唐杰?黃永漢?黃娟華

【摘要】目的 比較不同年齡患者胚胎氨基酸代謝之間的差異，揭示不同年齡患者胚胎的氨基酸代謝規(guī)律，為改善胚胎培養(yǎng)環(huán)境、獲得更優(yōu)質(zhì)胚胎從而提高體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的成功率提供依據(jù)。方法 選擇接受IVF-ET治療的患者，收集培養(yǎng)過胚胎的廢棄培養(yǎng)液微滴，按女方患者的年齡分為< 35歲組、35 ～ 39歲組、≥40歲組，每年齡組各收集20份培養(yǎng)液標(biāo)本，共60份標(biāo)本，另外選擇同一時期同樣培養(yǎng)環(huán)境下未培養(yǎng)過胚胎的培養(yǎng)液為空白對照組。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測標(biāo)本中20種游離氨基酸的含量，比較不同年齡組培養(yǎng)液中氨基酸含量的差異。結(jié)果 3組胚胎培養(yǎng)液中天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、蘇氨酸、組氨酸、丙氨酸、牛磺酸、丙氨酰谷氨酰胺、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸以及賴氨酸含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）。< 35歲組胚胎培養(yǎng)液中氨基酸減少量低于≥40歲組。< 35歲組胚胎培養(yǎng)液中氨基酸轉(zhuǎn)換量低于≥40歲組。結(jié)論 患者的年齡不同，其胚胎的氨基酸代謝是有差異的，患者的年齡越大，其胚胎的氨基酸減少量和氨基酸轉(zhuǎn)換量越大。

【關(guān)鍵詞】胚胎;氨基酸代謝;年齡

Comparison of amino acid metabolism in embryos from IVF-ET women of different ages Tang Jie， Huang Yonghan， Huang Juanhua. Department of Reproductive Center， the First Peoples Hospital of Foshan， Foshan 528000， China

Corresponding author， Tang Jie， E-mail： sysutangj@ hotmail. com

【Abstract】Objective To compare the differences of amino acid metabolism and to reveal the patterns of amino acid metabolism among women of different ages undergoing in vitro fertilization and embryo transfer （IVF-ET）， aiming to provide basis for improving the embryo culture environment， obtaining higher quanlity embryos and enhancing the success rate of IVF-ET. Methods The waste culture medium droplets of cultured embryos were collected from patients receiving IVF-ET. According to the age of female patients， the samples were divided into three groups （< 35 years old， 35-39 years old， and ≥40 years old）. Twenty samples were collected in each age group. The culture medium without embryo culture under the same culture environment in the same period was utilized as the empty control. The concentration of 20 free amino acids in the samples was detected by high performance liquid chromatography （HPLC）. The differences of amino acid concentration were statistically compared among three groups. Results The concentration of aspartic acid， asparagine， serine， glutamine， glycine， threonine， histidine， alanine， taurine， alanyl glutamine， tyrosine， valine， methionine， tryptophan， isoleucine， leucine and lysine significantly differed in the embryo culture media among three groups （all P < 0.05）. The decrease of amino acids in the embryo culture medium in the < 35 years old group was lower than that in the ≥ 40 years old group. The amount of amino acid turnover in the embryo culture medium in the < 35 years old group was lower compared with that in the ≥40 years old group. Conclusions The amino acid metabolism significantly differs among IVF-ET patients of different ages. The older the patients， the greater the amount of amino acid reduction and amino acid turnover in the embryos.

【Key words】Embryo;Amino acid metabolism;Age

自1978年第一例試管嬰兒在英國誕生以來，人類輔助生殖技術(shù)發(fā)展至今已有40余年，體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)的臨床妊娠率和抱嬰回家率逐步提高，其中胚胎的發(fā)育潛能是IVF-ET能否成功獲得妊娠的重要影響因素之一。目前主要通過形態(tài)學(xué)的方法來判斷胚胎的發(fā)育潛能，但形態(tài)學(xué)的方法容易受觀察者的主觀因素影響，近年來有研究者通過檢測胚胎的代謝水平來量化評估胚胎的發(fā)育潛能，即通過檢測胚胎攝取的特殊營養(yǎng)物質(zhì)和分泌的特殊代謝產(chǎn)物及因子量化胚胎的發(fā)育潛能[1]。胚胎培養(yǎng)液作為胚胎生長發(fā)育的環(huán)境，能夠為胚胎提供水、離子、能量物質(zhì)、氨基酸、維生素、核酸前體、蛋白質(zhì)、生長因子激素、緩沖系統(tǒng)，在胚胎培養(yǎng)過程中，理論上在胚胎發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點目標(biāo)代謝物的變化能夠反映胚胎的代謝能力、發(fā)育潛能以及著床能力，故胚胎培養(yǎng)液的成分能夠作為胚胎質(zhì)量的生物標(biāo)記。有研究者使用高效液相色譜法（HPLC）檢測胚胎培養(yǎng)液，結(jié)果顯示氨基酸水平與胚胎移植后妊娠結(jié)局有關(guān)[2-4]。

行IVF-ET治療患者的年齡不同，其妊娠結(jié)局往往也不一樣，既然胚胎的氨基酸代謝可以預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能，由此推測不同年齡患者的胚胎其代謝可能也不一樣，但是目前不同年齡患者胚胎的氨基酸代謝規(guī)律尚不清楚。本研究使用HPLC法檢測胚胎的氨基酸代謝，比較胚胎的氨基酸代謝在不同年齡患者之間的差異，揭示不同年齡患者胚胎的氨基酸代謝規(guī)律，旨在為改善胚胎培養(yǎng)環(huán)境、獲得更優(yōu)質(zhì)胚胎從而提高IVF-ET的成功率提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、研究對象

2018年2月至2018年12月在佛山市第一人民醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET治療的患者，收集符合納入條件的體外培養(yǎng)新鮮胚胎的廢棄培養(yǎng)液為研究對象。按女方患者的年齡分為< 35歲組、35 ～ 39歲組、≥40歲組，每年齡組各收集20份培養(yǎng)液標(biāo)本，共60份標(biāo)本，另外選擇同一時期同樣培養(yǎng)環(huán)境下未培養(yǎng)過胚胎的培養(yǎng)液為空白對照組。本研究中行IVF-ET治療的患者均符合原衛(wèi)生部制定的《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》 中IVF-ET的適應(yīng)證，排除有禁忌證者，所有患者均已簽署知情同意書。納入實驗的培養(yǎng)液其胚胎符合以下標(biāo)準：①采用短效長方案或者長效長方案促排卵獲得卵子;②因男方因素需采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI） 授精;③正常受精的取卵后第3日（D3）胚胎;④患者夫妻雙方無代謝性疾病。

二、控制性促排卵

如前納入標(biāo)準所述，采用短效長方案或者長效長方案促排卵：于黃體中期（約月經(jīng)第20日）使用長效或者短效促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）進行垂體降調(diào)節(jié)，降調(diào)節(jié)14 d后使用促性腺激素（Gn）進行控制性促排卵，使用Gn后在陰道B超下監(jiān)測卵泡的大小，當(dāng)卵泡直徑≥18 mm的優(yōu)勢卵泡有1個以上時或者直徑≥17 mm的優(yōu)勢卵泡有2個以上時，于當(dāng)晚9點30分使用人絨毛膜促性腺激素（HCG）扳機，扳機后36 h在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。

三、精液的處理

取卵日當(dāng)日按WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版），使用密度梯度離心及上游法收集前向運動的精子。

四、ICSI授精

穿刺取出的卵母細胞經(jīng)G-IVF PLUS（Vitrolife G5）培養(yǎng)液沖洗3遍之后，在G-IVF PLUS培養(yǎng)液中培養(yǎng)待授精，培養(yǎng)條件為5% ～ 6% CO2、37℃的培養(yǎng)箱。于注射HCG 38 ～ 40 h后進行ICSI授精。

五、胚胎受精觀察及胚胎形態(tài)學(xué)評分

取卵后的第1日（D1）上午剝除顆粒細胞后，將受精卵單個分別移入CO2平衡好、蓋油的G-1 PLUS（Vitrolife G5）培養(yǎng)液微滴中，每個微滴大小約20 μl，在顯微鏡下觀察原核情況，以確定是否受精，如觀察到雙原核提示正常受精、觀察到3個原核為3PN受精。于D3上午觀察胚胎的卵裂情況并進行形態(tài)學(xué)的評分，具體評分及分級標(biāo)準參考文獻[5]。選擇正常受精的D3胚胎，其形態(tài)學(xué)中卵裂球數(shù)目6 ～ 10個、大小均一，碎片< 20%，收集培養(yǎng)過這些胚胎的廢棄培養(yǎng)液，并收集同一時期同樣培養(yǎng)箱同樣培養(yǎng)環(huán)境下同一培養(yǎng)皿中未培養(yǎng)過胚胎的培養(yǎng)液為空白對照。

六、樣本檢測

標(biāo)本收集好后在-20℃冰箱暫時儲存，運送至中國廣州分析測試中心的色譜實驗室，使用高效液相色譜儀（Agilent，1100型）檢測標(biāo)本中20種游離氨基酸的含量，檢測的方法為柱前衍生反相高效液相色譜（HPLC）法，具體參見文獻[6]。HPLC的色譜條件：使用Hypersil ODS 色譜柱（Agilent），規(guī)格為4.0 mm×125 mm，粒徑5 μm;流動相A的成分為10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4+pH7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS），含0.5%四氫呋喃（THF）;流動相B的成分為PBS+甲醇+乙腈（體積比50∶35∶15）;線性梯度0 ～ 25 min，流動相B以線性從0%上升到100%;流速1.0 ml/min，色譜柱的溫度為40℃;檢測波長0 ～ 20.5 min，激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm，主要檢測一級氨基酸的衍生物;20.5 min后，將波長切換至激發(fā)波長260 nm，發(fā)射波長305 nm，此時檢測二級氨基酸（脯氨酸）的衍生物。根據(jù)每種氨基酸在色譜柱上停留的時間不同將氨基酸依次分開。

七、氨基酸含量計算

將檢測標(biāo)本的色譜圖與已知含量的氨基酸標(biāo)準品的色譜圖進行對照，把曲線下面積轉(zhuǎn)換為檢測的氨基酸含量。將胚胎培養(yǎng)液中的氨基酸含量（中位數(shù)）減去空白對照組中的氨基酸含量（中位數(shù)）得出不同年齡患者的胚胎氨基酸含量變化。根據(jù)文獻[3-4]，氨基酸轉(zhuǎn)換量計算方法為：將20種氨基酸含量分別減去同樣培養(yǎng)環(huán)境下空白對照組的氨基酸含量，相對空白對照增加即為氨基酸增加量，用正數(shù)表示，相對空白對照減少即為減少量，用負數(shù)表示，將所有氨基酸的增加量和減少量的絕對值相加得到氨基酸轉(zhuǎn)換量。

綜上所述，不同年齡患者的胚胎在氨基酸代謝上存在差異，且患者的年齡越大，其胚胎的氨基酸減少量和氨基酸轉(zhuǎn)換量越大，與年輕患者相比這種差異也越大，基于這種代謝上的差異，提示我們是否可以根據(jù)這一代謝規(guī)律，為不同年齡患者設(shè)計不同成分的培養(yǎng)液來培養(yǎng)胚胎，滿足不同胚胎的不同代謝需求，從而得到具有更好發(fā)育潛力的胚胎，最終降低IVF-ET的雙胎率、提高活產(chǎn)率以獲得更好的妊娠結(jié)局，當(dāng)然這需要進一步大樣本量研究以及動物實驗去驗證。如何提高預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的能力，在減少移植胚胎數(shù)目、降低多胎妊娠發(fā)生率的同時又保持甚至提高胚胎的種植率和臨床妊娠率，仍然是人類輔助生殖領(lǐng)域尚需要解決的一個重要問題。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-04-22）

（本文編輯：林燕薇）