彭燦燦， 王惠明

武漢大學人民醫(yī)院，武漢430060

抗腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）病也稱為Goodpasture綜合征，是一種經(jīng)典的自身免疫性疾病，其特征是循環(huán)中存在抗腎小球和/或肺泡基底膜的自身抗體，常導致急進性腎小球腎炎，同時伴有肺出血的風險［1］。Ⅳ型膠原a3 鏈的非膠原結構域1［a3（Ⅳ）NC1］是抗GBM 抗體的主要靶抗原［2-3］，相關研究證實該區(qū)域的一個線性表位肽P14（a3127-148）同時包含B 細胞和T 細胞識別的表位［4-8］。目前，治療時常使用皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑及血液透析排除循環(huán)中的抗體［9-11］。多數(shù)患者病情進展迅速，預后不良。

雖然抗GBM 病的流行病學和臨床研究已較成熟，但其潛在的疾病發(fā)展機制尚未完全闡明，不同的動物模型可以幫助研究抗GBM 病的各個具體方面和開發(fā)新的特異性療法。實驗性自身免疫性腎小球腎炎（experimental autoimmune glomerulonphritis，EAG）是Goodpasture 綜合征的一種動物模型，可在大鼠和小鼠敏感品系中通過可溶性GBM 或重組a3（Ⅳ）NC1 誘導免疫［12］。EAG 與人類疾病有許多共同的特點，如腎和肺病理非常相似［13］，抗GBM 抗體對主要靶抗原a3（Ⅳ）NC1具有相同的特異性。

通過制備含有B 細胞和T 細胞共同表位P14肽，觀察在WKY 大鼠中誘導典型的EAG 模型的能力，本研究建立了一種較為穩(wěn)定的動物模型，希望輔助了解抗GBM 病的發(fā)病機制和病因，并為開發(fā)更為特異的免疫療法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級健康雌性、4~6 周齡WKY大鼠20只，體質(zhì)量65~80 g，購自維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院動物實驗中心，動物飼養(yǎng)許可證號為SYXK（鄂）2015-0027。

1.1.2 多肽制備 P14（a3127-148）線性多肽序列為TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF（Uniprot accession：Q01955 CO4A3_HUMAN1615-1636），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，純度95%。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫 4~6周齡健康WKY大鼠

20只，SPF級適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為2組，即對照組和抗GBM病模型組（腎炎模型組），每組10只。將P14 肽與完全弗氏佐劑（CFA，購自Sigma-Aldrich公司）充分乳化，通過大鼠后腳墊三點注射對腎炎模型組進行單次免疫，劑量為200 μg·kg?1，而對照組僅用CFA 免疫。免疫前及免疫后每周使用代謝籠收集24 h 的尿液樣本，通過尾靜脈穿刺采集血樣。所有大鼠在免疫后7 w 處死，收集血液和腎組織進行進一步實驗。本研究所有動物實驗均經(jīng)過武漢大學人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核批準。

1.2.2 生化指標檢測 免疫前后每周收集24 h尿樣和血樣，在武漢大學人民醫(yī)院臨床實驗室通過全自動生化分析儀檢測大鼠尿蛋白和尿肌酐，并計算出尿蛋白肌酐比值（albumin/urine creatinine ratio，ACR）的變化；通過肌氨酸氧化酶法和脲酶法分別檢測血清肌酐（serum creatinine，Cre）及血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的變化。

1.2.3 病理學檢查 光鏡和直接免疫熒光檢查腎組織，在光學顯微鏡下，將腎組織用4%的多聚甲醛固定，脫水并包埋在石蠟中，腎臟切片（3 μm）用高碘酸-希夫（perioclic acicl schiff，PAS）染色，觀察腎臟的病理損害。對于直接免疫熒光，冰凍切片（5 μm）用丙酮固定，并與FITC結合的山羊抗大鼠IgG（Abclonal，1∶50）室溫孵育，以檢測IgG在GBM上的沉積情況。每個組織中至少評估50個腎小球。

1.2.4 腎組織浸潤情況檢測 通過染色石蠟切片（MPO 和CD68）分別檢測中性粒細胞和巨噬細胞在腎小球中的浸潤情況。上述所有切片分別使用MPO抗體及CD68抗體于4 ℃孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶結合的山羊抗小鼠IgG（Abclonal，1∶50）室溫孵育，并用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）進行30 s 染色。通過Image J 分析軟件評估，每個組織中至少評估20個腎小球。

1.2.5 電鏡檢測 在電子顯微鏡下，將腎組織固定在3%戊二醛和1%四氧化鋨中，然后在分級乙醇中脫水并在丙酮中洗滌，最后包埋在Epon812中。用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，并用透射電子顯微鏡檢查。

1.2.6 循環(huán)中抗GBM抗體的水平檢測 采用間接

ELISA分別檢測免疫前后每周血清中抗GBM抗體的水平變化。將多肽P14（a3127-148）以10 μg·mL?1包被到96 孔板上過夜，1%BSA 封閉，1∶100 稀釋的血清樣品37 ℃下在平板中孵育1 h 后，添加1∶2 000 稀釋的辣根過氧化物酶結合的山羊-大鼠IgG（Abclonal），使用四甲基聯(lián)苯胺作為底物，避光孵育并在450 nm處用分光光度法測量顯色。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以平均數(shù)±標準差表示，采用雙因素方差分析作為統(tǒng)計學檢驗方法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 生化指標

如圖1所示，腎炎模型組大鼠自免疫后第4周起，ACR 及24 h 尿蛋白含量開始升高。ACR 在第5 周達到峰值，達863.62±114.45 mg·mmol?1，與對照組（80.53±50.73 mg·mmol?1）相比具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。24 h尿蛋白含量在第6周達到峰值（76.93±9.03 mg·24 h?1），與對照組（5.37±0.87 mg·24 h?1）相比具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。血肌酐及血尿素氮含量在免疫后第5周開始升高，此后隨腎炎進展持續(xù)升高，且不同時間點腎炎模型組均顯著高于對照組（P＜0.05，圖1）。

圖1 腎炎模型組與對照組大鼠尿蛋白肌酐比值、24 h尿蛋白含量、血肌酐和血尿素氮隨時間的變化情況Fig.1 Quantitative comparison of ACR,24 h urinary protein,serum creatinine and serum urea nitrogen between nephritis model group and control group with time

以上結果表明，腎炎模型組大鼠在P14（a3127-148）免疫后第4~7 周，均能形成大鼠抗GBM腎小球腎炎，免疫后第4 周，病變相對較輕，免疫第5~7周，腎炎基本穩(wěn)定。

2.2 病理學檢查

2.2.1 光鏡觀察 與對照組相比，腎炎模型組大體觀表現(xiàn)為腎臟體積明顯增大、缺血（圖2）。腎炎模型組大鼠免疫后第7 周時腎小球體積增大，球內(nèi)有核細胞數(shù)增多，PAS 染色可見腎小球中富于細胞型新月體伴節(jié)段性纖維素樣壞死，累及75%以上腎小球，對照組大鼠在完全弗氏佐劑免疫后未出現(xiàn)腎損傷（圖3）。腎組織免疫組化染色也觀察到腎臟間質(zhì)炎癥改變，腎炎模型組大鼠的腎小球簇和新月體中存在中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，而對照組基本無炎性細胞浸潤（圖4）。在所有大鼠中均未觀察到肺部病變（圖4）。

圖2 腎炎模型組與對照組大鼠腎臟大體觀表現(xiàn)Fig.2 Appearance of kidney in nephritis model group and control group

圖3 腎炎模型組與對照組大鼠腎組織切片PAS染色Fig.3 PAS staining of renal tissue sections of rats in nephritis model group and control group

圖4 腎炎模型組與對照組大鼠炎性細胞浸潤情況及肺組織切片F(xiàn)ig.4 Inflammatory cell infiltration and lung tissue sections of rats in nephritis model group and control group

2.2.2 免疫熒光檢查 腎炎模型組大鼠在直接免疫熒光上均呈現(xiàn)沿GBM 的強線性IgG 沉積，但在對照組中未檢測到（圖5）。

圖5 腎炎模型組與對照組大鼠免疫熒光檢測結果Fig.5 Results of immunofluorescence detection in nephritis model group and control group

2.2.3 電鏡檢測 在電子顯微鏡下，腎炎模型組腎小球中發(fā)現(xiàn)GBM 的斷裂和收縮，呈新月形，無電子致密物沉積。對照組在電鏡下未觀察到GBM損傷（圖6）。

圖6 腎炎模型組與對照組大鼠電鏡結果Fig.6 Electron microscope results of nephritis model group and control group

以上結果表明，腎炎模型組大鼠在P14（a3127-148）免疫后誘發(fā)出嚴重的新月體型腎小球腎炎，腎病理表現(xiàn)與人類疾病基本一致。

2.3 抗GBM抗體水平

如圖7所示，腎炎模型組大鼠在免疫后第2周，對P14 產(chǎn)生了強烈的血清抗體反應，并在免疫后第5 周達到高峰（2.43±0.18），與對照組（0.04±0.04）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。雖然抗體水平在第5 周后下降，但較對照組差異仍有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖7 腎炎模型組與對照組大鼠血清中抗GBM抗體的水平隨時間變化情況Fig.7 Comparison of serum anti-GBM antibody levels between nephritis model group and control group with time

以上結果表明，腎炎模型組大鼠在免疫后第2 周起對P14（a3127-148）產(chǎn)生了強烈的血清抗體反應，抗體水平較高且趨于穩(wěn)定。

3 討論

Goodpasture 綜合征亦稱抗GBM 病，其典型特點為血清中抗GBM 抗體在腎小球基底膜和肺泡基底膜沉積，可導致快速進展性新月體性腎小球腎炎，超過50%的患者伴有肺出血。雖然該病臨床并不常見（發(fā)病率為每年每百萬人0.5~1.6例）［14］，但20%的快速進展性腎小球腎炎患者由抗GBM 病引起，40%的患者可出現(xiàn)腎臟受累［15］。臨床上這種疾病的變異或非典型表現(xiàn)的例子越來越多，建立更為穩(wěn)定的疾病模型可以幫助研究者理解疾病發(fā)病機理，從而更好地尋找新療法。

先前的研究顯示，許多抗GBM 病的動物模型是通過直接使用GBM 膠原蛋白或重組的a3（Ⅳ）NC1 進行主動免疫開發(fā)的，已經(jīng)建立了幾種抗GBM 病的嚙齒動物模型［12，16-18］，但這些模型很難確定抗體及T細胞在腎小球損傷過程中介導的機制。隨后一些模型開始使用其抗原表位顯性肽進行免疫，如來自a3（Ⅳ）NC1 上的單個T 細胞表位pCol（28-40），可在WKY 大鼠中誘發(fā)嚴重的新月體腎炎［8，19-21］，明確了T 細胞在腎小球損傷過程中發(fā)揮關鍵作用。值得注意的是，由于人類自身免疫性疾病的異質(zhì)性，每個動物模型可能只反映人類疾病整個發(fā)病機制的一部分［22］。因此，盡管已經(jīng)為抗GBM 病建立了許多動物模型，未來的研究還需要更新穎和創(chuàng)新的模型。

本研究合成了一個線性表位肽P14（a3127-148）用以免疫WKY大鼠，隨后評估實驗性自身免疫性腎小球腎炎。P14（a3127-148）作為T 細胞和B 細胞的共同表位，是人類Goodpasture 綜合征的初始表位，不僅可以誘導嚴重的腎小球腎炎，而且還可以引發(fā)分子內(nèi)表位擴散［23］。本研究結果顯示，所有腎炎模型組大鼠在P14（a3127-148）免疫后均出現(xiàn)抗GBM 腎小球腎炎，伴有蛋白尿、血清尿素氮和血肌酐升高；腎小球中富于細胞型新月體，顯示增生性病變，腎小球周圍有炎癥反應，球內(nèi)炎性細胞浸潤；IgG沿GBM 呈強線性沉積；電鏡下無免疫復合物沉積，可觀察到GBM 斷裂、壞死；間接ELISA 表明，腎炎模型組大鼠對P14（a3127-148）都產(chǎn)生了強烈的血清抗體反應。通過免疫后每周檢測血、尿及循環(huán)中抗體水平的變化，證實該動物的腎炎模型與人類抗GBM 病基本一致。此外，一次合成的線性肽免疫就足以誘發(fā)這種暴發(fā)性的自身免疫疾病，使得這種建模方法顯得極為簡便而有效。

目前抗GBM 病的管理原則仍然是一樣的：快速清除致病性抗體并防止其重新合成。雖然通過血漿交換或IAS 直接清除循環(huán)抗體是非常有效的，但由于腎臟破壞的進展，并不能改善患者腎功能［1］。因此替代療法或附加療法是必要的，且通過靶向抗原特異性免疫應答治療效果良好［10-11，24］。

綜上所述，人工合成的P14（a3127-148）線性肽在WKY 大鼠中可以成功誘導新月體腎小球腎炎，本研究建立了一種操作簡便且較為穩(wěn)定的抗GBM病動物模型。其中監(jiān)測循環(huán)中抗P14（a3127-148）IgG抗體的含量變化，將有助于開發(fā)更為特異的免疫療法。