姜毅，湯鼎，周宇誠(chéng)，丁聰聰，趙興青*，柴育紅，2

（1.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.常州大學(xué)懷德學(xué)院，江蘇 靖江 214500）

由于在工業(yè)中的廣泛使用和排放，鉻（Cr）成為了一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物。Cr 在環(huán)境中以多種價(jià)態(tài)存在，其中最常見(jiàn)和最穩(wěn)定的是Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）。據(jù)報(bào)道，Cr（Ⅵ）較Cr（Ⅲ）毒性更高，因?yàn)镃r（Ⅵ）具有很高的穩(wěn)定性和細(xì)胞通透性。因此，Cr（Ⅵ）已被許多國(guó)家指定為首要環(huán)境污染物之一。而Cr（Ⅲ）是維持人體新陳代謝和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的，并且Cr（Ⅲ）具有較低的毒性、遷移率和生物可利用度，這是因?yàn)槠淙菀自诃h(huán)境中形成不溶的氫氧化物或氧化物。因此，Cr（Ⅵ）污染的修復(fù)策略主要集中在將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）。

近些年，已研究出多種將Cr（Ⅵ）轉(zhuǎn)化為Cr（Ⅲ）的方法，包括物理化學(xué)修復(fù)以及生物修復(fù)。與生物修復(fù)相比，物理化學(xué)法快速有效，但存在操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴和二次污染等缺點(diǎn)。而生物修復(fù)由于成本低、環(huán)境友好等突出優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。

現(xiàn)已經(jīng)鑒定并分離出多種具有Cr（Ⅵ）去除能力 的 微 生 物，如W4、sp. M6、LY10、、sp.GSKRLMBKU-03等。細(xì)菌還原Cr（Ⅵ）的機(jī)理主要有兩種：一是間接還原，即通過(guò)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物還原Cr（Ⅵ）；二是直接還原，即通過(guò)細(xì)菌鉻酸鹽還原酶的酶促反應(yīng)將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）。ACKERLEY等研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌可產(chǎn)生一種氧不敏感性的酶——NfsA，這種酶可將Cr（Ⅵ）直接還原為Cr（Ⅲ）。還 有 研 究 發(fā) 現(xiàn)MR-1和sp.能 將Cr（Ⅵ）還 原為Cr（Ⅲ）。然而，Cr（Ⅵ）生物修復(fù)過(guò)程的有效性主要取決于還原的最終產(chǎn)物，先前的研究很大程度上忽略了Cr（Ⅲ）產(chǎn)物的形成過(guò)程及對(duì)最終產(chǎn)物的表征分析。

還原產(chǎn)物的表征至關(guān)重要，我們不僅需要了解還原機(jī)理，還需要探究還原產(chǎn)物的形態(tài)和種類。耐Cr菌株sp.T124分離自長(zhǎng)期受鉻污染的土壤，本研究對(duì)該菌株還原Cr（Ⅵ）的效率和機(jī)理進(jìn)行探究，并在最佳條件下評(píng)估了該菌株對(duì)Cr（Ⅵ）的還原能力。通過(guò)掃描電鏡-能譜儀（SEM-EDS）分析菌株和還原產(chǎn)物的形態(tài)，利用X射線衍射（XRD）和拉曼光譜分析還原產(chǎn)物的構(gòu)成，利用傅里葉紅外光譜（FT-IR）和X射線電子能譜（XPS）分析還原產(chǎn)物的官能團(tuán)變化和元素構(gòu)成，以探索菌株的性質(zhì)和還原產(chǎn)物的特征，從而了解Cr（Ⅵ）的還原機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 Cr（Ⅵ）還原菌株

從江蘇某電鍍工廠周邊收集的Cr（Ⅵ）污染土壤中分離出耐受Cr（Ⅵ）且表現(xiàn)出最高Cr（Ⅵ）還原能力的菌株T124，16S rDNA 基因序列分析將其鑒定為芽孢桿菌，命名為sp.T124。將菌株序列提交至GenBank 登記獲得登錄號(hào)為MN511807。LB 液體培養(yǎng)基組成為：魚粉蛋白胨10 g·L，酵母浸膏5 g·L，NaCl 5 g·L。將KCrO溶解于去離子水中以制備Cr（Ⅵ）的儲(chǔ)備溶液（10 g·L）。完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低金屬濃度被認(rèn)為是最低抑制濃度（MIC），菌株T124的MIC值被確定為300 mg·L。

1.2 Cr（Ⅵ）濃度的測(cè)定

向含100 mg·LCr（Ⅵ）的95 mL LB 液體培養(yǎng)基中加入5 mL 活化12 h 后的菌液（OD=1），將其置于37 ℃的恒溫振蕩箱中以180 r·min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)48 h。設(shè)置無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基作為對(duì)照，以排除生物作用。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行。分別在第0、2、4、6、8、10、12、24 h 和48 h 時(shí)取出2 mL 樣品置于比色管中。樣品中的Cr（Ⅵ）濃度通過(guò)1，5-二苯碳酰二肼法測(cè)定：將0.2 g 1，5-二苯碳酰二肼溶解在50 mL 丙酮中，隨后加入12.5 mL 85%的磷酸、12.5 mL 95%的濃硫酸以及50 mL 的去離子水以獲得顯色劑；將2 mL顯色劑添加至取出的2 mL 待測(cè)樣品中并用無(wú)菌水稀釋至50 mL，在分光光度計(jì)上540 nm 處測(cè)定混合溶液中的Cr（Ⅵ）濃度。

1.3 菌株T124還原Cr（Ⅵ）的影響因素

為了對(duì)菌株T124還原Cr（Ⅵ）的環(huán)境條件進(jìn)行優(yōu)化，在不同碳源和不同共存離子的條件下測(cè)定其對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率。不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、乙酸鈉和甘露醇，15 mg·L，pH 7.0）下菌株對(duì)Cr（Ⅵ）的還原實(shí)驗(yàn)在Minimal salt medium（MSM）培養(yǎng)基（NaHPO6.0 g·L，KHPO3.0 g·L，NaCl 0.5 g·L，MgSO·7HO 0.246 g·L，CaCl0.5 g·L）中進(jìn)行，在含有不同碳源的培養(yǎng)基中分別加入100 mg·L的Cr（Ⅵ）和5 mL 活化后的菌液，將培養(yǎng)基置于恒溫振蕩箱（37 ℃、170 r·min）培養(yǎng)2 d 后取出測(cè)定Cr（Ⅵ）濃度。

1.4 SEM-EDS和XRD分析

通過(guò)離心（8 000 r·min、20 min）收集反應(yīng)完全后的細(xì)胞和沉淀物，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次。冷凍干燥后的樣品研磨后噴金即可上機(jī)。利用掃描電子顯微鏡&能譜儀（SEM & EDS，日本電子株式會(huì)社JSM-6360 LA型）對(duì)菌株的細(xì)胞形態(tài)和礦物沉淀的結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行觀察，并且利用能譜儀（EDS）對(duì)細(xì)胞表面成分和礦物沉淀成分進(jìn)行詳細(xì)的元素分析。

將離心后的沉淀物冷凍干燥并研磨成粉末，然后與光譜純KBr 以1 mg 樣品與100 mg KBr 的比例混合壓片。利用D-MAX2500 型X-射線衍射儀（XRD，日本理學(xué)）對(duì)沉淀物中的礦物成分進(jìn)行測(cè)定。測(cè)試參數(shù)為電壓40 kV、電流40 mA，2角度范圍為10°～90°，掃描速率為0.5°·min。使用MDI Jade 軟件（版本6，Materials，Data，Inc，美國(guó)）對(duì)XRD數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 拉曼光譜分析

利用LabRAM HR 型拉曼光譜儀（Horiba-Jobin，日本）分析與細(xì)菌細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的還原產(chǎn)物。制樣方法同1.4，將2 mg樣品粉末直接粘在雙面碳導(dǎo)電膠上，測(cè)試參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，分辨率為（2±1）cm，測(cè)量范圍為250～3 000 cm，使用最大倍數(shù)（50 倍）重復(fù)收集。

1.6 FT-IR和XPS分析

將反應(yīng)完全后的樣品以10 000 r·min離心20 min，得到的細(xì)胞重懸于100 mL 0.05 mol·L的磷酸鹽緩沖液中（PBS，pH 7.0），充分?jǐn)嚢瑁纬删鶆虻募?xì)胞懸液，然后再以10 000 r·min離心15 min。重復(fù)上述步驟3 次。將離心后的沉淀冷凍干燥并研磨成粉末，然后與光譜純KBr 以1 mg 沉淀粉末與100 mg KBr 的比例混合壓片，在10 t·cm下靜壓2 min。采用Perkin-Elmer-Spectrum One 型傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolt A vatar 370，美國(guó)尼高力儀器公司）收集波長(zhǎng)范圍為4 000～400 cm處的紅外光譜數(shù)據(jù)，掃描準(zhǔn)確度為4 cm。

利用PHI-5000 Versaprobe Ⅲ型X 射線光電子能譜儀（XPS，日本）分析沉淀物中Cr的價(jià)態(tài)。測(cè)試參數(shù)為掃描周期2 周期，掃描次數(shù)5 次，范圍200μm，分析儀模式為55 eV和280 eV，能量步長(zhǎng)為0.05 eV。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異檢驗(yàn)（LSD）確定變量之間的差異顯著性（＜0.05）。采用Origin 2020繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 Bɑcillus sp.T124還原Cr（Ⅵ）

如圖1a 所示，在接種細(xì)菌后的12 h 內(nèi)，溶液中的Cr（Ⅵ）濃度快速降低，接種12 h時(shí)的Cr（Ⅵ）去除率達(dá)到了26.9%；在12～48 h 內(nèi)去除率仍在升高，但是速率降低，營(yíng)養(yǎng)鹽被消耗導(dǎo)致的細(xì)菌生長(zhǎng)量和活性降低可能是Cr（Ⅵ）還原速率降低的原因之一。有研究表明，由碳源氧化產(chǎn)生的電子原本用于生物合成，但當(dāng)有Cr（Ⅵ）存在時(shí)，電子會(huì)被用于還原Cr（Ⅵ），從而減慢了生長(zhǎng)速度。另外從圖1b中可以明顯看出反應(yīng)48 h后紫色明顯變淡，這表明Cr（Ⅵ）濃度明顯降低，菌株對(duì)Cr（Ⅵ）的還原效果顯著。XU 等在對(duì)小球藻去除Cr（Ⅵ）的研究中發(fā)現(xiàn)，在最初的30 min內(nèi)小球藻快速去除Cr（Ⅵ），隨后去除速率趨于平穩(wěn)。DAS 等也發(fā)現(xiàn)，在存在的45 h 內(nèi)，初始Cr（Ⅵ）濃度越低，其還原速率越高，在Cr（Ⅵ）濃度為10 mg·L時(shí)的還原速率快于Cr（Ⅵ）濃度為50 mg·L和100 mg·L時(shí)的情況。當(dāng)Cr（Ⅵ）初始濃度為100 mg·L時(shí)，sp.T124 具有較高的Cr（Ⅵ）去除能力，在48 h 內(nèi)對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率為43.2%。在對(duì)照組中Cr（Ⅵ）濃度從101.32 mg·L降低至87.72 mg·L，這可能是Cr（Ⅵ）在弱堿性條件下被還原和設(shè)備儀器的誤差導(dǎo)致的，因此可以忽略非生物因素對(duì)Cr（Ⅵ）去除的影響，說(shuō)明sp. T124 可以從溶液中去除Cr（Ⅵ）。

圖1 Bɑcillus sp.T124在48 h內(nèi)對(duì)Cr（Ⅵ）的還原和還原前后溶液顏色的變化Figure 1 Reduction of Cr（Ⅵ）by Bɑcillus sp.T124 within 48 h and change of solution color before and after reduction

2.2 碳源和共存離子對(duì)Bɑcillus sp.T124 還原Cr（Ⅵ）的影響

菌株生長(zhǎng)過(guò)程中必需的物質(zhì)之一是碳源，不同碳源可能會(huì)對(duì)菌株還原Cr（Ⅵ）有不同影響，在MSN 介質(zhì)中研究了6 種不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、乙酸鈉和甘露醇）作為電子供體對(duì)菌株T124還原Cr（Ⅵ）的影響，結(jié)果如圖2a 所示。在接種sp. T124 的2 d 后，葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、乙酸鈉和甘露醇作為電子供體對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率分別為53.50%、76.59%、52.24%、10.28%、53.50%和19.24%（＜0.05），表明在這6 種碳源中，果糖是最合適的電子供體。葡萄糖、蔗糖以及乙酸鈉作為電子供體時(shí)的還原效果也較好，乳糖和甘露醇則不適合作為菌株還原Cr（Ⅵ）的電子供體。TAN 等發(fā)現(xiàn)果糖作為電子供體時(shí)，sp. CRB-B1 對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率最高，葡萄糖和蔗糖次之，其結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)相同。而DAS等在利用還原Cr（Ⅵ）時(shí)則發(fā)現(xiàn)葡萄糖是最合適的碳源，其次是果糖。DEY等發(fā)現(xiàn)利用甘油作為電子供體的效果最好，而蔗糖作為電子供體的效果最差。這說(shuō)明不同的菌株對(duì)碳源的適應(yīng)程度不同，更偏向于選擇果糖或葡萄糖作為電子供體。

圖2 不同碳源和不同共存離子對(duì)Bɑcillus sp.T124還原Cr（Ⅵ）的影響Figure 2 Effects of different carbon sources and co-existing ions on the reduction of Cr（Ⅵ）by Bɑcillus sp.T124

2.3 SEM-EDS和XRD分析

細(xì)菌細(xì)胞的SEM-EDS分析結(jié)果見(jiàn)圖3。在5 000倍放大倍數(shù)下，不含Cr（Ⅵ）的細(xì)菌細(xì)胞為長(zhǎng)桿狀，表面平坦且無(wú)孔（圖3a）。EDS的結(jié)果表明，未經(jīng)Cr（Ⅵ）處理的細(xì)菌樣品中不含Cr（Ⅵ）。如圖3b 所示，經(jīng)Cr（Ⅵ）處理后的sp.T124 的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，沒(méi)有破裂和穿孔，這表明濃度為100 mg·L的Cr（Ⅵ）不會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，該菌株可以耐受高達(dá)100 mg·L的Cr（Ⅵ）；另外還觀察到一些無(wú)定形物質(zhì)結(jié)垢附著在細(xì)胞表面，其可能是Cr（Ⅵ）生物還原過(guò)程中的還原產(chǎn)物。本研究進(jìn)一步對(duì)附著在細(xì)胞表面的無(wú)定形物質(zhì)進(jìn)行了EDS分析，結(jié)果在無(wú)定形物質(zhì)中檢測(cè)到了元素Cr。由于EDS 檢測(cè)的X 射線能量很高，并且可以穿透薄細(xì)菌細(xì)胞樣品，所以在消除其他干擾成分后，細(xì)胞表面的無(wú)定形顆粒物可以被視為含Cr物質(zhì)。SEM-EDS證實(shí)了檢測(cè)到的細(xì)胞表面有含Cr化合物的存在。LI等在用SEM-EDS分析經(jīng)過(guò)Cr（Ⅵ）處理48 h 的W1 細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，濃度為200 mg·L的Cr（Ⅵ）不會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生毒害作用，菌株的細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有變化，并且還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的無(wú)定形顆粒為含Cr 物質(zhì)。而有些細(xì)胞會(huì)因?yàn)镃r 的存在而發(fā)生形態(tài)變化，如CHEN 等在 分析了AR8 的細(xì)胞形態(tài)后發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)Cr（Ⅵ）處理的細(xì)胞具有規(guī)則光滑的表面，而經(jīng)Cr（Ⅵ）處理后的細(xì)胞是不規(guī)則、凹陷、起皺的形態(tài)，并且?guī)в幸恍┐┛?。sp.T124 在經(jīng)過(guò)高濃度的Cr（Ⅵ）處理后，細(xì)胞形態(tài)未有明顯變化，這表明sp. T124 具有Cr（Ⅵ）的高耐受性。

為了確定Cr（Ⅵ）還原過(guò)程中Cr（Ⅲ）的形成，通過(guò)XRD 掃描了經(jīng)過(guò)Cr（Ⅵ）處理的細(xì)菌細(xì)胞，結(jié)果如圖3c 所示。經(jīng)過(guò)Cr（Ⅵ）處理生成的產(chǎn)物在2為21.3°、31.66°和38.44°處顯示出3 個(gè)明顯的CrO沉淀峰，在使用標(biāo)準(zhǔn)JCPDS（參考代碼01-084-0312）對(duì)比后證實(shí)了CrO的存在，故可認(rèn)為產(chǎn)物中存在Cr（Ⅲ），且其是由Cr（Ⅵ）被sp.T124部分還原形成的。CHEN 等在利用XRD 掃描經(jīng)Cr（Ⅵ）處理的細(xì)菌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，在2為24.54°、33.66°、36.26°、39.83°、41.55°、44.27°、50.31°和54.95°處也出現(xiàn)了明顯的CrO沉淀峰。DHAL等在研究從鉻鐵礦土壤中分離出的sp.還原Cr（Ⅵ）時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相似的Cr（Ⅲ）沉淀。MOHITE 等報(bào)道了介導(dǎo)的Cr（Ⅵ）到Cr（Ⅲ）納米顆粒的生物轉(zhuǎn)化，并通過(guò)XRD分析得到了證實(shí)。而在KARTHIK等的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，strain G12處理Cr（Ⅵ）后，Cr 的峰主要出現(xiàn)在了27.4°、31.7°、45.8°和53.9°，對(duì)應(yīng)于這些峰的晶體組成與CrCl相似，因此推斷Cr（Ⅵ）確實(shí)被還原為了Cr（Ⅲ），且Cr（Ⅲ）與Cl復(fù)合在細(xì)菌表面形成了CrCl。

圖3 Cr（Ⅵ）處理前（a）后（b）Bɑcillus sp.T124的SEM-EDS圖像（×5 000倍）和Cr（Ⅵ）處理后（c）Bɑcillus sp.T124的XRD圖像Figure 3 SEM-EDS patterns（×5 000 times）of Bɑcillus sp.T124 of before（a）Cr（Ⅵ）treated cells and after Cr（Ⅵ）treated cells（b）XRD pattern of Bɑcillus sp.T124 of Cr（Ⅵ）treated cells（c）

2.4 拉曼光譜分析

拉曼光譜法是表征涉及分子結(jié)構(gòu)和重金屬基絡(luò)合物的強(qiáng)大工具，因此為了檢測(cè)細(xì)菌還原后Cr 可能的價(jià)態(tài)，通過(guò)拉曼光譜分析了經(jīng)Cr（Ⅵ）處理后的細(xì)菌細(xì)胞。如圖4 所示，Cr（Ⅵ）處理后的細(xì)胞及其相關(guān)產(chǎn)物在600 cm處顯示出清晰的特征峰，該峰與標(biāo)準(zhǔn)Cr（Ⅲ）相對(duì)應(yīng)。拉曼光譜分析的結(jié)果表明Bɑcillus sp. T124 確實(shí)還原了Cr（Ⅵ），并且細(xì)胞固定的Cr 為Cr（Ⅲ）。WANG 等利用共振拉曼光譜法和表面增強(qiáng)拉曼光譜法在單細(xì)胞水平上分析了Shewɑnellɑ oneidensis 對(duì)Cr（Ⅵ）到Cr（Ⅲ）的 影 響。RAVINDRANATH 等用表面增強(qiáng)拉曼光譜法證實(shí)了S. oneidensis MR-1 細(xì)胞內(nèi)Cr（Ⅵ）的減少。KARTHIK 等也 報(bào) 道 了Cellulosimicrobium funkei AR6 在經(jīng)Cr（Ⅵ）處理后，細(xì)胞在拉曼圖譜中600 cm附近區(qū)域顯示出強(qiáng)烈的特征峰。對(duì)Bɑcillus ɑmyloliquefɑciens 的Cr（Ⅵ）還原產(chǎn)物（沉淀物）進(jìn)行拉曼光譜分析發(fā)現(xiàn)，在600 cm附近區(qū)域存在Cr（Ⅲ）峰。因此，拉曼光譜的分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Bɑcillus sp.T124將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）。

2.5 FT-IR和XPS分析

XPS 是研究Cr（Ⅵ）還原過(guò)程中sp. T124細(xì)胞中的官能團(tuán)和元素Cr 化合價(jià)的有效分析方法。如圖5b 所示，從sp. T124 的XPS 調(diào)查光譜中監(jiān)測(cè)到3 個(gè)主要峰，分別位于286.31、400.63 eV 和532.83 eV 處，分別代表C 1s、N 1s 和O 1s。此外，在579 eV和48 eV處發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)弱峰，分別代表Cr 2p和Cr 3p。如圖5c 所示，在587.63 eV（Cr 2p）和577.50 eV（Cr 2p）附近出現(xiàn)了兩個(gè)不同的峰（從Cr 光譜獲得），表明Cr（Ⅵ）還原產(chǎn)物的化合價(jià)主要為Cr（Ⅲ）。同時(shí)也證明sp.T124 是通過(guò)還原而非吸附的方式去除了環(huán)境中的Cr（Ⅵ）。YAO 等在利用XPS 分析CY-1 還原Cr（Ⅵ）和Hg（Ⅱ）的產(chǎn)物化合價(jià)時(shí)得出了與本研究相似的結(jié)論。BAI等在利用XPS分析經(jīng)過(guò)Cr（Ⅵ）處理的時(shí)發(fā)現(xiàn)Cr 2p和Cr 2p存在分裂，形成了不同的還原產(chǎn)物，這證明了使Cr（Ⅵ）減少的途徑是還原而非吸附。以上結(jié)果進(jìn)一步證明sp. T124 對(duì)Cr（Ⅵ）的去除是通過(guò)生物還原這一途徑實(shí)現(xiàn)的，并且Cr的還原產(chǎn)物主要為Cr（Ⅲ）。

2.6 Bɑcillus sp.T124對(duì)Cr（Ⅵ）的去除機(jī)制

由本課題組前期研究可知，Cr（Ⅵ）還原的過(guò)程主要在細(xì)胞外進(jìn)行。對(duì)于特定的還原位點(diǎn)，菌株的每個(gè)組分均具有還原Cr（Ⅵ）的能力，但是每個(gè)組分的單獨(dú)還原能力完全不同?，F(xiàn)已知的Cr（Ⅵ）去除機(jī)制有生物吸附、細(xì)胞內(nèi)積累和生物還原，其中由還原酶在細(xì)胞壁膜上介導(dǎo)的生物還原是sp.T124去除Cr（Ⅵ）的主要途徑，sp. T124 分泌的還原酶大多數(shù)在細(xì)胞外實(shí)現(xiàn)對(duì)Cr（Ⅵ）的還原，可能是Cr（Ⅵ）的毒性限制了細(xì)胞內(nèi)還原的過(guò)程。SILVER等發(fā)現(xiàn)在利用硫酸鹽的生物細(xì)胞中，Cr（Ⅵ）是通過(guò)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道的膜被吸收。另外有研究表明，細(xì)胞外還原的Cr 主要是水溶性有機(jī)Cr（Ⅲ），這些Cr（Ⅲ）無(wú)法滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而部分在細(xì)胞內(nèi)被儲(chǔ)存于細(xì)胞質(zhì)中的Cr（Ⅲ）是由Cr（Ⅵ）還原而來(lái)。AHEMAD等也發(fā)現(xiàn)Cr通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，慢慢地在細(xì)胞內(nèi)積累，細(xì)胞內(nèi)的個(gè)別成分（有機(jī)酸、核酸和氨基酸等）可作為電子供體，而Cr（Ⅵ）作為電子受體接受電子后還原為Cr（Ⅲ）?？傮w來(lái)說(shuō)，細(xì)胞表面還原的Cr（Ⅵ）通常有一部分會(huì)被釋放到上清液中或者被官能團(tuán)所吸附，因此細(xì)胞外Cr（Ⅵ）的還原對(duì)菌本身起到了間接的保護(hù)作用，并且在Cr（Ⅵ）的轉(zhuǎn)移中不需要消耗額外的能量。

通常不同細(xì)菌對(duì)Cr（Ⅵ）的還原機(jī)制有所差別，影響還原的因素也有所不同。例如，有些細(xì)菌會(huì)利用Cr（Ⅵ）作為最終的電子受體，有些細(xì)菌則會(huì)利用分泌的可溶性酶將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）。此外，CHEN等指出蠟狀芽孢桿菌對(duì)Cr（Ⅵ）的還原與細(xì)胞壁膜有關(guān)，在本研究中靜止細(xì)胞較滲透細(xì)胞對(duì)Cr（Ⅵ）的還原量高出10.5%，也驗(yàn)證了這一結(jié)論，說(shuō)明Cr（Ⅵ）的還原受限于細(xì)胞壁膜的通透性。肖偉等也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁膜的通透性可以對(duì)Cr（Ⅵ）還原酶的作用產(chǎn)生影響。XRD 和拉曼分析進(jìn)一步證明了在細(xì)胞膜上sp.T124將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ），且還原產(chǎn)物為CrO，由FTIR 的結(jié)果得出烷基、羧基以及多糖參與了Cr（Ⅵ）的還原，減輕了Cr（Ⅵ）對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的毒性。XPS 分析為證明Cr（Ⅵ）的還原產(chǎn)物主要為Cr（Ⅲ）提供了更多的依據(jù)，并且說(shuō)明sp.T124對(duì)Cr（Ⅵ）的去除途徑是生物還原而非吸附，此結(jié)果和YAO等得到的反應(yīng)機(jī)制一致。

3 結(jié)論

（1）sp.T124 能有效去除Cr（Ⅵ），在48 h內(nèi)可去除43.2%的Cr（Ⅵ）。

（2）sp. T124 對(duì)Cr（Ⅵ）的還原效果主要受碳源和共存離子的影響。添加共存離子對(duì)Cr（Ⅵ）的還原產(chǎn)生了抑制作用，其中HCO的抑制效果最為明顯。

（3）表征分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了sp.T124 對(duì)Cr（Ⅵ）的去除主要是通過(guò)生物還原這一途徑實(shí)現(xiàn)的，并且Cr的還原產(chǎn)物主要為Cr（Ⅲ）。