重輕鏈多樣性、V 基因豐度及突變率Note.A,B.Diversity analysis of heavy and light chains at 30 and 60 days after infection.C,D.Frequency analysis of heavy chain V region gene usage 30 and 60 days after infection.E,F.Frequency analysis of light chain V region gene usage 30 and 60 days after infection.The Xaxis represents V gene subtypes,and the Y-axis represents the expression abundance of each gene.G,H.Mutation rate analysis of heavy and light chain CDR3 V gene at 30 and 60 days after infection.Compared with data of 30 and 60 days after infection,*P ＜0.05.Figure 4 Analysis of the diversity of heavy and light chains,the abundance and mutation rate of Vgene on 30,60 days after infection

3 討論

LCMV-CL13 慢性感染小鼠是一種廣泛用于研究病毒慢性感染機(jī)制的動物模型,為治療人類慢性病毒性疾病和其他慢性疾病(如癌癥)提供了寶貴的見解[16-19],包括抗原呈遞的MHC 限制、T 細(xì)胞效應(yīng)功能和記憶[20];LCMV-CL13 感染小鼠在感染8 d后體重下降20%,具有明顯臨床疾病評分。感染后1～5 周病毒保持高水平復(fù)制,感染后6 周血漿病毒滴度下降;感染后3 周內(nèi),CD8+T 細(xì)胞數(shù)量逐漸降低,CD4+T 細(xì)胞數(shù)量先升高后降低[15]。至今為止,該小鼠模型多用于T 細(xì)胞研究。有研究證明,成年小鼠在感染病毒時注射CD4 單克隆抗體,小鼠組織可終身保持高病毒水平[21]。因此,為建立慢性感染小鼠模型,本實(shí)驗通過先消耗CD4+T 細(xì)胞再經(jīng)尾靜脈注射途徑接種LCMV-CL13 病毒,感染后小鼠出現(xiàn)豎毛、弓背等體征,體重出現(xiàn)明顯下降、在檢測期內(nèi)組織病毒載量維持在相對較高水平。我們同時聚焦小鼠細(xì)胞、體液免疫反應(yīng)。通過流式檢測小鼠外周血CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞以及CD19+B 細(xì)胞比例,發(fā)現(xiàn)CD8+T 細(xì)胞、CD19+B 細(xì)胞比例隨著CD4+T 細(xì)胞比例的增加而增加,這與慢性病毒感染研究結(jié)果相符合[22]。以上結(jié)果證明,我們成功建立LCMV-CL13 慢性感染小鼠模型,且小鼠外周適應(yīng)性免疫反應(yīng)較為強(qiáng)烈。

Ig 基因SHM 在抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在抗病毒感染過程中,生發(fā)中心(germinal center,GC) B 細(xì)胞發(fā)生SHM 及類別轉(zhuǎn)換(class switch recombination,CSR)誘導(dǎo)親和力成熟,豐富抗體可變區(qū)多樣化、提高抗體中和活性[23-24]。因此,GC B 細(xì)胞是產(chǎn)生有效體液免疫的關(guān)鍵所在[25]。基于此,我們流式檢測GC B 細(xì)胞比例,發(fā)現(xiàn)感染前期GC B 細(xì)胞比例急劇下降,這可能與IFN-I 誘導(dǎo)的炎癥有關(guān)[26]。在生發(fā)中心微環(huán)境中,GC B 細(xì)胞在暗區(qū)(dark zone,DZ)進(jìn)行增殖和Ig 基因SHM,在亮區(qū)(light zone,LZ)進(jìn)行基于親和力的選擇[27]。我們結(jié)果顯示:感染后第40～60 天,GC B 細(xì)胞比例增加較快,說明此階段GC B 細(xì)胞快速增殖?；诖?我們推測感染后40～60 d 可能發(fā)生B 細(xì)胞高頻突變。為了驗證我們的假設(shè),分離感染后30、60 d 脾B 細(xì)胞進(jìn)行BCR 建庫以及測序分析。對重鏈、輕鏈多樣性以及V 基因使用頻率、突變進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明:感染后60 d 重鏈多樣性降低,V 基因使用頻率下降,但V 基因突變率增高1.7 倍。表明LCMV-CL13 慢性病毒感染模型發(fā)生B 細(xì)胞高頻突變,Ig V 基因突變率隨感染時間逐漸增加,產(chǎn)生病毒特異性克隆,導(dǎo)致BCR 庫多樣性降低。

SHM 可以增加免疫球蛋白對抗原識別和結(jié)合的親和力,雖然過去對SHM 的分子機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的研究,但仍有很多內(nèi)容尚未闡明。例如,影響SHM 發(fā)生的關(guān)鍵基因及調(diào)控基因尚未明確。在本研究中,我們在成功建立LCMV-CL13 慢性感染小鼠模型的基礎(chǔ)上,流式分析外周血、脾免疫細(xì)胞比例,并首次對B 細(xì)胞進(jìn)行BCR 突變分析,初步探究V 區(qū)基因使用頻率、突變率隨感染時間的變化情況。這為在LCMV-CL13 慢性病毒感染小鼠模型中研究B 細(xì)胞高頻突變、探究中和抗體的形成機(jī)制提供了基礎(chǔ)信息以及數(shù)據(jù)支持。本研究下一步將擴(kuò)大組內(nèi)樣本數(shù)量,從病毒與宿主共進(jìn)化角度出發(fā),篩選影響B(tài)CR 突變的關(guān)鍵基因以及CDR3 序列特異性識別的抗原特征,從而進(jìn)一步探尋抗體生成及進(jìn)化機(jī)制。