羅秋萍，李虎*，蘇建強(qiáng)

（1.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，福州 350002；2.中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所，城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén) 361021）

酚醛泡沫是由酚醛樹(shù)脂、乳化劑、發(fā)泡劑和添加劑在酸堿催化劑作用下合成的多孔徑聚合材料，目前使用較多的添加劑主要包括增塑劑、纖維、微米粒子和納米粒子等。20 世紀(jì)50 年代以來(lái)，酚醛泡沫被廣泛用于花卉行業(yè)，在植物生長(zhǎng)的早期階段作為育苗或繁殖介質(zhì)使用。酚醛泡沫回收成本高，因此使用后直接殘留于土壤，同時(shí)酚醛泡沫普遍具有脆性和密度低、易破碎等特點(diǎn)，從生產(chǎn)、使用到處置過(guò)程中易破碎形成微塑料（MPs，直徑＜5 mm），并向環(huán)境中釋放具有生物毒性的單體化合物，如酚類(lèi)化合物和增塑劑等，因此被視為新污染物。

環(huán)境中的MPs 普遍具有溶解度低、持久性強(qiáng)、粒徑范圍廣和性質(zhì)復(fù)雜等特點(diǎn)，有研究提出超過(guò)60%的MPs是“環(huán)境友好型”，低氧和低光照條件使土壤中的MPs 難以降解，因此MPs 能在土壤中長(zhǎng)期存在。已有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的塑料碎片在老化期間會(huì)釋放出鄰苯二甲酸酯類(lèi)增塑劑。MPs 污染引起的生物學(xué)效應(yīng)包括物理毒性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷、炎癥、免疫反應(yīng)、DNA 損傷以及神經(jīng)毒性和代謝作用等。目前關(guān)于MPs的研究主要針對(duì)聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）和聚乳酸（PLA）等聚合物。研究發(fā)現(xiàn)大部分塑料碎片對(duì)生物具有低致死性。MPs被攝食、消化等過(guò)程可能會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生長(zhǎng)期脅迫，改變土壤細(xì)菌、真菌的群落組成和功能，影響土壤的碳氮循環(huán)過(guò)程。

盡管酚醛樹(shù)脂聚合物被廣泛使用的時(shí)間比其他塑料聚合物更早，但有關(guān)酚醛樹(shù)脂對(duì)生物毒性作用的研究卻較少。研究發(fā)現(xiàn)酚醛樹(shù)脂對(duì)大鼠經(jīng)口急性毒性LD＞16 000 mg·kg，該研究提出酚醛樹(shù)脂的急性毒性作用很大程度上取決于材料中的游離酚含量。近年來(lái)MPs污染引起了廣泛關(guān)注，然而關(guān)于酚醛泡沫MPs 的研究仍然有限。TRESTRIAL 等研究發(fā)現(xiàn)酚醛泡沫MPs會(huì)在淡水和海洋生物體中積累，MPs及其浸出的有毒化合物會(huì)影響細(xì)胞酶活性。因此，酚醛泡沫的累積殘留可能會(huì)對(duì)土壤系統(tǒng)造成巨大壓力。蚯蚓是土壤中最大、最常見(jiàn)的類(lèi)群之一，其普遍存在于各種環(huán)境中，并可通過(guò)攝食、消化、排泄、分泌和掘穴等活動(dòng)影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞，還可作為土壤環(huán)境的指示生物。由于MPs 具有體積小、易遷移的特性，因此其可能會(huì)被土壤動(dòng)物誤以為是食物而被攝食吸收，從而對(duì)動(dòng)物自身的生長(zhǎng)繁殖及其生長(zhǎng)環(huán)境產(chǎn)生不良影響。

農(nóng)用酚醛泡沫主要用作蔬菜育苗的栽培基質(zhì)，幼苗移植時(shí)該酚醛泡沫連同植物根系一起進(jìn)入土壤，植物收獲后酚醛泡沫因回收困難而大部分殘留于土壤中，且其外力作用容易破碎形成微小顆粒物。雖然在成分檢測(cè)中一些有害物質(zhì)不超標(biāo)，但易破碎、易遷移的特性使酚醛泡沫施用于土壤后一方面可能會(huì)對(duì)土壤物理結(jié)構(gòu)及功能造成危害；另一方面，在土壤動(dòng)物及微生物等的代謝作用下，酚醛泡沫的次生產(chǎn)物可能對(duì)土壤動(dòng)物及其生長(zhǎng)環(huán)境造成威脅，影響土壤的新陳代謝。目前對(duì)農(nóng)用酚醛泡沫安全性的評(píng)價(jià)還停留在成分檢測(cè)上，有關(guān)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中酚醛泡沫使用對(duì)土壤動(dòng)物及微生物影響的評(píng)價(jià)仍十分缺乏，從而造成材料安全性評(píng)估不夠全面準(zhǔn)確。

因此，本文以農(nóng)用酚醛泡沫MPs 為主要試驗(yàn)對(duì)象，參照經(jīng)濟(jì)與合作發(fā)展組織（OECD）制定的蚯蚓急性毒性試驗(yàn)方法，以赤子愛(ài)勝蚓為模式土壤動(dòng)物，應(yīng)用人工土壤法分別于第7 d和第14 d測(cè)定受試物對(duì)蚯蚓的急性毒性效應(yīng)，并探究酚醛泡沫對(duì)蚯蚓抗氧化酶活性的影響；測(cè)定土壤呼吸速率、中性磷酸酶和脲酶活性，探討不同質(zhì)量濃度酚醛泡沫在土壤中連續(xù)存在64 d后對(duì)土壤及功能酶的影響，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中酚醛泡沫的施用提供重要數(shù)據(jù)支撐，為農(nóng)業(yè)管理提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蚯蚓急性毒性試驗(yàn)

選用江蘇省句容市王軍蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)繁殖的同一批次赤子愛(ài)勝蚓作為受試生物，試驗(yàn)前先將蚯蚓在未添加酚醛泡沫的人工土壤中培養(yǎng)馴化7 d，人工土壤具體組分及配比為：70%石英砂，20%高嶺黏土，10%泥炭蘚（以干質(zhì)量計(jì)），添加碳酸鈣調(diào)節(jié)pH 為6.5～7.0。各組分混合均勻后，加入去離子水調(diào)節(jié)含水量為35%左右，人工土壤添加0.5%的燕麥作為蚯蚓生活所需營(yíng)養(yǎng)。在溫度為（20±2）℃的條件進(jìn)行避光培養(yǎng)，馴化7 d后挑選生殖環(huán)帶明顯且大小一致、質(zhì)量在300～400 mg的蚯蚓清腸，進(jìn)行毒性試驗(yàn)。

試驗(yàn)選用的農(nóng)用酚醛泡沫來(lái)自福建天利高新材料有限公司，是由苯酚、甲醛、鄰苯二甲酸酯等物質(zhì)在堿性催化劑下通過(guò)高溫發(fā)泡而成的微孔發(fā)泡材料，其孔隙率可達(dá)95%，材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，吸水性好（可達(dá)95%），保水性和絕熱性能好，植物根系受外界溫度影響小，pH 呈中性，可作為多種植物生長(zhǎng)的基質(zhì)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)詳見(jiàn)MOUGEL 等文獻(xiàn)的描述。本試驗(yàn)所用酚醛泡沫中的毒性物質(zhì)（如甲醛、苯酚、鄰苯二甲酸酯類(lèi)等）通過(guò)氣相色譜儀（7890A；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國(guó)）、液相色譜儀（UltiMate 3000；Thermo Scientific，Waltham，美國(guó)）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（2020NX；SHIMADZU，日本）測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均低于檢出限（5 mg·kg），故后續(xù)未進(jìn)行毒性物質(zhì)檢測(cè)。

參照OECD No.207 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則和《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》（GB/T 31270.15—2014）第15 部分，采用人工土壤法分別于第7天和第14天測(cè)定蚯蚓的急性毒性，每個(gè)重復(fù)添加750 g人工土壤（按干質(zhì)量計(jì)算），將石英砂525 g、高嶺黏土150 g、泥炭蘚75 g和燕麥3.75 g 裝入白色透明帶蓋塑料盒中，并加入262.5 g 超純水以維持35%的土壤濕度。依據(jù)準(zhǔn)則建議設(shè)7 個(gè)處理組，參照微塑料粒徑（＜5 mm）和已有文獻(xiàn)研究，將酚醛泡沫揉成碎屑，用2 mm 篩網(wǎng)過(guò)濾酚醛泡沫顆粒（在實(shí)際生產(chǎn)中，該酚醛泡沫大多是以2.2 cm×2.2 cm×1.8 cm 的方塊大小連同植物根系一起進(jìn)入土壤中，經(jīng)外力作用破碎成顆粒態(tài)物質(zhì)混合進(jìn)入土壤，表觀形態(tài)與土壤無(wú)顯著差別）。酚醛泡沫MPs的添加量分別為1、10、100、1 000 mg·kg；并模擬田間實(shí)際使用量，估算該酚醛泡沫使用2 a 和5 a 后的含量作為處理中的高含量組（假設(shè)該酚醛泡沫不被降解，模擬小番茄育苗的酚醛泡沫使用量，一年種植5 茬作物，一年的平均使用量約1 g·kg），添加量分別為2 000、5 000 mg·kg。稱(chēng)取定量的酚醛泡沫MPs（≤2 mm）加入到已混好的人工土壤中，再次攪拌混勻。另設(shè)不添加酚醛泡沫的對(duì)照組（CK），每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放置10條生長(zhǎng)形態(tài)相近且活性較好的赤子愛(ài)勝蚓。于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠，HWS-450）中避光培養(yǎng)，每2～3 d 添加1 次去離子水以保持35%的土壤濕度，溫度為（20±2）℃。分別于培養(yǎng)第7 天和第14 天觀察并記錄蚯蚓的存活數(shù)量，用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無(wú)反應(yīng)則為死亡，試驗(yàn)期間對(duì)照組死亡率控制在10%以內(nèi)。

1.2 蚯蚓酶活性的測(cè)定

為進(jìn)一步分析酚醛泡沫MPs 對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的毒性效應(yīng)，采用人工土壤按照上述生長(zhǎng)條件在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)64 d，假設(shè)蚯蚓在14 d不致死的條件下再持續(xù)培養(yǎng)50 d。試驗(yàn)期間只添加去離子水保持土壤濕度，不添加燕麥等食物。通過(guò)蚯蚓酶活性、土壤酶活性和土壤呼吸速率進(jìn)一步表征酚醛泡沫的生理毒性。

蚯蚓酶活性測(cè)定中，蚯蚓蛋白液處理參照WANG等的方法。具體步驟為：分別從各處理組取3 條生長(zhǎng)形態(tài)相近的赤子愛(ài)勝蚓，置于含生理鹽水的培養(yǎng)皿中，于黑暗條件下清腸24 h，用去離子水洗凈體表，吸干水分，稱(chēng)質(zhì)量后剪碎，按1∶10（/）加入生理鹽水，用手持超聲勻漿機(jī)研磨勻漿，在10 000×、4 ℃下離心15 min，上清液即為10%的蚯蚓勻漿液，以上操作均在4 ℃下進(jìn)行。收集的上清液用于測(cè)定蚯蚓的抗氧化酶活性。上清液蛋白質(zhì)含量使用生工生物工程股份有限公司的改良型BCA 法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒測(cè)定；超氧化物歧化酶（SOD）選用SOD測(cè)定試劑盒（WST-1 法）測(cè)定；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）選用GSH-Px測(cè)定試劑盒（比色法）測(cè)定。

1.3 土壤酶活性和呼吸速率的測(cè)定

土壤酶活性和呼吸速率的取樣時(shí)間與蚯蚓相同。測(cè)定方法為：稱(chēng)取風(fēng)干土0.1 g，采用土壤中性磷酸酶（Soil neutral phosphatase，S-NP）活性測(cè)定試劑盒測(cè)定S-NP活性，S-NP活性以每小時(shí)每克土樣水解產(chǎn)生1 nmol PNP 表示（nmol·g·h）；稱(chēng)取風(fēng)干土0.2 g，按照土壤脲酶（Solid-Urease，S-UE）活性測(cè)定試劑盒測(cè)定S-UE 活性，S-UE 活性以每克土樣中產(chǎn)生1 μg NH-N 表示（U·g）。酶活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

稱(chēng)取5 g 新鮮的人工土壤放入120 mL 血清瓶中，25 ℃孵育24 h 后使用氣相色譜儀（7890A；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國(guó)）測(cè)定1 h 和5 h 的頂空氣體中的CO含量，所測(cè)CO產(chǎn)氣差值即為土壤呼吸速率，以μmol·g·h表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019 計(jì)算整理，差異顯著性（One way ANOVA，＜0.05）和相關(guān)性分析采用IBM SPSS Statistics 26.0，柱狀圖和線性相關(guān)分析結(jié)果圖采用Origin 2021繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚醛泡沫對(duì)蚯蚓的致死作用

酚醛泡沫處理7 d 和14 d 的結(jié)果如圖1 所示。從圖中可以看出，不同含量酚醛泡沫處理中蚯蚓存活率與不添加酚醛泡沫的對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明該酚醛泡沫對(duì)蚯蚓無(wú)急性致死作用。

圖1 酚醛泡沫對(duì)赤子愛(ài)勝蚓存活的影響Figure 1 Effects of phenolic foam on the survival of earthworms

2.2 酚醛泡沫對(duì)蚯蚓GSH-Px及SOD活性的影響

培養(yǎng)64 d 后，赤子愛(ài)勝蚓GSH-Px 及SOD 活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)照組中蚯蚓GSH-Px 活性為15.06 U·mg，添加酚醛泡沫的各處理組的活性為27.47～56.96 U·mg（圖2A），是對(duì)照組的1.82～3.78倍。酚醛泡沫添加顯著（＜0.05）增強(qiáng)了蚯蚓GSH-Px活性。對(duì)照組蚯蚓SOD 活性為20.81 U·mg，添加酚醛泡沫的各處理組的活性為32.43～58.10 U·mg（圖2B），是對(duì)照組的1.56～2.75 倍，高含量酚醛泡沫處理（2 000、5 000 mg·kg）顯著（＜0.05）增加了蚯蚓SOD活性。

圖2 酚醛泡沫對(duì)蚯蚓谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）的影響Figure 2 Effects of phenolic foam on the activities of glutathione peroxidase（GSH-Px）and superoxide dismutase（SOD）in earthworm

2.3 酚醛泡沫對(duì)土壤酶活性和呼吸速率的影響

土壤S-NP 和S-UE 活性變化如圖3 所示。S-NP活性為787.01～1 192.03 nmol·g·h（圖3A），S-UE 活性為860.69～1 066.71 U·g（圖3B），各處理組S-NP和S-UE 活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異，表明該酚醛泡沫對(duì)相關(guān)微生物活性無(wú)顯著影響。

圖3 酚醛泡沫對(duì)土壤中性磷酸酶（S-NP）和脲酶（S-UE）活性的影響Figure 3 Effects of phenolic foam on the activities of neutral phosphatase（S-NP）and urease（S-UE）in soils

土壤呼吸速率如圖4所示。對(duì)照組土壤呼吸速率為0.067μmol·g·h，而添加酚醛泡沫處理的土壤呼吸速率為0.041～0.055 μmol·g·h，顯著低于對(duì)照組（＜0.05，圖4A）。相關(guān)性分析（圖4B）表明，土壤呼吸速率與酚醛泡沫含量顯著負(fù)相關(guān)（=-0.652，＜0.05），證明酚醛泡沫對(duì)土壤呼吸存在顯著抑制作用（＜0.05）。

圖4 酚醛泡沫對(duì)土壤呼吸速率的影響及添加量與土壤呼吸的相關(guān)關(guān)系Figure 4 Effects of phenolic foam on carbon respiration of soil microbes and correlation analysis between phenolic foam and soil respiration rate

3 討論

蚯蚓急性毒性試驗(yàn)可以快速地對(duì)污染物生態(tài)毒性予以初步判斷，試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際土壤中觀察到的結(jié)果有較好的相關(guān)性，可為慢性毒性試驗(yàn)和田間試驗(yàn)的濃度或劑量設(shè)計(jì)提供依據(jù)。酚醛泡沫在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，殘留于土壤中的酚醛泡沫受外力作用后會(huì)破碎為細(xì)小顆粒物，這些細(xì)小顆粒物可能對(duì)土壤及土壤動(dòng)物造成不良影響。然而酚醛泡沫MPs 施用量對(duì)土壤動(dòng)物和土壤活性的影響尚不明確，由OECD制定的人工土壤法能很好地模擬蚯蚓生活的自然環(huán)境，可以全面地了解酚醛泡沫殘留對(duì)土壤動(dòng)物及其生長(zhǎng)環(huán)境的影響，考察蚯蚓在短期暴露下SOD 和GSH-Px 活性的變化趨勢(shì)；同時(shí)可以測(cè)定土壤S-UE和S-NP 活性，并通過(guò)土壤呼吸進(jìn)一步判斷土壤有機(jī)碳含量的變化。

研究發(fā)現(xiàn)MPs 影響土壤微生物組成、活性及功能；土壤酶活性是微生物活性和土壤肥力的重要指標(biāo)，S-UE 和磷酸酶活性與土壤能量流動(dòng)和養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)，常被用作污染土壤應(yīng)激下土壤健康狀況變化的指標(biāo)。磷酸酶對(duì)土壤磷化合物的水解有促進(jìn)作用；S-UE活性可以指示土壤的供氮能力，與土壤中氮轉(zhuǎn)化和植物對(duì)氮素的吸收利用密切相關(guān)。S-UE和磷酸酶活性對(duì)評(píng)價(jià)酚醛泡沫對(duì)土壤環(huán)境的影響具有重要意義。本研究各處理組中S-NP 和S-UE 活性均無(wú)顯著變化（圖3），表明當(dāng)該酚醛泡沫使用量小于5 000 mg·kg時(shí)對(duì)微生物活性和土壤肥力沒(méi)有顯著影響。土壤呼吸是土壤有機(jī)碳礦化向大氣環(huán)境釋放CO的主要過(guò)程，可反應(yīng)土壤有機(jī)碳的分解狀況和微生物的活性，也是評(píng)價(jià)土壤健康的重要參數(shù)。本研究結(jié)果表明土壤呼吸即可被1 mg·kg酚醛泡沫顯著抑制（＜0.05，圖4A），且呼吸速率與酚醛泡沫含量顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05，圖4B）。酚醛泡沫可能會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，降低其活性。研究發(fā)現(xiàn)MPs會(huì)導(dǎo)致土壤呼吸速率下降，影響微生物的生長(zhǎng)繁殖。本研究結(jié)果表明，酚醛泡沫MPs 降低了微生物呼吸強(qiáng)度，酚醛泡沫中易分解的碳組分含量很低，這可能會(huì)進(jìn)一步影響碳周轉(zhuǎn)速率。已有研究表明MPs 可能通過(guò)與土壤動(dòng)物相互作用來(lái)改變土壤環(huán)境，并對(duì)土壤動(dòng)物的適應(yīng)性和土壤微生物豐度及功能產(chǎn)生潛在影響。本研究對(duì)赤子愛(ài)勝蚓急性毒性、蚯蚓抗氧化酶活性及土壤活性和呼吸速率進(jìn)行了研究，對(duì)于評(píng)價(jià)顆粒態(tài)酚醛泡沫對(duì)土壤動(dòng)物、微生物活性及功能的影響具有一定意義。該酚醛泡沫使用后在土壤環(huán)境中隨意被丟棄，光解作用和農(nóng)耕活動(dòng)等破碎產(chǎn)生的顆粒物粒徑和單位面積殘留量不一，實(shí)際殘留粒徑可能遠(yuǎn)大于2 mm，而暴露濃度可能低于試驗(yàn)中的高濃度處理，本試驗(yàn)放大了該酚醛泡沫對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)，其對(duì)實(shí)際的土壤環(huán)境影響會(huì)更小。為了更加全面理清酚醛泡沫使用的安全性，酚醛泡沫對(duì)農(nóng)田土壤微生物群落組成、豐度及功能的影響需要更加深入的研究。

4 結(jié)論

（1）酚醛泡沫對(duì)赤子愛(ài)勝蚓無(wú)致死作用，但可誘導(dǎo)蚯蚓抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)。

（2）該酚醛泡沫添加對(duì)土壤中性磷酸酶和脲酶活性均沒(méi)有顯著影響；酚醛泡沫顯著降低土壤微生物呼吸速率，且降低程度與濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，表明該酚醛泡沫能對(duì)土壤微生物活性和土壤有機(jī)碳含量造成一定影響。