宋立?劉鵬?宋明強(qiáng)?薄金雙?張榮明

【摘要】目的 評(píng)價(jià)非黏液型銅綠假單胞菌與黏液型銅綠假單胞菌刺激淋巴細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子IL-6的差異。方法 培養(yǎng)2種類型的銅綠假單胞菌，采用革蘭染色后觀察細(xì)菌形態(tài)，用質(zhì)譜分析鑒定菌型，將所獲的非黏液型銅綠假單胞菌與黏液型銅綠假單胞菌菌株分別與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，分別設(shè)為非黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細(xì)胞組與黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細(xì)胞組，再設(shè)加入磷酸鹽緩沖液（PBS）組為對(duì)照組，即PBS+淋巴細(xì)胞組。采用流式法分析觀察淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞于6、24、48 h細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果 培養(yǎng)所得的非黏液型銅綠假單胞菌與黏液型銅綠假單胞菌細(xì)菌形態(tài)完好;非黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細(xì)胞組及PBS+淋巴細(xì)胞組的上清液中幾乎檢測(cè)不到IL-6，而黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細(xì)胞組可見(jiàn)大量IL-6分泌（P < 0.05）;相對(duì)于PBS+淋巴細(xì)胞組，非黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細(xì)胞組與黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細(xì)胞組均可分泌TNF-α，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論 黏液型銅綠假單胞菌刺激了淋巴細(xì)胞分泌大量的炎性因子IL-6，非黏液型銅綠假單胞菌無(wú)此特點(diǎn);基于IL-6具有促進(jìn)該類細(xì)菌增殖的特性，這可能是臨床上黏液型銅綠假單胞菌感染難愈性的一個(gè)潛在機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】銅綠假單胞菌;白介素-6;腫瘤壞死因子α;難愈性感染

Potential association between mucoid Pseudomonas aeruginosa-stimulated excessive serection of IL-6 by lymphocytes and chronic refractory infection Song Li， Liu Peng， Song Mingqiang， Bo Jinshuang， Zhang Rongming. Department of Burn and Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， China

Corresponding author，Zhang Rongming， E-mail： zrm99999@126.com

【Abstract】Objective To evaluate the differences of IL-6 secreted by lymphocytes stimulated by mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa. Methods Two types of Pseudomonas aeruginosa were cultured. The morphology of the bacteria was observed by Gram staining.The bacterial type was identified by Mass spectrometry. The mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa strains were co-cultured with lymphocytes and assigned into the mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa+lymphocyte and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa+lymphocyte groups. Phosphate buffer solution （PBS） was used in the control group （PBS+lymphocyte group）. The cytokine secretion of lymphocytes and neutrophils was observed at 6 h， 24 h and 48 h was observed by flow cytometry. Results The mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa strains were observed in intact morphology. Almost no or only a slight amount of IL-6 production was noted in the non-mucoid Pseudomonas aeruginosa+ lymphocyte group and PBS+ lymphocyte group， whereas a large quantity of IL-6 was observed in the mucoid Pseudomonas aeruginosa+ lymphocyte group （both P < 0.05）. Compared with the PBS+ lymphocyte group， TNF-αwas secreted in the other two groups. No significant difference was seen between two groups （P > 0.05）. Conclusions Mucoid Pseudomonas aeruginosa rather than non-mucoid Pseudomonas aeruginosa can stimulate excessive secretion of IL-6 by lymphocytes， which may be a specific mechanism underlying the chronic refractory infection of mucoid Pseudomonas aeruginosa based on the fact that excessive IL-6 can promote the proliferation of this type of bacteria.

【Key words】Pseudomonas aeruginosa;Interleukin-6;Tumor necrosis factor-ɑ;

Chronic refractory infection

銅綠假單胞菌是一類極易引起醫(yī)院感染尤其是ICU獲得性感染并造成不良臨床結(jié)局的常見(jiàn)致病菌之一[1-3]。銅綠假單胞菌可分為非黏液型和黏液型。該菌具備固有形成細(xì)菌生物膜的特性，可通過(guò)生物膜逃避宿主的免疫殺傷及抗菌藥物的作用，是極易引起難愈性感染的重要病原菌[4-5]。除此之外，細(xì)菌感染還能夠刺激機(jī)體細(xì)胞分泌大量炎性因子，諸如IL-6、TNF-α、IL-1β等，有研究表明，某些炎性因子如IL-6，雖然在感染早期適量分泌有益于控制感染，但在感染后期高濃度的IL-6又可促進(jìn)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)[6-7]。一旦達(dá)到級(jí)聯(lián)式瀑布樣釋放則可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，造成臨床慢性遷延性重癥感染。此前，我們?cè)芯苛嗽诟腥驹缙谧鳛榭垢腥厩把胤谰€的中性粒細(xì)胞與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)后炎性因子的分泌情況，發(fā)現(xiàn)其僅能分泌低量的IL-6（< 100 pg/ml），此濃度不足以刺激銅綠假單胞菌的增殖生長(zhǎng)。為此我們考慮，在感染后期中性粒細(xì)胞數(shù)目下降，參與特異性免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞是否會(huì)通過(guò)IL-6調(diào)控免疫反應(yīng)及促進(jìn)銅綠假單胞菌的增殖生長(zhǎng)？在此過(guò)程中是全部菌型還是某個(gè)菌型更為重要？為解答這個(gè)問(wèn)題，我們開(kāi)展了此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究，意在揭示淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞是否通過(guò)IL-6參與對(duì)黏液型銅綠假單胞菌的免疫反應(yīng)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)菌株

非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌菌株均由山東省威海市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。非黏液型銅綠假單胞菌為ATCC27853，黏液型銅綠假單胞菌來(lái)自我院燒傷病例感染創(chuàng)面標(biāo)本。

二、主要儀器與試劑

高速離心機(jī)[北京白洋（BYG20）];二氧化碳培養(yǎng)箱[美國(guó)ThermoFisher 公司（150i）];倒置熒光顯微鏡[日本尼康（Nikon Ti-S）];質(zhì)譜儀[德國(guó)布魯克公司 MALDI BIOTYPER];流式細(xì)胞儀（AriaⅡ）[美國(guó)BD公司];人Th1/Th2/Th17試劑盒購(gòu)[美國(guó)BD公司];1640培養(yǎng)液[美國(guó)Gibco公司]，胎牛血清[美國(guó)HyClone公司]。

三、方 法

1.銅綠假單胞菌培養(yǎng)與鏡檢

將非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌用劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)，待菌落形成后，取清潔、干燥載玻片，加一滴無(wú)菌生理鹽水于玻片，用接種環(huán)挑取哥倫比亞血瓊脂平板上非黏液型銅綠假單胞菌菌落于載玻片上進(jìn)行涂片固定;采用貝索快速革蘭染色液進(jìn)行革蘭染色，再用龍膽紫液染色10 s后水洗甩干;用碘溶液染色10 s后水洗甩干，用脫色液脫色10 ～ 20 s后水洗甩干，用沙黃溶液復(fù)染10 s后水洗，用吸水紙吸干水分，于鏡下觀察制備好的非黏液型銅綠假單胞菌。采用同樣方法制備黏液型銅綠假單胞菌，染色后于鏡下觀察。

2.細(xì)菌質(zhì)譜鑒定

用無(wú)菌接種環(huán)在生物安全柜中挑取哥倫比亞血瓊脂平板上單個(gè)非黏液型銅綠假單胞菌菌落于質(zhì)譜板中涂勻，干燥后加70%甲酸1 μl， 于37℃烘箱晾干，加入質(zhì)譜基質(zhì)1 μl，采用質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定。用同樣方法處理黏液型銅綠假單胞菌。

3.檢測(cè)標(biāo)本的制備

取成人健康志愿者外周血10 ml，采用密度梯

度離心法分離淋巴細(xì)胞;將淋巴細(xì)胞按1.0×106個(gè)/孔

的密度接種于6孔板，在孵箱（37℃，5%二氧化碳）中培養(yǎng)2 h。取新培養(yǎng)的非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌，分別制成懸液，測(cè)定吸光度（OD600）并計(jì)算菌體濃度，按細(xì)胞與細(xì)菌比值為1∶5接種菌體于細(xì)胞的培養(yǎng)體系中。分別設(shè)為非黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細(xì)胞組（非黏液型組）與黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細(xì)胞組（黏液型組），并設(shè)置加入磷酸鹽緩沖液（PBS）組為對(duì)照組，即PBS+淋巴細(xì)胞組。將加入菌液的細(xì)胞分別培養(yǎng)12、24、48 h后，1000轉(zhuǎn)/分離心5 min后收集上清液，等待流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)。

4.細(xì)胞因子檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照人Th1/Th2/Th17試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。首先渦旋混勻，混合好捕獲微球，向每個(gè)實(shí)驗(yàn)管中各加入50 μl，標(biāo)準(zhǔn)管中加入按說(shuō)明稀釋好的PBS溶液50 μl，樣本管中分別加入稀釋好的非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌樣本液。再向所有實(shí)驗(yàn)管中加入50 μl人Th1/Th2 PE檢測(cè)試劑，將所有實(shí)驗(yàn)管室溫避光孵育3 h。將儀器條件設(shè)置完畢后，每組試驗(yàn)管中加入1 ml洗液，200轉(zhuǎn)/分離心5 min，小心吸去上清液，每管加入300 μl洗液，重懸微球后上機(jī)檢測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0處理數(shù)據(jù)，細(xì)胞因子濃度以表示，3組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、銅綠假單胞菌菌落形態(tài)及革蘭染色鏡檢結(jié)果

培養(yǎng)皿中可見(jiàn)非黏液型銅綠假單胞菌菌落呈光滑、微隆起、邊緣清晰的均勻菌落，菌落表面呈現(xiàn)金屬光澤。黏液型銅綠假單胞菌菌落形態(tài)呈渾濁膠凍樣，菌落間融合，邊緣不清晰。鏡下觀察，非黏液型銅綠假單胞菌呈兩端鈍圓、單一細(xì)胞散點(diǎn)生長(zhǎng)，大小約（1 ～ 2）μm×（0.5 ～ 0.7）μm，

無(wú)芽孢;黏液型銅綠假單胞菌呈短柄狀、成對(duì)或偶有成鏈生長(zhǎng)，大小約（1 ～ 3）μm×（0.7 ～ 1.0）μm，無(wú)芽孢（圖1）。

二、質(zhì)譜鑒定結(jié)果

經(jīng)質(zhì)譜分析，非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌質(zhì)譜結(jié)果顯示其波形圖均符合銅綠假單胞菌特征，鑒定結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（圖2）。

三、細(xì)胞因子分泌情況

通過(guò)流式法分析淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況，可以看出黏液型組與非黏液型組和對(duì)照組有明顯差異（圖3）。黏液型組（圖3C） 與非黏液型組（圖3B）均可見(jiàn)TNF-α分泌（自上到下順序，色帶5），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。黏液型組顯著分泌IL-6（色帶3），且隨培養(yǎng)時(shí)間的推移，分泌升高;而非黏液型組（圖3B）與對(duì)照組（圖3A）類似，幾乎無(wú)IL-6分泌，5次試驗(yàn)各組測(cè)定均值見(jiàn)表1。

討論

銅綠假單胞菌誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞過(guò)度分泌IL-6的是黏液型銅綠假單胞菌，而并非為非黏液型銅綠假單胞菌。早在2010年Ciornei等對(duì)細(xì)菌在生物膜中的生長(zhǎng)是否觸發(fā)特異性免疫的研究顯示，相對(duì)銅綠假單胞菌浮游菌，其生物膜形成菌型能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的IL-6[7]。而IL-6是判斷細(xì)菌生物膜形成和慢性重癥感染僅有的幾種檢測(cè)意義顯著且屬常規(guī)檢測(cè)的細(xì)胞因子之一，并被用于膿毒癥干預(yù)試驗(yàn)[8]。體內(nèi)外研究顯示，過(guò)多的IL-6能促進(jìn)細(xì)菌增殖，這意味著除了感染初期天然免疫導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等分泌IL-6之外，應(yīng)該還有導(dǎo)致IL-6持續(xù)合成與分泌的機(jī)制。已有研究證實(shí)，IL-6是由TNF和IL-1的原代細(xì)胞因子直接誘導(dǎo)的。IL-6在機(jī)體受感染刺激后迅速出現(xiàn)，2 h內(nèi)其水平可達(dá)到峰值，在血流中的持續(xù)時(shí)間比TNF和IL-1長(zhǎng)得多[9]。早期分泌的IL-6對(duì)炎癥和免疫反應(yīng)的作用是多效的，其可迅速誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生大量的急性期活性蛋白和促進(jìn)淋巴細(xì)胞特異性分化，在天然免疫應(yīng)答與獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，這些機(jī)制也導(dǎo)致了IL-6的持續(xù)合成[10]。我們的研究顯示，在銅綠假單胞菌與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中，非黏液型組與對(duì)照組僅產(chǎn)生極其微量或近于不產(chǎn)生IL-6，而黏液型組在相同的培養(yǎng)條件下卻產(chǎn)生了大量的IL-6，這證實(shí)了銅綠假單胞菌可以刺激淋巴細(xì)胞大量分泌IL-6，但產(chǎn)生此作用的是黏液型銅綠假單胞菌。有研究顯示在鑒別膿毒癥和非感染性SIRS時(shí)，IL-6的最佳切點(diǎn)為500 pg/ml，一旦超過(guò)該切點(diǎn)，則意味著體內(nèi)已有膿毒癥和慢性生物膜感染存在的可能[11]。我國(guó)田素飛等（2007年）的研究同樣提示在體系中的IL-6水平為100 pg/ml以下時(shí)，無(wú)論是6 h或8 h甚至更長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)菌均無(wú)太大幅度的增殖，而在IL-6水平達(dá)到500 pg/ml時(shí)細(xì)菌的增殖幅度則驟升。而且，隨著IL-6濃度的增加和時(shí)間的推移，在IL-6水平接近或達(dá)到500 pg/ml以后，細(xì)菌增殖幅度可能更顯著，加大對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激能力，形成惡性刺激循環(huán)。

黏液型銅綠假單胞菌較非黏液型銅綠假單胞菌具有更大免疫刺激作用的原因在于前者可產(chǎn)生大量的藻酸鹽而更易形成生物膜。在固體培養(yǎng)基上觀察到藻酸鹽的過(guò)量產(chǎn)生形成的體外表型正是銅綠假單胞菌的黏液型表現(xiàn)[12]。既往我們對(duì)宿主免疫反應(yīng)的大部分知識(shí)來(lái)自于浮游病原體，而對(duì)生物膜病原體的特異性免疫反應(yīng)研究較少，唯一肯定的區(qū)別是后者菌體較難被清除，使生物膜感染成為慢性感染的主要原因[13]。黏液型銅綠假單胞菌較易產(chǎn)生生物膜，生物膜是產(chǎn)生大的免疫刺激作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，它提供了一個(gè)非常集中的穩(wěn)定的病原體相關(guān)分子模式（銅綠假單胞菌黏多糖）來(lái)源，包括DNA、脂多糖和胞外多糖。這些生物膜的胞外物質(zhì)可以有效刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而不必直接接觸細(xì)菌細(xì)胞[14-15]。另有研究者證實(shí)了銅綠假單胞菌生物膜基質(zhì)外細(xì)胞DNA也是重要的免疫刺激因素和主要的促炎成分[15]。他們通過(guò)運(yùn)用脫氧核糖核酸酶Ⅰ降解基質(zhì)細(xì)胞外DNA，明顯降低了銅綠假單胞菌生物膜誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞促炎細(xì)胞因子IL-8和IL-1b的釋放能力（> 75%），而IL-1可通過(guò)激活I(lǐng)L-6核轉(zhuǎn)錄因子刺激炎癥細(xì)胞合成和釋放IL-6;減少了中性粒細(xì)胞活化標(biāo)記CD18、CD11b和CD66b的上調(diào);降低了每個(gè)接觸生物膜的中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的數(shù)量。因此生物膜參與了誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的釋放能力。我們認(rèn)為，作為形成銅綠假單胞菌生物膜起因的黏液型銅綠假單胞菌是導(dǎo)致銅綠假單胞菌具有更大免疫刺激作用的菌型。

IL-6的過(guò)度分泌是難愈性感染的表現(xiàn)特征或潛在的發(fā)生機(jī)制，早已有研究者發(fā)現(xiàn)IL-6與慢性重癥感染的嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)，故將其納入了重癥感染或膿毒癥的臨床評(píng)級(jí)與預(yù)測(cè)[17-19]。進(jìn)一步的研究也顯示在重癥感染得到控制后，患者的IL-6水平顯著下降[20]。高水平的IL-6可顯著提高細(xì)菌的增殖能力，這使感染更難被控制，成為難愈性感染的可能發(fā)生機(jī)制[5-7]。細(xì)菌如何利用細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)自身的增殖，目前尚未明確其機(jī)制。細(xì)菌是原核生物，缺乏明確的細(xì)胞核，而細(xì)胞因子主要作用于有明確細(xì)胞核的真核細(xì)胞，繼而可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄完成細(xì)胞的增殖與分化。不過(guò)，有研究者曾在金黃色葡萄球菌表面鑒定出IL-1β受體，并發(fā)現(xiàn)其中的208 ～ 240肽片段對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響最為顯著，與對(duì)照組（牛血清白蛋白）相比，該肽片段可使金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)速度提高約22倍[21]。因此，可能是細(xì)菌細(xì)胞膜通過(guò)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)了激活過(guò)程，作用于細(xì)菌特定的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生了促進(jìn)細(xì)菌增殖的作用。

總之，本研究結(jié)果顯示，是黏液型銅綠假單胞菌促進(jìn)了淋巴細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的IL-6，從而可能刺激了細(xì)菌的生長(zhǎng)。據(jù)此我們認(rèn)為，這可能是銅綠假單胞菌引起慢性難愈性感染的重要原因。但在臨床實(shí)踐中，細(xì)菌這種“適量抑菌-過(guò)量促菌”的雙向作用的根本原因可能在于感染后期細(xì)菌生物膜的形成，形成了“細(xì)菌感染-生物膜形成-細(xì)胞因子生成增多-促進(jìn)細(xì)菌再增殖”的惡性循環(huán)，切斷這一惡性過(guò)程的重要措施是設(shè)法消除生物膜的形成[22]。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-04-18）

（本文編輯：洪悅民）