李愛峰 劉建偉 胡 楊 付藝?yán)?邱江兵

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266100; 2. 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)海洋大學(xué) 山東青島 266100)

二十世紀(jì)五六十年代, 在西太平洋關(guān)島地區(qū)當(dāng)?shù)赝林用癫槟_人群中流行一種地方病——肌萎縮側(cè)索硬化-帕金森癡呆綜合癥(ALS-PDC), 其發(fā)病率是其他地區(qū)平均水平的50～100 倍。但該疾病的發(fā)病率在移居到其他地區(qū)的查莫羅人的后代人群中明顯降低, 說明某些環(huán)境因素可能誘導(dǎo)該疾病的發(fā)生(李愛峰等, 2009; 牛琦等, 2012)?？茖W(xué)家推測(cè)關(guān)島地區(qū)高發(fā)的ALS-PDC 疾病可能與查莫羅人食譜中的蘇鐵(Cycasmicronesica)種子和果蝠(Pteropusmariannus)有關(guān), 其中含有一種神經(jīng)毒性的非蛋白氨基酸——β-N-甲氨基-L-丙氨酸(β-N-methylamino-L-alanine, BMAA),其沿食物鏈具有顯著的生物放大作用(Coxetal, 2003;Murchetal, 2004a)。隨后人們?cè)谒烙诎柎暮ＤY的2 名加拿大患者和12 名美國(guó)患者及死于ALS 疾病的13 名美國(guó)患者的腦組織中也檢出了BMAA, 說明環(huán)境中分布的BMAA 可能與全球散發(fā)的這類神經(jīng)退行性疾病有關(guān)(Murchetal, 2004b; Pabloetal, 2009)。我國(guó)學(xué)者在中國(guó)近海尤其是北方沿海采集的多種貝類軟體動(dòng)物樣品中普遍檢出 BMAA (Lietal, 2016,2018), 且發(fā)現(xiàn)BMAA 在膠州灣生態(tài)系統(tǒng)中也具有明顯的生物放大作用(Wangetal, 2021)。由于BMAA 分子在生物體內(nèi)既能以游離態(tài)形式存在, 也可與低分子量的多肽結(jié)合, 或直接嵌入蛋白質(zhì)分子中以蛋白結(jié)合態(tài)存在(Rosénetal, 2016), 通常生物樣品中游離態(tài)BMAA 與蛋白結(jié)合態(tài)BMAA 含量的比值范圍為1∶60～1∶120 (Inceet al, 2005)。因此, 目前研究工作中通常將BMAA 劃分為三種形態(tài)定量描述: 經(jīng)三氯乙酸等極性溶劑提取離心后, 溶解于上清液中的“游離態(tài)BMAA”; 在上清液中與多肽或小分子蛋白結(jié)合,經(jīng)鹽酸水解后釋放出來的“溶解結(jié)合態(tài)BMAA”; 在沉淀中與大分子蛋白結(jié)合, 經(jīng)鹽酸水解后釋放出來的“沉淀結(jié)合態(tài)BMAA”(Lanceetal, 2018)。

目前有關(guān)人神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制尚無定論, 但有關(guān)BMAA 對(duì)神經(jīng)元的毒性作用已得到普遍認(rèn)同。離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, BMAA 可通過多種途徑導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷, 主要包括: (1) BMAA 能夠與碳酸氫鹽結(jié)合生成與谷氨酸相似結(jié)構(gòu)的β-氨基甲酸鹽(Weissetal, 1988), 能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與神經(jīng)細(xì)胞膜上的離子型和促代謝型谷氨酸受體結(jié)合(Cucchiaroniet al, 2010), 導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+濃度升高, K+濃度降低, 從而破壞了細(xì)胞穩(wěn)態(tài); (2) 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高破壞線粒體功能, 導(dǎo)致活性氧的釋放, 造成氧化損傷(Raoetal, 2006); (3)谷氨酸受體的激活導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞去極化, 使得神經(jīng)細(xì)胞膜的通透性增加, 并釋放去甲腎上腺素, 造成興奮性中毒(Lindstr?metal,1990; Nedeljkovetal, 2005); (4) BMAA 還能抑制神經(jīng)細(xì)胞膜上的半胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(cystine/glutamate antiporter system, Xc-), 抑制抗氧化劑谷胱甘肽的合成(Liuetal, 2009)。近年的活體實(shí)驗(yàn)表明,長(zhǎng)期喂食含有BMAA 的水果導(dǎo)致綠猴(Chlorocebus sabaeus)腦組織中形成與ALS-PDC 患者腦組織中相似的神經(jīng)元纖維纏結(jié)和β-淀粉樣蛋白(Coxetal, 2016);BMAA 暴露(≥50 mg/kg)也會(huì)導(dǎo)致成年大鼠出現(xiàn)輕度短期行為改變和海馬神經(jīng)元丟失, 并出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白沉積(Scottet al, 2019)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了BMAA 毒素對(duì)人神經(jīng)退行性疾病的誘導(dǎo)作用。

毒理學(xué)研究表明, BMAA 對(duì)多種微藻、高等水生植物、水生動(dòng)物等水生生物也具有一定的毒害作用。研究發(fā)現(xiàn), 4.2 μmol/L 的外源 BMAA 對(duì)集胞藻Synechocystissp. PCC6803 的生長(zhǎng)和光合作用能力具有明顯的抑制作用(Downingetal, 2012); 20 μmol/L外源BMAA 導(dǎo)致固氮念珠藻Nodulariasp. PCC7120生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞內(nèi)糖原的積累(Berntzonetal, 2013),也可抑制魚腥藻Anabaenasp. PCC7120 細(xì)胞分化過程相關(guān)的hetR基因和hepA基因的表達(dá)和固氮酶活性(Popovaetal, 2018); 0.5 μmol/L 的BMAA 可導(dǎo)致三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)細(xì)胞內(nèi)葉綠素a的含量降低,且干擾藻細(xì)胞內(nèi)氮的代謝過程(Lageetal, 2016)。有關(guān)BMAA 與水生植物的暴露實(shí)驗(yàn)表明, BMAA 能夠引起羅蔓藤蕨(Lomariopsislineata)、水蘚(Fontinalis antipyretica)、鹿角苔(Ricciafluitans)、爪哇莫絲(Taxiphyllumbarbieri) 和金魚藻(Ceratophyllum demersum)等水生植物組織中抗氧化酶活性降低, 且在短時(shí)間內(nèi)不能恢復(fù)(Esterhuizen-Londtet al, 2011;Contardo-Jaraet al, 2013)。另外, BMAA 可影響大型蚤(Daphniamagna)的存活、運(yùn)動(dòng)和繁殖能力(Lürlinget al, 2011); 導(dǎo)致斑馬魚(Daniorerio)胚胎心率減慢、心包水腫、脊髓軸異常和痙攣驚厥等癥狀(Purdieet al,2009; Wang, 2015); 抑制海膽(Lytechinuspictus)胚胎的受精和發(fā)育, 出現(xiàn)細(xì)胞分裂異常和畸形發(fā)育(Liet al, 2020)。由此來看, BMAA 毒素對(duì)多種水生生物具有普遍的毒性作用, 威脅海洋生物的健康和生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。

海洋微藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)最主要的初級(jí)生產(chǎn)者, 對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)起著重要作用。海洋硅藻作為BMAA 毒素的重要來源, 在正常生長(zhǎng)代謝或細(xì)胞死亡后會(huì)將水溶性的BMAA 毒素釋放到胞外, 直接與海洋生物暴露接觸, 并可通過化學(xué)生態(tài)學(xué)作用影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的演化。然而目前有關(guān)BMAA 對(duì)海洋微藻毒性效應(yīng)的研究較少, 對(duì)其致毒機(jī)理的認(rèn)識(shí)也很有限, 有關(guān)外源BMAA 跨膜進(jìn)入微藻細(xì)胞的過程及環(huán)境中氨基酸的影響尚不清楚。本研究選擇我國(guó)近海分布的典型餌料藻——球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)為研究對(duì)象, 對(duì)其在BMAA暴露條件下的生長(zhǎng)狀況和吸收毒素的情況進(jìn)行了分析, 并比較分析了不同氨基酸單獨(dú)及其與BMAA 聯(lián)合暴露條件下對(duì)球等鞭金藻的影響, 以期揭示BMAA 對(duì)海洋浮游植物的化學(xué)生態(tài)學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

球等鞭金藻(3011)由中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院藻種庫提供。BMAA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(L-BMAA hydrochloride,B107-10 mg)和DAB 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(DL-2,4-diaminobutyric acid dihydrochloride, D3758-1 g)購自美國(guó)Sigma 公司,AEG 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[N-(2-aminoethyl) glycine, A608975-1 g]購自加拿大TRC 公司。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和優(yōu)級(jí)純鹽酸購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。分析純?nèi)纫宜岷蜕V純乙腈購自德國(guó)Merck 公司, 色譜純甲酸購自美國(guó)Sigma 公司。新鮮海水取自青島市嶗山區(qū)流清河附近海域。超純水是由Direct-Q?8 UV-R 純水系統(tǒng)(美國(guó) Millipore)制備。毒素分析用色譜柱 TSK-Gel Amide-80?(250 mm × 2 mm, 5 μm)購自日本Tosoh 生物科技有限公司。

1.2 BMAA 單獨(dú)暴露條件下球等鞭金藻的生長(zhǎng)狀況

1.2.1 球等鞭金藻的室內(nèi)培養(yǎng) 將新鮮海水經(jīng)0.45 μm 混合纖維濾膜過濾, 按照不含硅的f/2 培養(yǎng)基配方(Guillardet al, 1993)添加氮磷營(yíng)養(yǎng)液, 然后在高壓滅菌鍋中進(jìn)行高溫滅菌(121 °C, 20 min), 待冷卻至室溫后添加維生素和微量元素, 用于球等鞭金藻的批次培養(yǎng)。選用250 mL錐形瓶, 培養(yǎng)體系100 mL, 在無菌環(huán)境中接種藻液, 初始密度為3×105cells/mL 左右, 接種后立刻添加相應(yīng)的BMAA 毒素。根據(jù)BMAA暴露對(duì)球等鞭金藻的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 分別設(shè)置空白對(duì)照組和200、250、300、350、400 μg/L BMAA·HCl染毒組進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn), 每組設(shè)置3 個(gè)平行。將培養(yǎng)液放置在光照培養(yǎng)箱(HDL HPG-280BX, 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)內(nèi), 設(shè)置溫度18 °C, 光照強(qiáng)度6 000 lx, 光暗比12 h∶12 h, 每天分3 次定時(shí)輕輕搖勻微藻培養(yǎng)液, 并隨機(jī)更換培養(yǎng)箱中藻液的位置。

1.2.2 球等鞭金藻的生長(zhǎng)曲線及96 h 半效應(yīng)濃度(96 h-EC50)的計(jì)算 染毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)開始后每天取1 mL 藻液, 使用血球計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡(CKX53,日本Olympus)下計(jì)數(shù), 每瓶藻液搖勻后重復(fù)計(jì)數(shù)3 次,取平均值記錄藻細(xì)胞的生長(zhǎng)密度并繪制生長(zhǎng)曲線。在96 h 后, 根據(jù)《化學(xué)品: 藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)(GB/T 21805—2008)》中的相關(guān)計(jì)算方法計(jì)算比生長(zhǎng)率和抑制率, 以體系中BMAA·HCl 濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以抑制率為縱坐標(biāo), 繪制劑量—效應(yīng)曲線, 采用直線內(nèi)插法確定BMAA·HCl 對(duì)球等鞭金藻的96 h-EC50值。比生長(zhǎng)率按照下列公式計(jì)算:

式中,μi-j: 從i時(shí)刻到j(luò)時(shí)刻的比生長(zhǎng)率, 單位: d-1;Xi:i時(shí)刻的藻細(xì)胞密度;Xj:j時(shí)刻的藻細(xì)胞密度。

抑制率按照下列公式計(jì)算:

式中,Ir: 以比生長(zhǎng)率為基礎(chǔ)的抑制率, 單位: %;μc:對(duì)照組中各平行處理的比生長(zhǎng)率的平均值;μt: 染毒組中各平行處理的比生長(zhǎng)率的平均值。

1.3 球等鞭金藻對(duì)外源BMAA 的吸收及其氨基酸含量的測(cè)定

1.3.1 球等鞭金藻的室內(nèi)培養(yǎng)與藻細(xì)胞的收集 采用1.2.1 部分相同的方法準(zhǔn)備微藻培養(yǎng)液, 選用1 L錐形瓶, 培養(yǎng)體系500 mL, 接種的初始密度為5×105cells/mL 左右, 設(shè)置空白對(duì)照組和100、300、700 μg/L BMAA·HCl 染毒組共4 組, 每組3 個(gè)平行。在溫度18 °C, 光照強(qiáng)度6 000 lx, 光暗比12 h∶12 h條件下培養(yǎng), 每天分3 次定時(shí)搖勻藻液, 并隨機(jī)更換藻液的位置, 降低光照條件的影響。采用1.2.1 部分相同的方法計(jì)數(shù)微藻的細(xì)胞密度。在球等鞭金藻染毒培養(yǎng)96 h 后, 充分搖勻藻液, 每組取100 mL 于4 °C下以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min 收集藻細(xì)胞, 用于測(cè)定藻細(xì)胞中BMAA 的含量。另取空白對(duì)照組和300 μg/L BMAA·HCl 組每瓶藻液各400 mL, 于4 °C下以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min 收集藻細(xì)胞, 盡量去除上清液, 記錄藻泥濕重, 用于測(cè)定藻細(xì)胞中氨基酸的含量。將收集到的藻泥置于-20 °C 冰箱中保存待測(cè)。

1.3.2 藻細(xì)胞中BMAA 的提取 向含有藻泥的離心管中加入3 mL 0.1 mol/L 的三氯乙酸, 渦旋混勻,于冰浴中超聲破碎10 min, 最后在4 °C 條件下以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min。取離心后的上清液1 mL,經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過濾至1.5 mL 進(jìn)樣瓶, 得到的游離態(tài)BMAA 提取液置于-20 °C 冰箱中保存。取離心后的上清液1 mL 轉(zhuǎn)移至4 mL 進(jìn)樣瓶中, 在55 °C 條件下氮吹, 吹干后加入1 mL 6 mol/L 鹽酸溶解, 渦旋混勻后在110 °C 下水解24 h, 冷卻至室溫后再次氮吹, 吹干后加入1 mL 20 mmol/L 鹽酸重新溶解, 經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過濾至1.5 mL 進(jìn)樣瓶中, 得到的總?cè)芙鈶B(tài)BMAA 提取液置于-20 °C 冰箱中保存。移除上清液后, 向沉淀中加入2 mL 6 mol/L 鹽酸, 渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至4 mL 進(jìn)樣瓶中, 在110 °C 條件下水解24 h, 冷卻至室溫后在55 °C 條件下氮吹, 吹干后加入1 mL 20 mmol/L 鹽酸重新溶解, 經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過濾至1.5 mL 進(jìn)樣瓶中, 將得到的沉淀結(jié)合態(tài)BMAA 提取液置于-20 °C 冰箱中保存。

1.3.3 藻細(xì)胞中氨基酸的提取 參考《食品中氨基酸的測(cè)定(GB/T 5009.124—2016)》, 稍作修改。向含有藻泥的離心管中加入5 mL 6 mol/L HCl, 渦旋混勻,轉(zhuǎn)移至10 mL 消解管中, 充入高純氮?dú)? 在110 °C 條件下水解22 h。水解結(jié)束后冷卻至室溫, 將水解液用濾紙過濾到25 mL 容量瓶中, 用超純水多次沖洗水解管, 經(jīng)濾紙過濾后合并轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶?jī)?nèi), 用超純水定容, 混勻。取2 mL 定容后的溶液至4 mL 樣品瓶中, 55 °C 條件下用氮?dú)獯蹈? 然后加入 1 mL 20 mmol/L 鹽酸重新溶解, 經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過濾至1.5 mL 進(jìn)樣瓶中, 得到的氨基酸提取液置于-20 °C 冰箱中保存。

1.3.4 BMAA 毒素分析 使用Agilent 1290 高效液相色譜串聯(lián)Agilent 6430 三重四極桿質(zhì)譜儀系統(tǒng)(美國(guó)Agilent 公司), 不經(jīng)衍生直接測(cè)定BMAA 的含量, 具體參數(shù)如下:

色譜柱為 TSK-Gel Amide-80?HILIC 色譜柱(250 mm × 2 mm, 5 μm), 柱溫40 °C, 進(jìn)樣體積5 μL,流速 350 μL/min, 采用梯度洗脫, 流動(dòng)相A 為含有50 mmol/L 甲酸的水溶液, 流動(dòng)相B 為含有50 mmol/L甲酸的乙腈溶液。在0～15 min 內(nèi), 流動(dòng)相A 由10%升高至40%, 保持4 min 后, 在19.01 min 切換為45%并保持至27 min, 在27.01 min 切換到10%并保持至30 min。

質(zhì)譜聯(lián)接接口為電噴霧離子源, 霧化器壓力40 psi,毛細(xì)管電壓4 000 V, 電噴霧電壓5 500 V, 霧化氣為N2, 霧化溫度450 °C, 干燥氣體溫度350 °C, 干燥氣體流速10 L/min。根據(jù)毒素的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù),采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性和定量分析。使用的變遷離子為119→102、119→101、119→88、119→56和119→44, 碎裂電壓60 V, 碰撞能分別為8、5、8、15 和20 V。在使用的5 個(gè)變遷離子中, BMAA、DAB和AEG 分別缺少119→101、119→88 和119→88, 均具有4 個(gè)不同的變遷離子用于定性分析。在定量計(jì)算BMAA、DAB 和AEG 濃度時(shí), 分別采用變遷離子119→88、119→101 和119→102 的峰面積進(jìn)行計(jì)算。

1.3.5 藻細(xì)胞中氨基酸的分析 應(yīng)用 Hitachi L-8800 氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定藻細(xì)胞中天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸共16 種氨基酸的含量。參照《食品中氨基酸的測(cè)定(GB/T5009.124-2016)》中的要求, 色譜柱選用磺酸型陽離子樹脂, 柱溫50 °C, 反應(yīng)器溫度135 °C, 進(jìn)樣量20 μL, 泵1 流速0.40 mL/min, 泵2 流速0.35 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)570和440 nm, 采用外標(biāo)法通過峰面積計(jì)算樣品測(cè)定溶液中氨基酸的濃度。

樣品中氨基酸含量Xi(%)按照下列公式計(jì)算:

式中,Ci: 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸濃度(nmol/mL);Mi: 氨基酸分子量;Sis: 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積;Sti: 樣品的峰面積;V:樣品水解液轉(zhuǎn)移定容的體積(mL);m: 樣品濕重(g)。

1.4 BMAA 與氨基酸聯(lián)合作用對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)狀況的影響

1.4.1 球等鞭金藻的室內(nèi)培養(yǎng)及96 h 抑制率的計(jì)算采用1.2.1 部分相同的方法配制微藻培養(yǎng)液, 選用250 mL 錐形瓶, 培養(yǎng)體系150 mL, 接種的初始密度在5×105cells/mL 左右。參考前面的研究結(jié)果, 選取BMAA 對(duì)球等鞭金藻的96 h-EC50值(2 μmol/L)為暴露濃度, 設(shè)置空白對(duì)照組、2 μmol/L 單一氨基酸組(20種氨基酸對(duì)應(yīng)20 組)、2 μmol/L 20 種氨基酸組、2 μmol/L BMAA 組、2 μmol/L (BMAA+單一氨基酸)組(20 種氨基酸對(duì)應(yīng)20 組)、2 μmol/L (BMAA+20 種氨基酸)組共44 組, 每組3 個(gè)平行。設(shè)置光照培養(yǎng)箱溫度18 °C, 光照強(qiáng)度6 000 lx, 光暗比12 h∶12 h,每天分3 次定時(shí)搖勻藻液, 并隨機(jī)更換藻液的位置。采用1.2.2 部分相同的方法, 計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度, 并計(jì)算比生長(zhǎng)率和抑制率。

1.4.2 藻細(xì)胞中BMAA 的提取和分析 球等鞭金藻染毒培養(yǎng)96 h 后, 充分搖勻藻液, 選取空白對(duì)照組、2 μmol/L BMAA 組、2 μmol/L (BMAA+色氨酸)組、2 μmol/L (BMAA+谷氨酰胺)組、2 μmol/L(BMAA+蛋氨酸)組、2 μmol/L (BMAA+精氨酸)組、2 μmol/L (BMAA+絲氨酸)組共 7 組, 每瓶藻液取100 mL 于4 °C 條件下以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min收集藻細(xì)胞, 離心后的上清液用于提取總?cè)芙鈶B(tài)BMAA。BMAA 毒素提取和分析方法分別見1.3.2 和1.3.4 部分。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析, 在P＜0.05 水平下通過單因素方差分析(One way ANOVA)對(duì)不同處理組的數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較, 用不同的字母表示兩組數(shù)據(jù)間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 BMAA 對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)

不同濃度的BMAA 與球等鞭金藻暴露接觸96 h后微藻的生長(zhǎng)曲線如圖1 所示。從圖中可以看出, 球等鞭金藻與不同濃度的BMAA 暴露接觸24 h 后即表現(xiàn)出生長(zhǎng)密度的差異, 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)這種差異越來越明顯。在96 h 內(nèi), BMAA 對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)與培養(yǎng)體系中BMAA 的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。暴露接觸 96 h 后, 與對(duì)照組相比, 200 μg/L BMAA·HCl 對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)抑制率僅為5%, 表現(xiàn)為輕微抑制; 而當(dāng)濃度增加至250 μg/L 時(shí), 生長(zhǎng)抑制率迅速提高至36%; 在最高暴露濃度400 μg/L 時(shí),生長(zhǎng)抑制率達(dá)到88%, 球等鞭金藻的生長(zhǎng)幾乎被完全抑制。需要指出的是, 在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)驗(yàn)證了毒素溶劑中2 mmol/L HCl 對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)未見影響, 因此可以確定外源BMAA 對(duì)球等鞭金藻的比生長(zhǎng)率產(chǎn)生了抑制效應(yīng)。

圖1 不同濃度BMAA 暴露條件下球等鞭金藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Isochrysis galbana (3011) under different concentrations of BMAA during 96-hours exposure period

參考《化學(xué)品: 藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)(GB/T 21805—2008)》中繪制受試微藻劑量-效應(yīng)曲線的方法, 使用染毒96 h 后不同濃度BMAA 實(shí)驗(yàn)組中微藻的抑制率和對(duì)應(yīng)的BMAA 毒素濃度的對(duì)數(shù)值做相關(guān)性分析,得到擬合曲線Y=2.638 6X-6.023 8,R2=0.970 1, 說明劑量-效應(yīng)曲線的線性關(guān)系良好。最后計(jì)算得BMAA毒素對(duì)球等鞭金藻的 96 h-EC50值為 297 μg/L BMAA·HCl, 約為2 μmol/L BMAA。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了外源BMAA 毒素對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng), 這種毒性效應(yīng)與前期報(bào)道的藍(lán)藻藻株的 BMAA 毒素暴露實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。在向BG11 培養(yǎng)基中加入 4.2 μmol/L (約合 649 μg/L BMAA·HCl) 和 42 μmol/L ( 約 合 6 493 μg/L BMAA·HCl)的外源BMAA 后, 48 h 內(nèi)BMAA 對(duì)集胞藻PCC6803 的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用, 染毒組藻液顏色明顯淺于對(duì)照組, 表現(xiàn)出萎黃病的癥狀, 平均比生長(zhǎng)率也始終低于對(duì)照組(高濃度染毒組的平均比生長(zhǎng)率甚至為負(fù)數(shù), 呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)), 在192 h 內(nèi)無法恢復(fù)至對(duì)照組的藻細(xì)胞密度(Downingetal, 2012)。另一項(xiàng)研究表明, 20 μmol/L 外源BMAA (約合3 092 μg/L BMAA·HCl)能夠造成固氮念珠藻PCC7120 在48 h 內(nèi)生長(zhǎng)完全停滯, 并出現(xiàn)類似萎黃病的癥狀, 但這種抑制效應(yīng)在染毒7 d 后逐漸消失, 表明藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的BMAA 能夠被代謝或降解(Berntzonetal, 2013)。此外,20 μmol/L 外源BMAA 在48 h 內(nèi)顯著抑制魚腥藻PCC7120 的生長(zhǎng), 當(dāng)毒素濃度增加至50 μmol/L 和100 μmol/L 時(shí)受試藻細(xì)胞生長(zhǎng)完全停滯, 并出現(xiàn)了細(xì)胞裂解的現(xiàn)象(Popovaetal, 2018)。本研究中使用的BMAA 暴露濃度遠(yuǎn)低于這些毒性實(shí)驗(yàn)中使用的劑量,但在暴露濃度400 μg/L BMAA·HCl 時(shí), 球等鞭金藻的比生長(zhǎng)率的抑制率已高達(dá)88%, 說明球等鞭金藻對(duì)BMAA 的毒性效應(yīng)相對(duì)藍(lán)藻而言更敏感。本研究中各實(shí)驗(yàn)組的藻液顏色在染毒8 d 后也逐漸加深, 表明BMAA 對(duì)球等鞭金藻的抑制效應(yīng)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱。

2.2 球等鞭金藻對(duì)外源BMAA 的吸收及其氨基酸含量分析

2.2.1 球等鞭金藻對(duì)外源BMAA 的吸收 本研究采用LC-MS/MS 方法分析了球等鞭金藻與BMAA 毒素暴露培養(yǎng)96 h 后藻細(xì)胞內(nèi)的BMAA 及其同分異構(gòu)體DAB 和AEG 的含量, 色譜圖如圖2 所示。從圖中可以看出, 空白對(duì)照組培養(yǎng)的球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)未檢出BMAA 和AEG, 但含有少量的DAB 毒素, 而在與BMAA 暴露培養(yǎng)96 h 后的球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)檢出BMAA, 說明外源BMAA 可以進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)抑制球等鞭金藻的有絲分裂過程。關(guān)于DAB 的檢出并不意外, 已有大量研究報(bào)道藍(lán)藻、硅藻、貝類及其他水生動(dòng)物樣品中檢出DAB, 且未見明顯的種間差異, 總體含量較低(Réveillonetal, 2014; Fanetal, 2015; Lietal, 2018; Wangetal, 2021)。該毒素不是本研究的重點(diǎn), 在此不作詳細(xì)討論。

圖2 LC-MS/MS 分析BMAA、DAB 和AEG 的色譜圖Fig.2 LC-MS/MS chromatograms of (a) BMAA, DAB and AEG mixed standards, (b) total soluble bound extract of Isochrysis galbana(3011) from the control group, and (c) total soluble bound extract of I. galbana (3011) after 96-hours exposure to 300 μg/L BMAA·HCl

染毒96 h 后球等鞭金藻單位細(xì)胞中BMAA 和DAB 含量如圖3 所示。從圖中可以看出, 染毒后細(xì)胞中BMAA 主要以總?cè)芙鈶B(tài)形式(＞99%)存在, 沉淀結(jié)合態(tài)BMAA 的含量很低; 在總?cè)芙鈶B(tài)BMAA 中, 約有36%～51%的BMAA 是以游離態(tài)形式存在, 并且單位細(xì)胞內(nèi)游離態(tài)和總?cè)芙鈶B(tài)BMAA 的含量與體系中外源BMAA 的加入量呈正相關(guān), 進(jìn)一步說明細(xì)胞內(nèi)的BMAA 來自于培養(yǎng)基中的外源毒素。球等鞭金藻細(xì)胞中DAB 的本底值為0.12 fg/cell, DAB 在球等鞭金藻細(xì)胞中主要以溶解結(jié)合態(tài)為主, 幾乎不含沉淀結(jié)合態(tài)形式; 僅在濃度最高的700 μg/L BMAA·HCl實(shí)驗(yàn)組中檢出游離態(tài)DAB。雖然所有實(shí)驗(yàn)組中球等鞭金藻細(xì)胞中DAB 含量普遍較低(＜6 fg/cell), 但單位細(xì)胞內(nèi)DAB 含量也隨著BMAA 暴露濃度的增加而升高, 與體系中外源BMAA 的加入量呈正相關(guān)。目前尚無法解釋這種現(xiàn)象, 推測(cè)可能是球等鞭金藻在吸收外源BMAA 的過程中, 轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了少量的DAB,也可能是由于球等鞭金藻受到BMAA 毒素的抑制脅迫后, 使得DAB 的合成量升高。

圖3 BMAA 暴露接觸96 h 后球等鞭金藻單位細(xì)胞中BMAA (a) 和DAB (b) 的含量Fig.3 Concentrations of BMAA (a) and DAB (b) detected in Isochrysis galbana (3011) after 96-hours exposure to BMAA

據(jù)報(bào)道, 集胞藻PCC6803 在含有0.5 和5 μmol/L的BMAA 培養(yǎng)基中暴露接觸10 min 后, 單位細(xì)胞內(nèi)游離態(tài)和沉淀結(jié)合態(tài)BMAA 含量明顯上升, 且表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性, 但在24 h 后單位細(xì)胞中游離態(tài)和蛋白結(jié)合態(tài)BMAA 含量逐漸下降, 蛋白結(jié)合態(tài)BMAA 在72 h 時(shí)已無法檢出, 表明藍(lán)藻能夠迅速吸收體系中的BMAA 并逐漸將其代謝排出或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)(Downingetal, 2012)。念珠藻PCC7120 在1 min 內(nèi)也能夠迅速吸收體系中的10 μmol/L 外源14C-BMAA, 且單位細(xì)胞內(nèi)14C-BMAA 在30 min 內(nèi)持續(xù)增加(Berntzonetal, 2013)。海洋硅藻三角褐指藻和威氏海鏈藻在添加0.05 μmol/L 外源BMAA 的培養(yǎng)體系中, 單位細(xì)胞內(nèi)游離態(tài)和蛋白結(jié)合態(tài)BMAA 的含量在96 h 內(nèi)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(Lageetal,2016)。另外在細(xì)菌與外源 BMAA 的暴露實(shí)驗(yàn)中(100 μM BMAA), 發(fā) 現(xiàn)Escherichiacoli、Staphylococcusepidermis、Lactobacilluscasei、Bacillus subtilis、Pseudomonasaeruginosa和Micrococcus luteus6 種細(xì)菌均檢出游離態(tài)和沉淀結(jié)合態(tài)BMAA(van Onselenetal, 2015)。但這些研究中均未檢測(cè)BMAA 的其他同系物成分。

2.2.2 球等鞭金藻與BMAA 暴露接觸后細(xì)胞內(nèi)氨基酸含量的變化 球等鞭金藻與BMAA 暴露接觸96 h 后細(xì)胞中16 種氨基酸含量與空白對(duì)照組的對(duì)比如圖4 所示。需要指出的是, 本研究采用鹽酸水解法提取球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的氨基酸, 由于色氨酸和半胱氨酸在水解過程中被破壞, 天冬酰胺和谷氨酰胺在水解過程中轉(zhuǎn)化為天冬氨酸和谷氨酸, 因此本方法只能檢測(cè)其他16 種氨基酸的含量。從圖4 可以看出, 除纈氨酸(Val)外, 其余15 種氨基酸在球等鞭金藻細(xì)胞中均被檢出, 對(duì)照組和 2 μmol/L BMAA(300 μg/L BMAA·HCl)組中含量最高的氨基酸均為絲氨酸, 分別占藻細(xì)胞氨基酸總量的74.2%和54.7%。早期人們對(duì)球等鞭金藻主要營(yíng)養(yǎng)成分的分析結(jié)果顯示, 氨基酸總量占藻細(xì)胞干重的33.74%, 必需氨基酸總量占藻細(xì)胞干重的16.26% (陳椒芬等, 1987)。鄢朝(2012)對(duì)球等鞭金藻的測(cè)定結(jié)果顯示, 谷氨酸的含量最高, 占細(xì)胞干重的5.09%, 氨基酸總量占細(xì)胞干重的32.15%, 必需氨基酸總量占細(xì)胞干重的13.41%。假定離心收集后的藻細(xì)胞含水率在80%左右, 換算后本研究中對(duì)照組球等鞭金藻氨基酸總量占藻細(xì)胞干重的26.15%, 基本與上述研究結(jié)果一致。此外, 與對(duì)照組相比, 300 μg/L BMAA·HCl 未顯著影響球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)氨基酸的種類和組成比例(P＞0.05), 但除組氨酸(His)外, 其余14 種氨基酸的含量均明顯降低(P＜0.05), 其中以酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)和絲氨酸(Ser)最為明顯, 分別降低了36%、34%和26%, 表明BMAA 在抑制球等鞭金藻細(xì)胞分裂的過程中也降低了細(xì)胞內(nèi)的氨基酸合成。

圖4 BMAA 暴露接觸96 h 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中球等鞭金藻細(xì)胞中氨基酸含量的對(duì)比(mg/100 mg 濕重)Fig.4 Comparison in the content of amino acids (mg/100 mg wet weight) in Isochrysis galbana (3011) after 96-hours exposure to BMAA and control groups

2.3 氨基酸和BMAA 聯(lián)合作用對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)狀況的影響

2.3.1 氨基酸可促進(jìn)BMAA 對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng) 氨基酸單獨(dú)或與BMAA 聯(lián)合作用于球等鞭金藻96 h 后的生長(zhǎng)抑制率如表1 所示。從表中可以看出, 20 種氨基酸單獨(dú)作用于球等鞭金藻的生長(zhǎng)抑制率均在±3%以內(nèi), 表明外加2 μmol/L 的氨基酸對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)沒有明顯的影響。除溶解性無機(jī)氮(dissolved inorganic nitrogen, DIN)外, 溶解性有機(jī)氮(dissolved organic nitrogen, DON)也是海洋微藻的重要氮源, 其中溶解性游離態(tài)氨基酸(dissolved free amino acid, DFAA)在海洋中的濃度通常低于5 μmol/L (徐寧等, 2013)。部分海洋微藻在DIN 含量不足的情況下能夠通過多種方式利用環(huán)境中的DFAA, 如通過細(xì)胞膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng), 將與Na+形成絡(luò)合物的DFAA和Na+一起轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞, 同時(shí)將K+排出細(xì)胞, 從而吸收環(huán)境中部分帶有電荷的特定DFAA (Johnet al,1999)。此外, 部分微藻能夠與細(xì)菌相互作用, 利用細(xì)菌產(chǎn)生的多肽水解酶將海洋環(huán)境中的多肽分解為DFAA, 同時(shí)釋放L-氨基酸氧化酶, 將DFAA 氧化為銨鹽, 從而間接利用DFAA(Mulhollandetal, 2003)。氨基酸在藻細(xì)胞生命活動(dòng)中起著重要作用, 通常不會(huì)對(duì)微藻產(chǎn)生毒害作用, 有時(shí)微藻吸收利用環(huán)境中DFAA 的量甚至達(dá)到總氮吸收量的50%以上(徐寧等,2013)。前期研究發(fā)現(xiàn), 4.2 和42 μmol/L 的外源精氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和甘氨酸在192 h 內(nèi)未對(duì)集胞藻 PCC6803 的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用(Downingetal,2012); 羊角月牙藻(Selenastrumcarpricornutum)能夠直接吸收利用培養(yǎng)體系中10 μmol/L 的游離態(tài)絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸作為唯一氮源進(jìn)行快速生長(zhǎng)(翟天恩等, 2017); 銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)能夠利用100 μmol/L 精氨酸、丙氨酸和亮氨酸作為氮源進(jìn)行生長(zhǎng), 而谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸雖然不能被細(xì)胞利用, 但對(duì)藻細(xì)胞也未表現(xiàn)出毒害作用(Daietal, 2009)。本研究中添加的20 種外源氨基酸對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)均沒有明顯的促進(jìn)作用, 這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)體系中含有較充足的DIN, 球等鞭金藻尚未啟動(dòng)利用DFAA 的機(jī)制。

表1 氨基酸單獨(dú)作用(2 μmol/L)及其與BMAA 聯(lián)合作用(2 μmol/L BMAA+2 μmol/L 氨基酸) 96 h 后球等鞭金藻生長(zhǎng)的抑制率Tab.1 The inhibition rates of Isochrysis galbana (3011) after 96-hours exposure to 2 μmol/L amino acids and mixed solution of 2μmol/L amino acids and 2 μmol/L BMAA

但本研究發(fā)現(xiàn)大部分氨基酸與BMAA 聯(lián)合作用時(shí)對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制效應(yīng), 除2 μmol/L (BMAA+脯氨酸)組、2 μmol/L (BMAA+蘇氨酸)組和2 μmol/L (BMAA+甘氨酸)組, 其余18 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的96 h 生長(zhǎng)抑制率均高于BMAA 單獨(dú)作用組(11%), 其中 2 μmol/L (BMAA+半胱氨酸)組、2 μmol/L (BMAA+色氨酸)組和2 μmol/L (BMAA+酪氨酸)組的96 h 生長(zhǎng)抑制率高達(dá)60%。從氨基酸R 基的結(jié)構(gòu)來看, 聯(lián)合毒性作用下96 h 生長(zhǎng)抑制率超過50%的氨基酸均為非極性氨基酸和極性、不帶電荷的氨基酸, 而酸性氨基酸與堿性氨基酸的96 h 生長(zhǎng)抑制率均未超過50%, 似乎表明非極性氨基酸和極性、不帶電荷的氨基酸與BMAA 聯(lián)合作用時(shí)對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。需要指出的是, 在這批聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)中2 μmol/L BMAA 組的96 h 生長(zhǎng)抑制率并沒有達(dá)到預(yù)期的50% (2.1 部分), 這可能與此次實(shí)驗(yàn)所用的天然海水或者藻細(xì)胞初始生長(zhǎng)狀況等因素有關(guān)。目前有關(guān)BMAA 與其他污染物對(duì)微藻聯(lián)合毒性作用的研究較少。據(jù)報(bào)道, 80 μg/L 的BMAA 與20 μg/L 的微囊藻毒素(MC-LR)聯(lián)合作用于一種淡水綠藻——毯藻Aegagropilalinnaei, 發(fā)現(xiàn)兩種毒素單獨(dú)作用下的抗氧化酶活性在染毒1 和7 d 后沒有明顯變化(P＞0.05),聯(lián)合作用下也只有過氧化氫酶的活性明顯升高(P＜0.001), 表明這兩種毒素的聯(lián)合作用毒性較弱(Contardo-Jaraetal, 2015)。

2.3.2 氨基酸和BMAA 聯(lián)合作用下球等鞭金藻對(duì)BMAA 的吸收情況 本研究2.2 部分已表明球等鞭金藻細(xì)胞中BMAA 和DAB 主要以總?cè)芙鈶B(tài)的形式存在, 因此該部分實(shí)驗(yàn)中只分析了部分實(shí)驗(yàn)組染毒96 h后單位細(xì)胞中總?cè)芙鈶B(tài)BMAA 和DAB 的含量, 結(jié)果如圖 5 所示。結(jié)果表明, 聯(lián)合毒性作用較強(qiáng)的2 μmol/L (BMAA+色氨酸)組、2 μmol/L (BMAA+谷氨酰胺)組、2 μmol/L (BMAA+蛋氨酸)組和2 μmol/L(BMAA+精氨酸)組中單位細(xì)胞內(nèi)總?cè)芙鈶B(tài)BMAA 和DAB 的含量均明顯高于對(duì)照組和2 μmol/L BMAA 單獨(dú)作用組(P＜0.05), 而聯(lián)合毒性作用較弱的2 μmol/L(BMAA+絲氨酸)組(96 h 生長(zhǎng)抑制率為13%)中單位細(xì)胞內(nèi)總?cè)芙鈶B(tài)BMAA 和DAB 的含量與2 μmol/L BMAA 單獨(dú)作用組(96 h 生長(zhǎng)抑制率為11%)相近, 表明單位細(xì)胞內(nèi)總?cè)芙鈶B(tài)BMAA 和DAB 含量與96 h生長(zhǎng)抑制率之間具有一定的正相關(guān)性。由此來看, 氨基酸與BMAA 聯(lián)合暴露的過程中, 氨基酸促進(jìn)了球等鞭金藻對(duì)外源BMAA 毒素的吸收, 從而使得聯(lián)合作用實(shí)驗(yàn)組中球等鞭金藻的96 h 抑制率明顯升高。這可能是因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)基中額外添加氨基酸時(shí), 球等鞭金藻細(xì)胞上更多的氨基酸通道被打開, 使得更多的BMAA 分子通過這些氨基酸通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但有關(guān)BMAA 抑制球等鞭金藻細(xì)胞分裂的機(jī)制尚不清楚, 有待深入研究。

圖5 染毒96 h 后球等鞭金藻單位細(xì)胞總?cè)芙鈶B(tài)BMAA (a)和DAB (b)的含量Fig.5 Contents of total soluble BMAA (a) and DAB (b) in Isochrysis galbana (3011) after 96-hours exposure

3 結(jié)論

本研究首次探究了神經(jīng)毒素BMAA 對(duì)海洋球等鞭金藻的毒性作用, 其對(duì)球等鞭金藻比生長(zhǎng)率的抑制效應(yīng)濃度96 h-EC50約為2 μmol/L。球等鞭金藻能夠吸收培養(yǎng)體系中的外源BMAA 毒素, 且吸收量與BMAA 的添加濃度呈正相關(guān); 進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)的BMAA 毒素多半以溶解結(jié)合態(tài)的形式存在, 且DAB的含量也隨著 BMAA 暴露濃度的增加而升高; 在BMAA 毒素暴露實(shí)驗(yàn)組中, 球等鞭金藻細(xì)胞中除纈氨酸外, 所測(cè)的其他15 種氨基酸的合成量明顯降低。大多數(shù)氨基酸在與BMAA 聯(lián)合作用的過程中, 促進(jìn)了球等鞭金藻對(duì)外源BMAA 的吸收, 增強(qiáng)了BMAA對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。