汪孝軍，喻福娟，阿 智，肖崇雅

(阿壩藏族羌族自治州人民醫(yī)院眼科，四川 阿壩藏族羌族自治州，624000)

角膜炎是導致發(fā)展中國家患者失明的主要原因之一[1]。銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是角膜炎的一種主要革蘭氏陰性致病菌，其發(fā)病迅速并可導致嚴重的視力損害[1-2]。銅綠假單胞菌能侵入多種哺乳動物細胞內進行復制[3-6]。有研究[4]顯示，在實驗性銅綠假單胞菌感染角膜炎動物模型中，即使眼內已無細菌生長，但眼內仍存在炎癥反應，提示已滅活或崩解的細菌及其成分也存在一定的致炎作用。雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)已被廣泛地應用于葡萄膜炎的治療研究[7]，目前已被證實可以促進癌細胞的自噬[8]，而細胞自噬在清除病原體中起著重要作用[9]。因此，本研究旨在探討DHA能否通過誘導細胞自噬促進銅綠假單胞菌的清除，最終用于銅綠假單胞菌角膜炎的治療。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用50只6～8周齡(20～24 g)雌性SPF級野生型C57BL6J小鼠[北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證：SCXK(京)2019-0009]，動物治療符合ARVO在眼科和視力研究中使用動物聲明和《實驗動物護理和使用指南》，所有程序都經過動物保護和使用委員會的批準。

1.2 主要材料及儀器

人角膜上皮細胞系HCEC和CP-H128(武漢普諾賽生命科技有限公司)；人角膜上皮細胞完全培養(yǎng)基(CM-H128，武漢普諾賽生命科技有限公司)；銅綠假單胞菌(分離自本院收治的銅綠假單胞菌角膜炎患者的角膜刮片樣本，根據角膜刮片形態(tài)學、生長特征和16s rDNA序列分析鑒定為銅綠假單胞菌，保存在-80 ℃)；LB培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)；氯喹(CQ)、雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤(3-MA，美國Sigma公司)?？贵w：微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、P62、核因子kappaB(NF-κB)、NF-κB抑制因子α(IκBα)、p-IκBα、Lamin B、β-actin抗體(英國Abcam公司)；羊抗兔HRP二抗(美國Invitrogen公司)；TRIzol(美國Life Technologies公司)。Zeiss Axio Scope A1型熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)；7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 菌液的制備

采集細菌菌落，在37 ℃的胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中不斷搖動培養(yǎng)過夜。次日，將20 μL含有銅綠假單胞菌的TSB轉移到4 mL新鮮培養(yǎng)基中，在OD 600 nm<1的條件下培養(yǎng)4 h。測定TSB細菌濃度后，將細菌洗滌復蘇，然后感染小鼠角膜或置于沸水浴中5 min，產生熱滅活銅綠假單胞菌，用不含生長因子和抗生素的基本培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 細胞處理和分組

將融合培養(yǎng)的HCEC細胞在CM-H128培養(yǎng)基中饑餓過夜，隨后，用熱滅活銅綠假單胞菌(MOI=1:100)感染達到指定時間(0.5、1、2、3、4、5 h)。將銅綠假單胞菌感染5 h后的HCEC細胞分為空白組、CQ組(5 μmol·L-1CQ預處理30 min，加入生理鹽水培養(yǎng)24 h)、不同濃度DHA組(生理鹽水預處理30 min，分別加入10、20、40 μmol·L-1DHA培養(yǎng)24 h)、DHA+CQ組(5 μmol·L-1CQ預處理30 min，加入40 μmol·L-1DHA培養(yǎng)24 h)，觀察DHA誘導HECE細胞自噬的劑量-反應曲線及DHA對HCEC細胞自噬的影響。

1.5 Western Blot法檢測細胞自噬相關蛋白表達

收集HCEC細胞(1×107個)，使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，離心獲取上清，用BC法檢測蛋白濃度。每個樣本取40 μg總蛋白，進行體積分數10% SDS-PAGE電泳，隨后電轉移至硝化纖維素膜上。用含體積分數5%脫脂牛奶的BSA封閉液封閉4 h，隨后使用TBST清洗5 min×3次，最后將膜與一抗4 ℃孵育過夜。次日，與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG共孵育2 h。用ECL發(fā)光液進行蛋白條帶可視化。

1.6 免疫熒光法分析細胞LC3表達

HCEC細胞(1×105mL-1)感染銅綠假單胞菌1 h后，用體積分數4% PFA固定，體積分數0.3% Triton X-100通透，體積分數5% BSA封閉。用兔抗LC3B抗體孵育1 h，然后用Alexa Fluor?488熒光抗兔IgG孵育。使用Dako熒光封片劑將蓋玻片封固在顯微鏡載玻片上。置于熒光顯微鏡下觀察。定量檢測每個樣品中LC3陽性細胞數并計算陽性細胞占總細胞數的比例，每個樣品至少計數100個細胞。

1.7 分離細胞核與細胞質

收集HCEC細胞(1×107個)，用預冷的PBS洗滌2次并重懸于500 mL緩沖液A(含有10 mmol·L-1HEPES，pH=7.9、1.5 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1KCl、0.5 mmol·L-1DTT、0.5 mmol·L-1PMSF、1 mg·mL-1亮抑酶肽、1 mg·mL-1抑肽酶和1 mg·mL-1胃酶抑素A)中。使細胞在冰上孵育15 min，然后用12.5 mL體積分數10% Nonidet P-40溫和裂解，并在4 ℃下以2000 r·min-1離心10 min。收集上清液并用作細胞質提取物。將沉淀物(含有核)重新懸浮在40 mL緩沖液C(20 mmol·L-1HEPES，pH=7.9、1.5 mmol·L-1MgCl2、450 mmol·L-1NaCl、體積分數25%甘油、0.2 mmol·L-1EDTA、0.5 mmol·L-1DTT、0.5 mmol·L-1PMSF、1 mg·mL-1亮抑酶肽、1 mg·mL-1抑肽酶和1 mg·mL-1胃酶抑素A)中，在4 ℃攪拌30 min，核碎片以2000 r·min-1離心15 min。上清液即為核提取物。將胞核和胞質樣本分別進行Western Blot法檢測NF-κB蛋白和LC3蛋白表達，分組與處理方法同“1.4”。

1.8 實驗動物分組及處理

根據體重和隨機數字表法將C57BL6J小鼠分為6組：假手術組、模型組、CQ組、雷帕霉素組、3-MA組、DHA組，除模型組(n=25)外，其余各組均5只。腹腔注射0.3 mL戊巴比妥鈉(體積分數0.06%)進行全身麻醉，隨后使用鹽酸丙美卡因滴眼液(蘇州天龍制藥有限公司，批號：20190104，規(guī)格：每支10 mL)進行角膜局部麻醉。使用1 mL注射器針頭，在顯微鏡下將小鼠角膜上皮劃3條1 mm損傷。隨后將小鼠平放置鼠籠，除假手術組外，其余5組小鼠在眼表滴加10 μL銅綠假單胞菌菌液(107個·mL-1，懸浮于生理鹽水)。于處理后24 h用手持裂隙燈觀察，如果血管充血、角膜混濁或者積膿即為造模成功。CQ組、雷帕霉素組、3-MA組、DHA組分別于術前1 d起每日用CQ(30 μmol·L-1)、雷帕霉素(3 μmol·L-1)、3-MA(3 mmol·L-1)、DHA(40 μmol·L-1)每日點眼6次。假手術組和模型組用等體積生理鹽水代替。

1.9 角膜組織銅綠假單胞菌載菌量檢測

24 h后，使用斷頸法處死小鼠，將小鼠眼球取下，并在體式顯微鏡下沿角鞏膜緣將角膜剪下。使用含有TissueLyser的生理鹽水(100 μL)清洗剪下的小鼠角膜后，將角膜放入盛有1 mL胰蛋白酶工作液的離心管中，使用眼科剪在管中持續(xù)剪切10 min。將原液分別稀釋10、100、103、104、105、106、107倍，取每種濃度梯度的菌液10 μL，涂布于LB培養(yǎng)皿中(每個濃度梯度設置3組重復)，置于37 ℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。次日計數形成的菌落數，依據稀釋梯度計數角膜載菌量，以菌落形成單位(CFU)表示。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 銅綠假單胞菌處理HCEC細胞后細胞自噬活性變化

將熱滅活銅綠假單胞菌(MOI=1:100)感染HCEC細胞不同時間后，經Western Blot法檢測自噬標記物 LC3蛋白。結果顯示在感染后1 h即可觀測到LC3蛋白表達顯著增加[(0.83±0.09)比(0.50±0.07)，P<0.05]，隨著感染時間的延長，LC3II/LC3I蛋白比值逐漸增加(2 h：0.87±0.12；3 h：0.90±0.09；4 h：1.09±0.14；5 h：1.34±0.15，P<0.05，見圖1A)。此外，以雷帕霉素(10 nmol·L-1)處理后5 h的HCEC細胞作為陽性對照，經免疫熒光結果顯示，HCEC與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)(MOI=1:100)5 h后，細胞內LC3表達顯著增加(圖1B)。因此選擇銅綠假單胞菌作用5 h用于后續(xù)細胞實驗。

2.2 DHA誘導HCEC細胞中自噬相關蛋白表達

經Western Blot法檢測，隨著DHA作用濃度(10、20、40 μmol·L-1)的增加，LC3B-II/LC3B-I蛋白表達比值逐漸升高(空白組：0.01±0.00；DHA 10 μmol·L-1：0.12±0.02；DHA 20 μmol·L-1：0.30±0.06；DHA 40 μmol·L-1：0.58±0.10)，同時P62蛋白表達水平逐漸降低(空白組：0.89±0.10；DHA 10 μmol·L-1：0.77±0.12；DHA 20 μmol·L-1：0.50±0.06；DHA 40 μmol·L-1：0.18±0.04)，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖2A)。此外，與空白組(0.01±0.00)相比，DHA組LC3B-II/LC3B-I蛋白表達比值(0.60±0.05)顯著升高，CQ組LC3B-II/LC3B-I蛋白表達比值(0.26±0.04)顯著降低(P<0.05)，而DHA+CQ共同處理導致LC3B-II/LC3B-I蛋白表達比值(0.50±0.02)顯著低于DHA組(P<0.05)，說明DHA 誘導的自噬是功能性的，而不是阻斷自噬通量而導致的LC3堆積，見圖2B。

2.3 DHA通過抑制NF-κB活性促進HCEC細胞自噬

隨著DHA作用濃度(10、20、40 μmol·L-1)的增加，導致總蛋白中IκBα蛋白表達量以劑量依賴性方式顯著增加(空白組：0.33±0.03；DHA 10 μmol·L-1：0.15±0.03；DHA 20 μmol·L-1：0.36±0.04；DHA 40 μmol·L-1：0.88±0.07，P<0.05)，而p-IκBα蛋白表達量則顯著降低(空白組：0.95±0.08；DHA 10 μmol·L-1：0.40±0.02；DHA 20 μmol·L-1：0.27±0.02；DHA 40 μmol·L-1：0.08±0.01，P<0.05，見圖3A)。NF-κB激活需要RelA/p65亞基轉位到細胞核中，因此本研究采用Western Blot法檢測了DHA對胞質和胞核中RelA/p65分布的影響。結果表明，DHA處理有效地上調了細胞質RelA/p65蛋白表達水平(空白組：0.22±0.01；DHA 10 μmol·L-1：0.30±0.03；DHA 20 μmol·L-1：0.47±0.05；DHA 40 μmol·L-1：0.69±0.06，P<0.05)并下調核RelA/p65蛋白表達水平(空白組：4.02±0.17；DHA 10 μmol·L-1：0.37±0.05；DHA 20 μmol·L-1：0.40±0.07；DHA 40 μmol·L-1：0.32±0.07，P<0.05，見圖3B)。然而在總細胞提取物中并沒有檢測到總RelA/p65蛋白水平的變化(空白組：1.80±0.22；DHA 10 μmol·L-1：1.78±0.25；DHA 20 μmol·L-1：1.69±0.22；DHA 40 μmol·L-1：1.65±0.18，P>0.05，見圖3A)，這表明DHA阻止了RelA/p65入核，而不是抑制RelA/p65蛋白合成。此外，為進一步證實DHA通過抑制NF-κB活性以促進HCEC細胞自噬，本研究用TNF-α(100 ng·mL-1)對HCEC細胞進行預處理。結果顯示，DHA(40 μmol·L-1)處理可顯著誘導HCEC細胞中LC3轉化，LC3B-II/LC3-I蛋白比值較空白組顯著增加(0.92±0.08比0.17±0.01，P<0.05)；而在DHA和TNF-α共同處理后，HCEC中LC3B-II/LC3-I蛋白比值則低于DHA組(0.40±0.05比0.92±0.08，P<0.05，見圖3C)。表明激活NF-κB可抑制DHA對角膜上皮細胞的自噬促進作用。

A：總蛋白樣本中NF-κB(p65)蛋白、IκBα蛋白、p-IκBα(Ser32/36)蛋白表達；B：胞核和胞質蛋白樣本NF-κB(p65)蛋白表達；C：總蛋白樣本中LC3蛋白表達。

2.4 各組小鼠角膜組織銅綠假單胞菌載菌量比較

在建模24 h后，檢測各組小鼠的角膜載菌量。結果顯示，與假手術組(0.75×106CFU)相比，CQ組和3-MA組小鼠角膜載菌量分別增加至(1.05±0.12)×106CFU和(0.98±0.12)×106CFU(P<0.05)；而雷帕霉素組和DHA組小鼠角膜載菌量分別為(0.78±0.09)×106CFU和(0.74±0.10)×106CFU，與假手術組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖4)。

A：假手術組；B：模型組；C：CQ組；D：雷帕霉素組；E：3-MA組；F：DHA組。圖4 各組小鼠角膜組織銅綠假單胞菌載菌量比較

3 討論

目前，臨床上針對銅綠假單胞菌角膜炎的治療通常為經驗性治療，主要依賴廣譜抗生素，但其治療效果往往差強人意[10]。目前，青蒿素及其相關衍生物在眼科的應用受到了日益增加的關注[7,11]。本研究旨在探討DHA在保護角膜免受銅綠假單胞菌感染中的作用，結果顯示DHA可以顯著降低銅綠假單胞菌角膜炎小鼠的角膜載菌量，同時體外HCEC細胞實驗也證實，DHA能夠增加熱滅活銅綠假單胞菌感染的角膜上皮細胞的總體自噬水平。說明DHA對于人角膜上皮細胞有一定的抗銅綠假單胞菌感染作用。

無血管的角膜組織具有2種特殊功能，即形成保護性屏障和作為視覺系統(tǒng)的主要屈光元件[3,6]。在正常情況下，角膜對感染有明顯的抵抗力。然而，當上皮屏障被突破(通常發(fā)生在配戴隱形眼鏡期間)或免疫功能受損(如糖尿病患者)時，機會致病菌(如銅綠假單胞菌)便會進入復層上皮，最終侵入基質，引致感染性角膜炎，導致角膜渾濁。銅綠假單胞菌是引起細菌性角膜炎的革蘭氏陰性致病菌，特別是在長時間接觸鏡片的隱形眼鏡使用者中十分常見，如果沒有得到及時和適當的治療，可能會導致嚴重的視力下降甚至失明。銅綠假單胞菌已被證明可在多種細胞內侵襲和復制，并合成多種有害外毒素。其中，外毒素S和T是具有腺苷二磷酸核糖基轉移酶(ADPRT)和谷胱甘肽酶激活蛋白活性的雙功能毒素；外毒素U是一種磷脂酶，能使宿主細胞迅速溶解；而外毒素Y是一種分泌型腺苷酸環(huán)化酶；Ⅲ型蛋白分泌與急性肺部感染等疾病死亡率有關。有研究[10]證實，在角膜炎中，外毒素S、T的ADPRT活性能夠介導對宿主免疫反應的破壞，以促進細菌的生存和角膜疾病的發(fā)展。自噬是一種正常的細胞分解代謝過程，特點是細胞內形成被稱為自噬體的雙膜細胞器，自噬體吞噬細胞質成分在與溶酶體融合后被降解。自噬過程在清除細胞內病原體中起主要作用[10,12]。然而，一些病原體會設法逃避自噬降解，甚至利用自噬過程為自身的復制提供幫助[13]。因此，自噬的最終效果往往對感染性疾病的預后具有重要的影響。銅綠假單胞菌已被證明可激活肺泡巨噬細胞和肥大細胞中的自噬[14-15]。近些年也有研究[2]證實，銅綠假單胞菌可以激活角膜上皮細胞的自噬。本試驗證明了角膜上皮細胞自噬對抵抗銅綠假單胞菌感染可以起到幫助作用，同時也發(fā)現DHA降低角膜載菌量的效果優(yōu)于雷帕霉素?？紤]到人類使用青蒿素這一中藥及其衍生物已有很長時間，其生物安全性已得到了充分的證實，因此DHA有望作為治療銅綠假單胞菌角膜炎的輔助用藥。

NF-κB被廣泛認為是腫瘤生長的調節(jié)劑，因為它具有抑制細胞程序性死亡途徑的功能，可以降低腫瘤細胞對凋亡敏感性，促進細胞生長[16-17]。NF-κB抗細胞凋亡功能所涉及機制的研究表明，它的激活可以保護細胞免受TNF-α和其他刺激物誘導的細胞凋亡級聯(lián)反應[18]。此外，角膜上皮細胞中一些抗凋亡基因，包括Bcl-2家族成員，已被證明可被NF-κB激活以及其他證據亦表明NF-κB還對p53的功能具有拮抗作用[19]。因此，NF-κB常被用作新型預防和治療疾病的靶點。而JEOK等[20]也證實銅綠假單胞菌基因DNAK可通過TLR4依賴的NF-κB信號通路刺激Pentraxin 3蛋白的產生，進而觸發(fā)宿主的免疫防御反應。WANG等[21]的研究表明，在人皮膚鱗狀細胞癌細胞中DHA可以通過抑制NF-κB以促進自噬。于是筆者提出假說：DHA通過抑制NF-κB以促進HCEC細胞自噬，最終提升HCEC細胞對銅綠假單胞菌的清除能力。

本研究證明了DHA通過提升角膜上皮細胞自噬活性，促進其對銅綠假單胞菌的清除作用；此外也進一步揭示了DHA通過抑制RelA/p65核易位以及IκBα磷酸化和降解，導致NF-κB失活，進而增強HCEC細胞的自噬活性，這可能是DHA促進人角膜上皮細胞中銅綠假單胞菌清除的作用機制之一。以自噬為基礎的輔助療法有希望成為治療感染性角膜炎的方案之一，而本研究為DHA應用于銅綠假單胞菌角膜炎的治療提供了理論基礎。然而該結論尚需要進行體內研究以闡明DHA的安全性和有效性。