韋 祎，周 沾，覃銀瑩，謝玉波，利 莉

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，南寧 530021）

異丙酚是快速短效的靜脈麻醉藥物，為GABA受體激動劑，常用于誘導(dǎo)和維持小兒麻醉以及重癥監(jiān)護(hù)[1]。長期體內(nèi)外大劑量異丙酚給藥會引起神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力障礙[2]。從胚胎時期起持續(xù)2～3 年這一時期大腦發(fā)育最快，神經(jīng)元、軸突、樹突和突觸數(shù)量迅速增加，在此期間內(nèi)長時間大劑量接觸異丙酚會誘發(fā)神經(jīng)元發(fā)育性神經(jīng)毒性[3]。然而，關(guān)于新生兒中異丙酚安全性的研究報道較少。因此，減少麻醉藥品對發(fā)育性腦神經(jīng)元的損傷成為一個日益熱門的研究課題。本研究擬評價異丙酚對胎鼠離體海馬神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）表達(dá)的影響，探討異丙酚神經(jīng)毒性的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供SPF級SD大鼠（實驗動物許可證號：SCXK[桂]2003-0005），實驗遵循實驗動物福利倫理審查指南（GB/T35892—2018）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SD 大鼠腹中14 d 胎鼠處死，分離海馬組織，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm并與DMEM/F12移入離心管中，加入不含EDTA 胰酶的膠原酶，吹打，37 ℃溫水浴，直至剪碎的海馬組織液呈現(xiàn)混濁不清并可拉出絲狀，然后加入不含EDTA的胰酶，吸除胰酶并加培養(yǎng)基終止消化。吸管上下吹打直至肉眼看不到明顯組織塊，離心，棄上清液，加培養(yǎng)液，制備單細(xì)胞懸液。篩網(wǎng)過濾，取過濾后液體0.5 mL，加入臺盼蘭染液，染色。鏡下細(xì)胞計數(shù)，藍(lán)色細(xì)胞為死細(xì)胞，無色透明為活細(xì)胞，密度以1～2×106個/mL接種于培養(yǎng)板中。顯微鏡下觀察并記錄海馬神經(jīng)元的生長情況包括胞體形態(tài)、樹突、軸突和排列密度程度等。

1.3 免疫組化法鑒定神經(jīng)元 保溫箱取出培養(yǎng)板，甲醛固定30 min，棄去甲醛后PBST輕洗；在室溫下通透15 min；用與二抗同源的5%的血清封閉30 min；棄掉培養(yǎng)基，PBST 輕洗，神經(jīng)元特異性的MAP2 單克隆抗體標(biāo)記神經(jīng)元孵育過夜，滴加生物素化二抗工作液孵育30 min；PBS漂洗3次，每次3 min；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，恒溫箱孵育30 min；PBS漂洗3次，DAB顯色劑顯色，終止。蘇木素染色，沖洗，鹽酸酒精分化，分別用濃度80%、95%、100%的酒精梯度脫水，每次5 s；二甲苯2 次，每次5 s；脫水透明后封片，取其陽性細(xì)胞數(shù)均值計算海馬神經(jīng)元純度。

1.4 實驗分組 神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第8 天，分為3組：空白對照組（C組）不做任何處理，I組加入脂肪乳劑（20%），P組加入異丙酚孵育3 h使其最終濃度為100 μmol/L。

1.5 CCK-8試劑盒測定海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力

L-左旋多聚賴氨酸預(yù)先處理96 孔板并分別每組設(shè)置6個復(fù)孔，孵育神經(jīng)元細(xì)胞。每2 d測定1次吸光度值，記錄至第16天。用酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國）測定波長于450 nm 處P 組（a）、C 組（b）和I 組（c）的吸光度值（OD）并繪制生長曲線。細(xì)胞活力%=（a-b）/（c-b）×100%。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測BDNF mRNA基因表達(dá) 按試劑盒（TARAKA公司，日本）提取總RNA 后逆轉(zhuǎn)錄cDNA。引物序列如下：GAPDH 引物F：5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’，R：5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’。BDNF 引物F：5’-CAGCGCGAATGTGTTAGTGGTTA-3’，R：5’-CAGTGGACAGCCACTTTGTTTCA-3’；RT-qPCR 擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，反復(fù)40組。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法檢測mRNA的表達(dá)。

1.7 Western blotting檢測BDNF蛋白表達(dá)含量

10% SDS-PAGE 凝膠電泳將上樣的蛋白質(zhì)分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，1×TBST 稀釋兔抗鼠BDNF（1∶1 000，CST 公司，美國），兔抗鼠Cleaved-Caspase3（1∶1 000，CST公司，美國）孵育過夜，加入山羊抗兔熒光二抗（稀釋度1∶10 000，LI-COR公司，美國）避光孵育1 h，內(nèi)參GAPDH（1∶5 000，CST公司，美國），使用凝膠成像系統(tǒng)和Image J軟件掃膜和條帶分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)方差齊，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu) 顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元胞體飽滿程度和突起連接情況。接種4 h 后，大部分胞體已明顯貼壁，第1 天大部分胞體緊貼壁生長，突起延長；第3～5天胞體形態(tài)多樣，突起連接成網(wǎng)；第7天胞體飽滿排列緊密，突起縱橫交錯；第9天胞體皺縮，且部分胞體裂解。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果 顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)至第8 天的胎鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)元胞體豐滿，突起明顯延長并相互連接，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色。按照判斷原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞體外培養(yǎng)成功的標(biāo)準(zhǔn)，由此判斷新生大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)成功。計算陽性細(xì)胞數(shù)在10 個視野內(nèi)平均值為（95.2±3.6）%。純度較高可滿足進(jìn)一步的實驗的需求。

2.3 CCK-8檢測細(xì)胞活力 每2 d測定并記錄1次OD值，共測定8次。觀察到細(xì)胞活力上升速度越來越快，第8 天上升速度達(dá)到頂峰，然后上升速度變慢，由此得出第8天進(jìn)行藥物干預(yù)為最佳時間，見圖1。與C 組比較，P 組海馬神經(jīng)元活性降低（P＜0.05）；I 組海馬神經(jīng)元活性幾乎無變化（P＞0.05），見圖2。

圖1 海馬神經(jīng)元生長曲線

圖2 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力比較

2.4 Western blotting檢測BDNF蛋白表達(dá)量 與C組比較，P組BDNF蛋白表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05）；I組神經(jīng)元BDNF蛋白未見明顯差異（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組BDNF相對表達(dá)量比較

2.5 RT-qPCR 檢測BDNF mRNA 表達(dá)含量 與C組比較，P組BDNF mRNA的表達(dá)量降低（P＜0.05）；I 組神經(jīng)元BDNF mRNA 未見明顯差異（P＞0.05），見圖4。

圖4 各組BDNF mRNA相對表達(dá)量

3 討論

異丙酚GABA 受體激動劑以及NMDA 拮抗劑（如氯胺酮、異氟醚和氧化亞氮）對各種神經(jīng)傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生劑量依賴性和年齡依賴性影響[4]。研究提示，全麻對嬰幼兒神經(jīng)發(fā)育神經(jīng)毒性的影響不僅僅取決于麻醉次數(shù)、時間和深度等因素，神經(jīng)易損性是另一個至關(guān)重要的原因[5]。全麻藥可能具有神經(jīng)毒性，這已引起麻醉醫(yī)生對小兒麻醉安全性的關(guān)注。幼兒長期大劑量暴露于異丙酚麻醉中，將對神經(jīng)發(fā)育的各個方面產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和行為缺陷，神經(jīng)元損傷和神經(jīng)元凋亡水平升高，以及增加神經(jīng)認(rèn)知損害風(fēng)險且將對兒童后天的學(xué)習(xí)能力產(chǎn)生不良的影響[6]。研究報道，3個月以內(nèi)嬰幼兒異丙酚劑量為25 mg/（kg·h），3～6個月的嬰幼兒異丙酚劑量為20 mg/（kg·h），6～12 個月的嬰幼兒異丙酚劑量為15 mg/（kg·h），幼兒期1～3歲異丙酚劑量為12 mg/（kg·h），且與成人相比早產(chǎn)兒和足月新生兒的藥物清除率僅為藥物有效形式的10%～38%，這一事實極大地限制尤其是在新生兒中異丙酚的使用[7]。50 μmol/L 異丙酚對神經(jīng)細(xì)胞的短期暴露（＜3 h）沒有明顯的神經(jīng)毒性作用；異丙酚暴露如超過12 h，神經(jīng)細(xì)胞活性顯著降低。幼兒大腦模型可用培養(yǎng)至第7 天海馬神經(jīng)元替代，此時麻醉藥作用于海馬神經(jīng)元反應(yīng)性最強，海馬神經(jīng)元在100 μmol/L異丙酚作用下出現(xiàn)神經(jīng)毒性[8]。

BDNF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子，能促進(jìn)海馬學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)形成，促進(jìn)神經(jīng)元突觸可塑性并參與軸突和樹突的分化。BDNF通常通過兩個關(guān)鍵的信號級聯(lián)途徑在發(fā)育中的神經(jīng)元發(fā)揮其生存效應(yīng)。其一，BDNF通過其受體TrkB誘導(dǎo)的PI3K活性激活A(yù)kt；其二，BDNF通過TrkB誘導(dǎo)的Erk1/2激活GSK3β或MSK1[9-10]。BDNF促進(jìn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的同步成熟，并提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率，BDNF上調(diào)對許多神經(jīng)疾病產(chǎn)生有益的影響[11]。BDNF 表達(dá)水平的改變，可能導(dǎo)致神經(jīng)元突觸丟失從而影響認(rèn)知能力。臨床濃度異丙酚可致發(fā)育期神經(jīng)元凋亡，抑制BDNF 分泌是其中一種重要損傷機制[12]。本研究中異丙酚孵育海馬神經(jīng)元，胎鼠海馬神經(jīng)元活性明顯降低，BDNF蛋白及其mRNA表達(dá)下調(diào)，揭示異丙酚對胎鼠離體海馬神經(jīng)元神經(jīng)毒性機制可能是通過下調(diào)BDNF蛋白完成的。

綜上所述，異丙酚通過影響B(tài)DNF 蛋白的表達(dá)從而抑制胎鼠海馬神經(jīng)元活性，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。