程斌,黃琴,王軍蒙,陳偉,張瑞斌,董龍聰,吳巧鳳

(成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,成都 610075)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種以腹痛或腹部不適并伴有排便異常為主的腸功能紊亂性疾病,根據(jù)羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn),該病共分為四型,其中腹瀉型腸易激綜合征最為常見,主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉以及腸道動力紊亂[1]。其相關(guān)動物模型的研究與制備也較多,主要包括束縛應(yīng)激刺激法、番瀉葉灌胃、理化因素刺激法、母嬰分離法、基因敲除法以及多種方式聯(lián)合刺激等方法[2]。而乙酸刺激法因操作簡單,成模周期短,被較多用于IBS-D 模型的研究。但是,既往研究大多采用大鼠構(gòu)建模型,相關(guān)的小鼠造模方法仍不成熟,而眾所周知,小鼠飼養(yǎng)方便、操作方便、繁殖速度快,因此,構(gòu)建IBS-D 小鼠模型將進(jìn)一步推進(jìn)相關(guān)科研實驗的進(jìn)度,并方便后期開展基因敲除等實驗。因此,本研究借鑒乙酸誘導(dǎo)IBS-D 大鼠模型,開展適宜濃度乙酸誘導(dǎo)腹瀉型腸易激綜合征小鼠模型的制備。前期經(jīng)過不同濃度乙酸以及不同灌注次數(shù)探索發(fā)現(xiàn),小鼠直腸多次灌注較低濃度乙酸是一種很有潛力的建模方法,但腸道局部癥狀不容易穩(wěn)定?？紤]到心理應(yīng)激等因素是腸易激綜合征的高風(fēng)險因素[3],以及有乙酸聯(lián)合束縛應(yīng)激的相關(guān)報道[4]。因此,本實驗通過比較3%乙酸經(jīng)直腸灌注和3%乙酸經(jīng)直腸灌注聯(lián)合束縛應(yīng)激兩種造模方法探討構(gòu)建IBS-D 小鼠模型的較優(yōu)方式,以期為后期相關(guān)的實驗研究奠定模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選用45 只無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性C57BL/6J 小鼠,9～12 周齡,體重(26 ± 2)g,由成都藥康生物科技有限公司【SCXK(川)2020-034】提供,動物在成都中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心【SYXK(川)2019-049】飼養(yǎng),晝夜各半循環(huán)照明,濕度恒定,溫度控制在22～26℃,相對濕度55%～65%,光暗周期12 h/12 h。所有操作均符合成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗倫理學(xué)要求(備案號:2019-04)。

1.1.2 主要試劑與儀器

Fluorescein isothiocyanate-dextran 4(FD4,平均分子量:3000～5000,Sigma,BCCC8276)、5-HT 酶聯(lián)免疫試劑盒(elabscience,E-EL-0033c)、TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒(elabscience,E-EL-M0049c)、Anti-5-HTR3A(Affinity,DF134415)。

小鼠麻醉機(jī)(RWD life science,中國)、恒溫箱(中興,中國)、千分位天平(賽多利斯,中國)、離心機(jī)(湘儀,中國)、HS6 病理切片掃描影像分析系統(tǒng)(舜宇,中國)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實驗干預(yù)

選用45 只健康雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,按體重隨機(jī)分為健康對照組(C 組)、模型組(3%乙酸組(A 組)、3%乙酸聯(lián)合束縛應(yīng)激組(A+R 組)),其中C 組小鼠正常飲食,不予任何處理,模型組小鼠給予3%乙酸溶液(≥99%乙酸與生理鹽水體積比為3:97)灌腸。具體操作為:在異氟烷吸入麻醉狀態(tài)下,在距肛門3～4 cm 的結(jié)腸中注入(200 ± 20)μL 的3%乙酸溶液,用手指夾住肛門附近皮膚組織,使肛門處于閉合狀態(tài),持續(xù)10 s,然后注入(200 ± 20)μL的生理鹽水沖洗,將小鼠懸空,直到小鼠蘇醒,3 d后再重復(fù)1 次。期間對A+R 組小鼠進(jìn)行3 次束縛應(yīng)激,每次1 h,A 組小鼠不予束縛應(yīng)激;模型構(gòu)建時間為8 d,具體干預(yù)如圖1。

圖1 模型的構(gòu)建方法Figure 1 Model construction method

1.2.2 觀察指標(biāo)及取材

(1)一般情況:觀察小鼠毛發(fā)和日?；顒?每日稱重,計算各組小鼠的體重變化百分?jǐn)?shù)[(當(dāng)前的體重×100)/造模前體重]。并記錄整個造模周期內(nèi)各組小鼠的存活情況。

(2)糞便含水量和全腸道轉(zhuǎn)運時間:造模結(jié)束后第2 天,觀察并測量各組小鼠的糞便含水量(fecal water content,FWC) 和全腸道轉(zhuǎn)運時間(total intestinal transport time)[5]。評估前所有小鼠禁食不禁水12 h,按每只0.2 mL 的容量經(jīng)口灌入3%苯酚紅混懸液。記錄4 h 內(nèi)小鼠灌胃到首粒紅便排出的時間。期間觀測各組小鼠的糞便性狀,并收集小鼠2 h 內(nèi)的糞便,200℃恒溫箱烘烤30 min,計算烘烤前后大便重量變化,計算糞便含水量。

(3)內(nèi)臟高敏感性:造模結(jié)束后第3 天,對各組小鼠進(jìn)行結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distention,CRD)刺激,并使用腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)評分[6]進(jìn)行內(nèi)臟痛閾值評價,以3 分(結(jié)腸擴(kuò)張時腹部肌肉收縮,腹肌抬離桌面)作為內(nèi)臟痛閾值評估小鼠的內(nèi)臟敏感性[7],并記錄注入水的體積,每只小鼠重復(fù)測量3 次,每次間隔5 min,取3 次的平均值作為小鼠的內(nèi)臟痛閾值。AWR 評分標(biāo)準(zhǔn)(見表1)。

表1 AWR 評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 AWR scoring criteria

(4)樣本采集:在造模第4 天采用異氟烷吸入麻醉方法取血,離心(4000 rpm,10 min,4℃)獲得血清,-80℃保存?zhèn)溆?并剪取小鼠肛門上1 cm 到盲腸端的結(jié)腸組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)切片。造模結(jié)束后第5 天,將小鼠禁食4 h 后,稱取各小鼠的體重,以灌胃的方式給予每只小鼠600 mg/kg 的FD4 溶液(1×PBS 配制,濃度為75 mg/mL,避光保存),2 h 后對小鼠行取血,將所取的血置于1.5 mL 棕色Tube 管中,并以50 U/mL 的比例加入1%的肝素鈉,混勻后室溫靜置30 min 后,通過低溫離心機(jī)(12 000 rpm、10 min、4℃)離心獲取小鼠血漿[8-9],于-80℃冰箱避光保存。

1.2.3 結(jié)腸粘膜組織HE 染色評分和結(jié)腸粘膜屏障完整性評價

結(jié)腸組織切片,采用蘇木精-伊紅染色法染色,并在光鏡下觀察結(jié)腸組織的組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)。血漿樣品解凍后,檢測血漿樣本中FD4 的含量。

1.2.4 血清5-HT 和TNF-α 含量

將置于-80℃保存的血清取出,嚴(yán)格按照ELISA說明書要求檢測血清樣本中5-HT 和TNF-α 的含量。

1.2.5 免疫組化檢測結(jié)腸中5-HTR3A 含量

結(jié)腸組織石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉以后,分別加入5-HTR3A抗體4℃孵育過夜,清洗后加入羊抗兔二抗室溫孵育50 min、清洗后DAB 顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片,通過HS6 全掃儀器采集圖像,并通過Image pro plus 6.0 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示,所有數(shù)據(jù)均用SPSS 24.0 和Image pro plus 6.0 以及Graph Pad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪制統(tǒng)計圖,兩樣本均數(shù)比較采用單樣本t檢驗,多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析,體重變化百分?jǐn)?shù)組間比較采用重復(fù)測量方差分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

通過體重的變化百分?jǐn)?shù)來反映小鼠應(yīng)激后的恢復(fù)情況,在小鼠第1 次乙酸灌腸后,體重明顯下降,但第3 天后恢復(fù)到造模前體重水平;第2 次乙酸灌腸后,體重下降百分?jǐn)?shù)與第1 次乙酸灌腸后相當(dāng),但其體重的回升速度變慢。在整個模型構(gòu)建期間,與C 組相比,A 組與A+R 組小鼠體重均未見明顯增長,其中A 組小鼠的體重回升更明顯(見圖2A)。期間模型組小鼠的活動均變少,毛發(fā)稍顯無光澤。在實驗過程中,C 組未發(fā)生死亡現(xiàn)象,A 組和A+R組均存在小鼠死亡的情況,死亡率分別為6.7%和13.3%(見圖2B)。

圖2 不同組別小鼠的體重變化及存活情況的比較Note.A.Group C(n=15),Group A(n=14),Group A+R(n=13).Compared with the group C,*P ＜0.05,***P ＜0.001.Compared with the group A,#P ＜0.05,###P ＜0.001.Figure 2 Comparison of body weight change and survival of mice in different groups

2.2 糞便含水量和全腸道轉(zhuǎn)運時間

糞便含水量作為反映小鼠的腹瀉情況以及腸道通透性的客觀指標(biāo)。結(jié)果如圖3A 所示,與C 組小鼠的糞便含水百分?jǐn)?shù)(43.53% ± 6.61%)相比,A組小鼠糞便含水百分?jǐn)?shù)(48.86% ± 2.18%)存在明顯差異(P＜0.05),A+R 組小鼠的糞便含水百分?jǐn)?shù)(57.45% ± 6.19%)存在顯著性差異(P＜0.001),并且A 組與A+R 組相比也存在顯著性差異(P＜0.001)。通過觀察各組小鼠的全腸道轉(zhuǎn)運時間和4 h 內(nèi)紅便排出百分?jǐn)?shù)來反映各組小鼠的腸道動力情況,結(jié)果如圖3B 和圖3C 所示,與C 組的全腸道轉(zhuǎn)運時間(172.97 ± 51.27)min 相比A+R 組的全腸道轉(zhuǎn)運時間(130.41 ± 25.37)min 明顯縮短(P＜0.05)。而A 組全腸道轉(zhuǎn)運時間(140.62 ± 45.48)min 雖然縮短,但與C 組相比未見明顯差異(P＞0.05),并且A+R 組4 h 內(nèi)紅便排出百分?jǐn)?shù)明顯增加。

圖3 不同組別小鼠的糞便含水量、全腸道轉(zhuǎn)運時間及4 h 內(nèi)紅色糞便排出百分?jǐn)?shù)的比較Note.Compared with the Group C,nsP ＞0.05,*P ＜0.05,***P ＜0.001.Compared with the Group A,nsP ＞0.05,#P ＜0.05,###P ＜0.001.(The same in the following figures)Figure 3 Comparison of fecal water content,total intestinal transport time and percentage of red fecal excretion within 4 h in different groups of mice

2.3 內(nèi)臟敏感性

通過統(tǒng)計注入水的體積來測量小鼠的內(nèi)臟敏感性,A 組小鼠的注水量(0.10 ± 0.02)mL 與A+R組小鼠的注水量(0.08 ± 0.02)mL 均較C 組小鼠的注水量(0.13 ± 0.02)mL 明顯降低(P＜0.001),且兩組間存在明顯差異(P＜0.05)(見圖4)。

圖4 注入水的體積(內(nèi)臟痛閾值)Figure 4 Volume of injected water (visceral pain threshold)

2.4 結(jié)腸粘膜組織HE 染色和結(jié)腸粘膜屏障完整性

A+R 組和C 組小鼠結(jié)腸組織壁光滑無充血水腫,腸道組織與周圍器官均無明顯粘連,HE 染色顯示,A+R 組小鼠結(jié)腸組織中的細(xì)胞排列稍顯紊亂,炎性細(xì)胞無明顯增加(見圖5A)。在對結(jié)腸粘膜屏障的完整性(腸道通透性)的測量中發(fā)現(xiàn),與C 組血漿中FD4 的含量(0.58 ± 0.23)μg/mL 相比,A+R 組小鼠血漿中FD4 的含量(1.85 ± 0.42)μg/mL升高(P＜0.001)(見圖5B)。

圖5 結(jié)腸HE 染色結(jié)果及血漿中FD4 的含量Figure 5 HE staining of colon and the content of FD4 in plasma

2.5 血清中5-HT 和TNF-α 的含量

5-HT 被認(rèn)為是參與IBS-D 發(fā)病的重要的胃腸激素之一,與腸道動力顯著相關(guān),而血清中TNF-α作為反映IBS-D 小鼠全身炎癥狀態(tài)的指標(biāo)之一。在對C 組小鼠和A+R 組小鼠血清中5-HT 和TNF-α含量的檢測中,發(fā)現(xiàn)A+R 組血清中5-HT 含量(229.70 ± 15.76)ng/mL 相對于C 組血清中的5-HT 含量(173.74 ± 8.11)ng/mL 顯著增加(P＜0.001)(見圖6A);而A+R 組血清中TNF-α 的含量(59.31 ± 3.82)pg/mL 與C 組血清中TNF-α 的含量(52.78 ± 3.28)pg/mL 相比有顯著性差異(P＜0.05)(見圖6B)。

圖6 血清中5-HT 和TNF-α 的含量Figure 6 Level of 5-HT and TNF-α in serum

2.6 結(jié)腸組織中5-HTR3A 的表達(dá)情況

5-HTR3A 作為5-HT3 受體亞型,與腸道高敏感的形成密切相關(guān)。通過免疫組化測定結(jié)腸組織中5-HTR3A 的表達(dá)量(IOD 值),觀察到A+R 組結(jié)腸組織中5-HTR3A 的表達(dá)量顯著增加(P＜0.001)(見圖7)。

圖7 5-HTR3A 在結(jié)腸組織中的表達(dá)量Note.“→”.The site of 5-HTR3A expression.Figure 7 Expression of 5-HTR3A in colon tissue

3 討論

IBS-D 的病因及具體的病理生理機(jī)制尚不清楚,癥狀由多種機(jī)制共同作用導(dǎo)致,目前認(rèn)為IBS-D主要是腸道通透性增加、內(nèi)臟的敏感性增高、胃腸運動障礙、腸-腦軸調(diào)節(jié)異常、腸道感染、腸道菌群失調(diào)、飲食及心理社會等因素共同作用的結(jié)果,并伴有低度炎癥[10]。關(guān)于IBS-D 造模方法的研究與制備也較多,主要包括束縛應(yīng)激刺激法、番瀉葉灌胃、理化因素刺激、母嬰分離法以及多種方式聯(lián)合刺激等方法誘導(dǎo)IBS-D 模型,雖然這些造模方法各有優(yōu)點,但因造模周期長、造模成本高以及需要投入大量的精力,故在模型的制備上存在一定的局限性。而乙酸刺激作為一種常見的理化刺激方法,因操作簡單,成模周期短,被較多用于IBS-D 模型的制備與疾病研究。

目前IBS-D 動物模型主要圍繞腸道動力、內(nèi)腸敏感性、腸道通透性等相關(guān)的病理生理改變來驗證模型的建立是否成功[5,11-13]。研究發(fā)現(xiàn),乙酸灌腸能誘導(dǎo)腸道高敏感,而且在結(jié)腸運動以及腸道通透性方面也有改變[14]。本研究觀察到A+R 組的全腸道轉(zhuǎn)運時間明顯減少,內(nèi)臟敏感性顯著增加,模型小鼠均出現(xiàn)大便質(zhì)稀,甚者為水樣便。隨著時間延長,小鼠的水樣便以及稀便率降低,且在造模結(jié)束后第2 天,糞便含水量仍高于C 組,而A 組小鼠除了內(nèi)臟敏感性增加和糞便含水量升高外,其全腸道轉(zhuǎn)運時間在造模結(jié)束后均未發(fā)生明顯變化。而與以往乙酸誘導(dǎo)IBS-D 模型的研究類似[15],本研究也存在小鼠死亡的現(xiàn)象,分析原因可能是小鼠腸道脆弱,乙酸刺激過強(qiáng),并且此實驗為體內(nèi)刺激,導(dǎo)致部分小鼠不耐受而死亡。這一點在造模期間各組小鼠的體重變化中也有部分反映,在直腸灌注乙酸后小鼠的體重顯著下降,但隨后迅速恢復(fù),表明小鼠的恢復(fù)能力較強(qiáng),這也間接說明了為什么結(jié)腸HE染色未見明顯炎性細(xì)胞浸潤,但與A 組比較,A+R組小鼠體重恢復(fù)更緩慢,并不會明顯增加小鼠的死亡率。以往研究發(fā)現(xiàn)胃腸炎患者康復(fù)后約有10%的患者會發(fā)展成IBS-D,并長期伴有腹痛、腹瀉等癥狀[16],而在患胃腸炎癥期間,心理因素會增加胃腸炎患者康復(fù)后患腸易激綜合征的風(fēng)險[3]。在腸道疾病相關(guān)的動物實驗中也發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激可以加重疾病的相關(guān)癥狀及病理改變[17]。因此,A+R 組小鼠能成功誘導(dǎo)IBS-D 腸道相關(guān)癥狀,可能與胃腸急性炎癥期間的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

與C 組相比,A+R 組小鼠血漿中FD4 的含量明顯增加,表明小鼠結(jié)腸組織的腸道通透性增加,其結(jié)腸粘膜屏障功能受損。而腸上皮結(jié)構(gòu)的完整性受損被認(rèn)為是IBS-D 發(fā)生腹瀉的重要因素之一[18-19]。此外,3%乙酸聯(lián)合束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的IBS-D模型小鼠結(jié)腸組織中的炎性細(xì)胞與健康對照組相比無明顯增加,也未發(fā)現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞聚集/浸潤現(xiàn)象,但血清中TNF-α 存在明顯差異。這與臨床IBS-D 患者的相關(guān)表現(xiàn)類似,有報道發(fā)現(xiàn),與健康受試者相比,IBS-D 患者結(jié)腸組織無明顯病理改變,但血清中多種炎癥細(xì)胞因子發(fā)生了變化,其中TNF-α變化最為明顯[20]。

5-HT 被認(rèn)為是參與IBS-D 發(fā)病的重要的胃腸激素之一。有研究認(rèn)為在IBS-D 患者以及動物模型中,血清中5-HT 的含量均有所增加[21-22]。大鼠腹腔注射5-HT 能顯著加快腸道內(nèi)容物的排出時間,甚至導(dǎo)致腹瀉[23]。而5-HT 可與腸道中的5-HT 相關(guān)受體結(jié)合對腸道敏感、腸道吸收和分泌以及腸道動力產(chǎn)生直接或間接的影響,從而導(dǎo)致腹痛、腹瀉以及腸道動力的改變。其中5-HT3 受體與IBS-D 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),在腸道感覺功能中發(fā)揮著重要作用[24]。5-HTR3A 作為5-HT3 受體的亞型之一,在關(guān)于5-HT3 受體功能性的研究中,發(fā)現(xiàn)其余的5-HT3 受體亞型與5-HTR3A 受體共同表達(dá)時才能形成功能性異聚體,發(fā)揮相應(yīng)的作用[25]。因此,本實驗觀察到血清中5-HT 變化以及結(jié)腸組織中5-HTR3A 含量增加,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與臨床IBS-D 相關(guān)報道一致。

綜上,我們認(rèn)為,3%乙酸聯(lián)合束縛應(yīng)激的方式能夠較好的模擬IBS-D 腸道局部相關(guān)癥狀,并改變血清中5-HT 和TNF-α 的含量以及腸道5-HTR3A的表達(dá),與臨床IBS-D 表現(xiàn)相符,是一種具有較好推廣價值的IBS-D 小鼠模型制備方法。