徐建雪，薛寒光，黃弘毅，何岳巍，韓睿，彭星，黎娟*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南碧臣環(huán)境能源有限公司，長沙 410100；3.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；4.湖南聯(lián)合餐廚垃圾處理有限公司，長沙 410022）

烤后廢棄煙葉是指煙草行業(yè)中烘烤后不能使用的低等級或等級外煙葉，以及卷煙企業(yè)積存的霉變煙葉、煙末、煙梗等。煙葉在烘烤過程中，經(jīng)特定的溫度和濕度調(diào)節(jié)不斷脫水干燥，外觀質(zhì)量及內(nèi)部化學(xué)成分都會發(fā)生變化，因此烤后廢棄煙葉具有以下特點(diǎn)：（1）煙葉葉色發(fā)黃，葉片收縮干燥，出現(xiàn)溝壑；（2）有機(jī)質(zhì)含量豐富。鮮煙葉內(nèi)淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在烘烤過程中轉(zhuǎn)化為小分子的糖及氨基酸，烤后煙葉總糖含量為15%～35%，果糖與葡萄糖含量分別為烘烤前的5.51 倍和8.31 倍。煙草廢棄物屬于非賣品，需要規(guī)避流入市場造成假煙泛濫，目前對于烤后廢棄煙葉的處理方法主要有焚燒、水浸、毀形及填埋等，這些處理方法不僅會造成烤后廢棄煙葉資源的巨大浪費(fèi)，而且會產(chǎn)生濃煙、污水等環(huán)境污染物。

厭氧生物降解技術(shù)具有可回收生物質(zhì)能源、提供優(yōu)質(zhì)沼肥、殺滅病原菌等優(yōu)點(diǎn)，甲烷作為其主要生物質(zhì)能源，可實(shí)現(xiàn)與其他能源載體的靈活轉(zhuǎn)換，是可再生能源規(guī)?；l(fā)展的必要支撐。據(jù)統(tǒng)計，我國年產(chǎn)煙葉約480 萬t，在煙葉加工過程中會產(chǎn)生20%～25%的煙葉廢棄物，環(huán)境污染問題突出。利用烤后廢棄煙葉進(jìn)行厭氧發(fā)酵，能產(chǎn)生甲烷等清潔能源，沼渣、沼液制成有機(jī)肥還能用于改良煙田土壤。目前學(xué)術(shù)界和工業(yè)界大量厭氧消化的應(yīng)用研究都是以糧食作物秸稈和養(yǎng)殖等農(nóng)業(yè)廢棄物為研究對象，而對煙草等經(jīng)濟(jì)作物廢棄物的資源化利用研究較少。黃弘毅等利用烤后廢棄煙葉進(jìn)行甲烷潛力測試，發(fā)現(xiàn)烤后廢棄煙葉產(chǎn)甲烷潛力為252.7 mL·g（以揮發(fā)性固體計），是良好的生物質(zhì)原料。然而，烤后廢棄煙葉屬纖維素類原料，內(nèi)部緊密相連的木質(zhì)素、纖維素與半纖維素阻礙了微生物和酶對物料的降解。合理的預(yù)處理可以破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)、增大接觸面積、提高產(chǎn)氣效率。纖維素類物料的預(yù)處理方法主要有物理法、化學(xué)法、生物法以及物理化學(xué)法?；瘜W(xué)預(yù)處理需投入較高成本的化學(xué)試劑，操作復(fù)雜，易產(chǎn)生抑制物。生物預(yù)處理周期較長，生物酶及菌劑的成本高，難以大規(guī)模投入生產(chǎn)。物理化學(xué)預(yù)處理強(qiáng)度一般較高，物料有機(jī)成分易損失或變性轉(zhuǎn)化，且伴隨有抑制物生成等問題。物理預(yù)處理可降低生物質(zhì)的粒度或結(jié)晶度，破壞半纖維素和木質(zhì)素的結(jié)合層，增大物料的比表面積，提高纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率。AL AFIF 等通過簡單的物理預(yù)處理技術(shù)減小棉花稈粒徑不僅能增加甲烷產(chǎn)量，還能有效縮短棉花稈發(fā)酵周期。因此，找到一種既能保持烤后廢棄煙葉有機(jī)成分又能有效提高產(chǎn)甲烷效率的預(yù)處理方法尤為重要。

冷凍真空干燥（凍干）技術(shù)克服了傳統(tǒng)預(yù)處理高溫、高強(qiáng)度運(yùn)行條件導(dǎo)致的有機(jī)化學(xué)成分流失、轉(zhuǎn)化等問題，該技術(shù)利用水的三相原理，可在高真空、低溫狀態(tài)下，達(dá)到物料水分冰晶升華干燥的目的。凍干技術(shù)不僅能有效保持物料營養(yǎng)成分，還能在升華過程中留下冰晶孔隙，保持物質(zhì)外觀形態(tài)。目前，凍干技術(shù)已廣泛應(yīng)用于制藥與食品行業(yè)，凍干處理除了能夠較好地保持蛋白質(zhì)、脂肪及總酚等營養(yǎng)物質(zhì)，增加還原糖含量，還能保持疏松多孔的組織結(jié)構(gòu)。低溫條件下熱敏物質(zhì)不易變形，揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)不易揮發(fā)，從而有利于充分保持物料有機(jī)質(zhì)含量及原有特性。凍干預(yù)處理除了能保持物料特性與原有結(jié)構(gòu)，還能對物料中纖維素降解產(chǎn)生一定的影響。ROONI等通過對小麥秸稈進(jìn)行冷凍預(yù)處理得到結(jié)論：冷凍預(yù)處理對小麥秸稈纖維素含量無明顯影響，但能顯著增加纖維素的降解能力。QI等的研究表明，花生殼經(jīng)過冷凍預(yù)處理后，細(xì)胞發(fā)生分層與剝離，從而提高了生物質(zhì)回收效率。盡管我國真空冷凍干燥裝備產(chǎn)業(yè)齊全，在食品和中醫(yī)藥加工領(lǐng)域凍干技術(shù)也有廣泛的應(yīng)用，但鮮有利用凍干預(yù)處理技術(shù)輔助農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為高效、清潔生物質(zhì)能源的相關(guān)研究。

本研究旨在利用凍干技術(shù)既能保持物料物理形態(tài)結(jié)構(gòu)，又能最大程度保持發(fā)酵物料營養(yǎng)成分的特點(diǎn)，通過對烤后廢棄煙葉進(jìn)行不同時長的凍干預(yù)處理，進(jìn)行各表征參數(shù)分析，探索凍干預(yù)處理對烤后廢棄煙葉產(chǎn)甲烷潛力（BMP）的影響，以期為凍干預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷及廢棄煙葉資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用烤后廢棄煙葉為湖南省郴州市桂陽縣白云村當(dāng)季烘烤不合格煙葉，手動將烤后廢棄煙葉裁剪為約1 cm×1 cm 方形薄片后混合均勻，平均分成6 等份，置于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)用接種物取自中國山東民和牧業(yè)大型沼氣發(fā)電一期工程中以雞糞與廢水為原料的厭氧污泥，樣品置于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)開始前一周將接種泥在中溫（37 ℃）厭氧條件下進(jìn)行馴化，以消耗接種物中的殘留有機(jī)物，減小實(shí)驗(yàn)誤差。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，對接種物pH、總固體含量（Total solid，TS）、揮發(fā)性固體含量（Volatile solid，VS）進(jìn)行測定，結(jié)果顯示接種物pH為7.34，TS為2.46%，VS為1.33%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冷凍干燥預(yù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用凍干機(jī)（SCIENTZ-18N，寧波新芝生物科技股份有限公司）進(jìn)行樣品冷凍真空干燥預(yù)處理，設(shè)備主要由制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)以及電器儀表控制系統(tǒng)組成，實(shí)驗(yàn)過程示意圖見圖1。將裁剪好的6份烤后廢棄煙葉中的5份放入-20 ℃冰箱中冷凍24 h，冷凍結(jié)束后其中1 份直接常溫解凍備用（L1），其余4 份樣品分別在最低壓強(qiáng)20 Pa、最低溫度-50 ℃的凍干機(jī)中進(jìn)行不同時長（1、3、5、10 h）的凍干預(yù)處理，編號分別為L2、L3、L4、L5（表1）。

表1 預(yù)處理?xiàng)l件及煙葉含水率Table 1 Pretreatment settings and moisture content of cured tobacco leaves

1.2.2 物料產(chǎn)甲烷潛力測試

采用全自動甲烷潛力測試儀（MultiTalent-203，Nova Skantek 碧臣儀器）對烤后煙葉進(jìn)行BMP 測試。全自動甲烷潛力測試儀由A 單元（發(fā)酵單元）、B 單元（CO等酸性氣體吸附單元）、C單元（氣體計量及數(shù)據(jù)處理采集單元）3 個單元構(gòu)成，見圖1。A 單元由恒溫水浴鍋、發(fā)酵瓶和機(jī)械攪拌系統(tǒng)組成，恒溫水浴鍋保證發(fā)酵溫度，機(jī)械攪拌防止物料結(jié)殼、酸化；B 單元配備100 mL 玻璃瓶，其中的3 mol·L氫氧化鈉溶液用以吸附沼氣中的CO及HS 等酸性氣體；C 單元為甲烷氣體計量裝置，內(nèi)置脈沖信號數(shù)據(jù)自動采集系統(tǒng)及溫度、壓力傳感器，最終記錄結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)狀況下（0 ℃、101.3 kPa）的甲烷累積體積。

圖1 實(shí)驗(yàn)過程示意圖Figure 1 Schematic representation of the experimental processes

參考德國VDI 4630標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行BMP 測試，相關(guān)測試的主要參數(shù)見表2。500 mL 批式玻璃發(fā)酵瓶內(nèi)添加接種泥和烤后廢棄煙葉混合物400 g，在37 ℃水浴鍋中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，接種泥VS 質(zhì)量與烤后廢棄煙葉VS 質(zhì)量為2∶1。設(shè)置純接種泥厭氧發(fā)酵為空白對照，以消除接種物內(nèi)源性甲烷產(chǎn)量對物料BMP 的影響；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)纖維素（Sigma-C6288）作為對照試驗(yàn)物料，用于檢測接種物活性；每個處理進(jìn)行3 次重復(fù)。設(shè)備安裝完畢后，檢查設(shè)備氣密性，設(shè)置發(fā)酵瓶攪拌時間為5 min，攪拌速率為40 r·min，間隔時間為1 500 s。當(dāng)連續(xù)3 d 甲烷單日產(chǎn)量小于總產(chǎn)氣量1%時結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

表2 BMP測試條件設(shè)置Table 2 Conditions used to BMP test

1.3 分析方法

物料及接種物的TS、VS 采用質(zhì)量法測定，在105 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定后測定TS，在馬弗爐中550 ℃灼燒至質(zhì)量恒定后稱質(zhì)量計算VS。掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）結(jié)果由掃描電子顯微鏡（日立TM3030）掃描烤后廢棄煙葉表面得到。傅里葉紅外光譜（FTIR）分析采用固體溴化鉀壓片法，取400～4 000 cm波長進(jìn)行色譜分析。煙堿含量采用紫外分光光度法測定，準(zhǔn)確稱取1 g 干燥烤后廢棄煙葉粉末于250 mL 錐形瓶，加入蒸餾水、沸石與飽和HCl 振蕩搖勻，過濾定容至250 mL 錐形瓶，用紫外分光光度儀測定樣品溶液煙堿含量。總糖含量采用流動分析法測定，精確稱取0.5 g干燥烤后廢棄煙葉粉末于錐形瓶，加入3%醋酸水溶液100 mL，振蕩搖勻30 min，過濾后得醋酸樣液，然后采用流動分析儀進(jìn)行檢測。對每個處理均進(jìn)行3 組重復(fù)樣品測定，測定結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 烤后廢棄煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)變化

SEM 是觀察物料物理結(jié)構(gòu)變化的有效方法之一。為深入探究凍干預(yù)處理對烤后煙葉微觀表面結(jié)構(gòu)變化與BMP 的關(guān)系，對預(yù)處理前后烤后廢棄煙葉進(jìn)行SEM 分析，結(jié)果如圖2 所示。由SEM 圖可知，未經(jīng)預(yù)處理的烤后廢棄煙葉L0 表面結(jié)構(gòu)紋理飽滿整齊；經(jīng)預(yù)處理后的烤后廢棄煙葉表面變得皺縮粗糙，且伴隨有顆粒狀的析出物。這表明在冷凍過程中烤后廢棄煙葉結(jié)構(gòu)受損、細(xì)胞膜碎片化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和失水，出現(xiàn)組織收縮和細(xì)胞塌陷變形，這與SEMENOV 等的研究結(jié)果一致。在凍干技術(shù)的真空升華過程中，烤后廢棄煙葉內(nèi)部多余水分直接升華，水分冰晶化時表面呈現(xiàn)褶皺和卷曲，但孔洞和裂隙結(jié)構(gòu)被保留下來，從而產(chǎn)生疏松多孔的物理結(jié)構(gòu)。凍干預(yù)處理與冷凍預(yù)處理相比，表面析出物更少，且隨著凍干時間的增加，表面顆粒狀物質(zhì)越來越少。在冷凍過程中，由于細(xì)胞失水，煙葉細(xì)胞組織出現(xiàn)不同程度的損傷，營養(yǎng)物質(zhì)隨水分析出至表面；在升華及解析干燥過程中，溫度升高及壓差作用造成揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)部分損失，所以干燥時間越長，烤后廢棄煙葉表面顆粒物越少。

圖2 烤后煙葉掃描電鏡圖（×500倍）Figure 2 Scanning electron microscope of cured tobacco leaves（×500 times）

2.2 烤后廢棄煙葉木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)變化

圖3 煙葉傅里葉紅外光譜圖Figure 3 FTIR spectra of raw and steam explosion pre-treated cured tobacco leaves

2.3 烤后廢棄煙葉總糖及煙堿含量

煙葉經(jīng)烘烤后，淀粉含量減少，糖類物質(zhì)增加，在烘烤過程中，占煙葉干物質(zhì)質(zhì)量約25%的淀粉轉(zhuǎn)化為糖，烤后煙葉總糖含量為25%～35%，是良好的厭氧生物發(fā)酵原料。由圖4 可知，與未處理煙葉L0 相比，冷凍與凍干烤后廢棄煙葉總糖含量降低，且隨著凍干時間的延長，總糖含量逐漸降低。L0 總糖含量最高，為19.78%，分別高出L1、L2、L3、L4 及L5 處理0.33、0.66、0.57、1.09、1.04 個百分點(diǎn)。HARGUINDEGUY 等的研究表明，在冷凍過程中葡萄糖、蔗糖及麥芽糖等碳水化合物會隨水分析出，從而造成部分營養(yǎng)成分流失。張康逸等采用凍干處理技術(shù)對谷物營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，長時間凍干會導(dǎo)致谷物營養(yǎng)成分損失。在本研究中的解析干燥階段，由于內(nèi)外壓差與濃度差較大，物質(zhì)發(fā)生擴(kuò)散，疏松多孔的良好蜂窩狀結(jié)構(gòu)使烤后廢棄煙葉中的糖類物質(zhì)更容易逸出。

圖4 煙葉煙堿及總糖含量Figure 4 Nicotine and total sugar content of cured tobacco leaves

煙堿是煙草中特有的次生代謝產(chǎn)物，在煙草多種生物堿中煙堿所占比例最高，超過90%，占煙草植株干質(zhì)量的0.6%～3.0%。由圖4 可知，L0 煙堿含量最高為1.93%，其次為L4、L5、L1、L3，L2 煙堿含量最低，為1.75%，隨著凍干時間的延長，L3、L4、L5 處理的煙堿含量略有升高。煙堿在60 ℃時能與水反應(yīng)生成相應(yīng)的水合物，但是低溫環(huán)境下煙堿不易溶于水，且凍干預(yù)處理煙葉在干燥過程中糖類等有機(jī)物質(zhì)損失，煙堿相對含量增加，所以經(jīng)過長時間冷凍干燥預(yù)處理后煙堿含量略有增加。

2.4 不同處理煙葉的BMP

BMP指標(biāo)準(zhǔn)狀況下單位質(zhì)量VS在厭氧條件下的產(chǎn)甲烷量（mL·g）。BMP 測試可以評估厭氧條件下有機(jī)物料的生物可降解性及產(chǎn)甲烷潛力，還可以監(jiān)測發(fā)酵過程中的微生物抑制及毒性作用等，是評判物料厭氧發(fā)酵可行性的一大重要指標(biāo)。

經(jīng)23 d厭氧發(fā)酵后，不同處理烤后廢棄煙葉每日甲烷產(chǎn)量及單位VS累積甲烷產(chǎn)量如圖5和圖6所示。由圖5 可知，所有處理均在第3 天時達(dá)到甲烷產(chǎn)氣高峰，且L3 產(chǎn)氣速率（83.51 mL·d）最快，較其他處理高13.89%～25.33%。包括L0 在內(nèi)的所有處理每日產(chǎn)甲烷速率均呈現(xiàn)相同趨勢，即前期快速增長，發(fā)酵第3 d達(dá)到產(chǎn)氣高峰后緩慢下降。造成烤后廢棄煙葉產(chǎn)氣前期快后期緩慢的原因是：發(fā)酵前期，水解酸化菌在短暫的適應(yīng)期后快速繁殖，將纖維素、半纖維素等易分解有機(jī)物分解轉(zhuǎn)化為產(chǎn)甲烷菌可直接利用的乙酸等有機(jī)物。易降解有機(jī)物水解酸化結(jié)束后，相對難降解的有機(jī)物才逐步被分解，所以此時產(chǎn)氣速率緩慢下降，并逐漸趨零。

圖5 煙葉每日甲烷產(chǎn)量Figure 5 Daily methane yields of cured tobacco leaves

圖6 煙葉累積甲烷產(chǎn)量Figure 6 Cumulative methane yields of cured tobacco leaves

由圖6可知烤后廢棄煙葉經(jīng)23 d厭氧發(fā)酵后，L0處理的BMP（200.74 mL·g）最低，L3 處理的BMP（224.28 mL·g）最高，其次為L2、L4、L5 和L1。與L0相比，其他處理烤后廢棄煙葉BMP 顯著增加（＜0.05），其中L2及L3處理的BMP 與L0呈極顯著差異，L1、L4 及L5 處理呈現(xiàn)顯著差異。與L0 相比，L1 處理BMP 增加3.94%，L3 處理BMP 增加11.73%，其他凍干預(yù)處理BMP 增加4.26%～10.08%，L2、L4 與L5 處理BMP 分別為220.98、211.11 mL·g和209.30 mL·g。凍干預(yù)處理烤后廢棄煙葉水分從冰晶狀直接升華，所占空間仍然保留，物料疏松多孔，收縮較小，疏松多孔的蜂窩結(jié)構(gòu)有利于微生物與物料接觸，有利于煙葉降解，所以凍干預(yù)處理烤后廢棄煙葉累積甲烷產(chǎn)量大于冷凍預(yù)處理。然而，凍干時間超過3 h后，隨凍干預(yù)處理時間增加烤后廢棄煙葉累積甲烷產(chǎn)量逐漸降低。造成BMP 隨凍干時間延長而下降的原因主要有3 個方面：第一方面為烤后廢棄煙葉有機(jī)物損失。延長凍干時間后，由于較大的內(nèi)外壓差與濃度差，物質(zhì)發(fā)生擴(kuò)散，烤后廢棄煙葉糖類物質(zhì)及揮發(fā)性有機(jī)物逸出；第二方面是烤后廢棄煙葉熱敏物質(zhì)變性?？竞髲U棄煙葉經(jīng)過烘烤后含水量較低，所需干燥時間比含水量豐富的新鮮菠菜（干燥時間5～6 h）、新鮮香椿（干燥時間5 h）等葉片類物料短，約在3 h 時烤后廢棄煙葉已完成干燥，進(jìn)行解析干燥的溫度逐漸升高會造成蛋白質(zhì)等熱敏物質(zhì)變性，使烤后廢棄煙葉營養(yǎng)品質(zhì)下降，影響產(chǎn)氣效率；第三方面為煙堿抑制作用。由于長時間的解析干燥，烤后廢棄煙葉中的糖類等有機(jī)質(zhì)損失，煙堿相對含量增加，而LIU 等研究表明煙堿對厭氧微生物種群活性有一定程度的抑制作用，與本文結(jié)果一致，所以煙堿含量越高，甲烷產(chǎn)量越低。

3 結(jié)論

（1）凍干預(yù)處理不僅能很好地保持烤后廢棄煙葉的營養(yǎng)品質(zhì)，還能有效增大微生物接觸面積，增加甲烷產(chǎn)量。與未處理煙葉相比，預(yù)處理烤后廢棄煙葉整個發(fā)酵周期無抑制和滯后現(xiàn)象，產(chǎn)甲烷潛力提高了3.94%～11.73%。

（2）凍干預(yù)處理具有低溫、高真空的特點(diǎn)，因此能耗較高，且隨著凍干預(yù)處理時間的延長，在相對內(nèi)外壓差與濃度差較大的環(huán)境中，物質(zhì)發(fā)生擴(kuò)散，容易造成有機(jī)物質(zhì)損失。在烤后廢棄煙葉凍干預(yù)處理的后續(xù)研究中，應(yīng)定量分析預(yù)處理過程中有機(jī)物損失情況；并平衡好甲烷產(chǎn)量提升與預(yù)處理能耗的關(guān)系，控制預(yù)處理時間，優(yōu)化凍干工藝。

（3）冷凍預(yù)處理能解除烤后廢棄煙葉水解限速，對甲烷產(chǎn)量有一定的提升作用。對于寒溫帶及中溫帶等冬季溫度較低的地區(qū)，可結(jié)合自然氣候條件對纖維類農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行室外冷凍存儲，優(yōu)化沼氣工程原料供應(yīng)及運(yùn)輸調(diào)配，提升酸化水解效率，促進(jìn)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化高效利用。