呂玉晗 張 弛 戴了疑 何衛(wèi)彤 鄭小東①

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所 山東青島 266003; 2. 中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實驗室 山東青島 266003; 3. 廣東省陽江市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 廣東陽江 529500)

杜氏槍魷屬于頭足綱(Cephalopoda)、閉眼魷目(Myopsida)、槍魷科(Loliginidae)、尾槍魷屬(Uroteuthis),俗稱小管、鎖管等(Jerebetal, 2010; Youngetal, 2019),廣泛分布于西太平洋和印度洋, 特別是我國的黃海、東海和南海以及泰國、菲律賓海域(Jerebetal, 2010;Sabrahetal, 2015)。杜氏槍魷為一年生種類, 具有繁殖能力強(qiáng)、生命周期短、生長速率快等特點(diǎn), 經(jīng)濟(jì)價值高, 開發(fā)潛力大。因其肉質(zhì)細(xì)膩, 味道鮮美, 含有多種人體必需氨基酸和礦物元素, 深受消費(fèi)者的喜愛, 國內(nèi)外市場需求一直不斷增長, 近些年, 已從副漁獲物轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕?biāo)漁獲物(Kangetal, 2018)。

國內(nèi)外學(xué)者對杜氏槍魷的研究主要集中于生長發(fā)育、資源評估等方面(Mohamed, 1996; Karniket al, 2001; Mishraetal, 2012; 方舟等, 2018), 多項研究發(fā)現(xiàn)分布于不同海域的杜氏槍魷存在顯著的遺傳差異(De Luna Salesetal, 2013; Andersonetal,2014; Khatamietal, 2018)。形態(tài)特征能夠直觀反映遺傳差異, 有關(guān)其形態(tài)差異和種群結(jié)構(gòu)的研究鮮有報道。作為西太平洋廣布種, 杜氏槍魷易受地理阻隔和生態(tài)環(huán)境等因素影響, 導(dǎo)致形態(tài)發(fā)生相應(yīng)變化以適應(yīng)復(fù)雜生境(Carvalhoetal, 1998), 研究不同地理群體的形態(tài)差異對于了解種群動態(tài)以及探討隱存多樣性是很有必要的。因此, 本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察和多元統(tǒng)計分析方法(主成分分析、聚類分析、判別分析和單因素方差分析)對西太平洋沿海 7 個不同地理群體的形態(tài)特征進(jìn)行比較分析, 旨在為杜氏槍魷種質(zhì)資源保護(hù)、合理利用與科學(xué)管理提供重要的形態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用樣品采集自7 個地理群體: 江蘇南通(NT)、浙江寧波(NB)、浙江南麂島(NJD)、福建東山(DS)、廣東汕頭(ST)、廣東陽江(YJ)和泰國灣(GT), 共計202 個樣品, 具體的采樣信息見表1。各群體樣品均為漁船出海捕撈獲得, 運(yùn)輸途中冷凍保存, 樣品運(yùn)回實驗室后室溫解凍清洗, 10%福爾馬林溶液固定,一周后轉(zhuǎn)至75%酒精長期保存(Roperet al, 1983)。

表1 杜氏槍魷7 個地理群體的采樣信息Tab.1 Details of sampling of seven geographic populations of U. duvaucelii in the western Pacific

1.2 形態(tài)測量

選取較為完整的固定后樣品進(jìn)行形態(tài)測量。測量方法參照Sin 等(2009)和Liao 等(2010), 包括全長(TL)、體重(TW)、胴背長(DML)、胴腹長(VML)、胴體寬(MW)、頭寬(HW)、頭長(HL)、鰭長(L/R, FL)、鰭寬(FW)、眼直徑(ED)、腕長(AL, 1～4)、腕寬(AW,1～4)、莖化腕長(HcL, 雄性)。

1.3 齒舌電鏡樣品制備

從樣品口部向外擠壓口球部分, 至角質(zhì)顎完全擠出。用鑷子將齒舌從角質(zhì)顎后部小心取出。用蒸餾水清洗齒舌表面的食物殘渣, 然后放進(jìn) 5%～7%的NaOH 溶液中煮沸。之后把齒舌置于CO2臨界點(diǎn)干燥后進(jìn)行掃描電鏡觀察并拍照(鄭小東等, 2009)。

1.4 角質(zhì)環(huán)獲取與觀察

在帶有攝像系統(tǒng)的體視顯微鏡(型號: Nikon SMZ 800N)下, 用尖嘴鑷子將樣品第三腕和觸腕穗吸盤中的角質(zhì)環(huán)取出, 用海水沖洗干凈, 然后拍照并記錄齒數(shù)。

1.5 多元統(tǒng)計分析

由于雌雄樣品的第三腕大吸盤角質(zhì)環(huán)齒數(shù)存在顯著差異, 將雌雄樣品分開分析。將各測量數(shù)據(jù)除以胴背長(DML)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)參考Roper 等(1983): MWI (胴背寬/胴背長×100)、FLI (鰭長/胴背長×100)、FWI (鰭寬/胴背長×100)、EDI (眼直徑/胴背長×100)、ALI (腕長/胴背長×100)、AWI (腕寬/胴背長×100)、HLI (頭長/胴背長×100)、HWI (頭寬/胴背長×100)和HcL% (莖化腕變形部分占比)。運(yùn)用SPSS 26.0 對標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。

主成分分析: 根據(jù)雌性19 個形態(tài)學(xué)指標(biāo)TW、VMLI、MWI、HWI、HLI、FWI、LFLI、RFLI、EDI、LALI4、RALI1、RALI2、RALI3、RALI4、LAWI1、RAWI1、RAWI2、RAWI3、RAWI4; 雄性比雌性多一個指標(biāo)(HcL%), 計算出主導(dǎo)雌性和雄性群體差異的互不關(guān)聯(lián)的主成分, 參照Brzeski 等(1988)的方法計算貢獻(xiàn)率和累計貢獻(xiàn)率。

判別分析: 采用逐步判別法對形態(tài)指標(biāo)(同主成分)進(jìn)行分析, 根據(jù)判別參數(shù)構(gòu)建判別函數(shù)。判別準(zhǔn)確率的計算公式參照高曉蕾等(2019):式中,Ai為第i個群體中判別正確的樣品數(shù),Bi為第i個群體中實測的樣品數(shù),k為群體。

聚類分析: 計算出雌性和雄性各群體形態(tài)指標(biāo)(同主成分)的平均值, 采用歐氏距離的最短系統(tǒng)聚類法構(gòu)建聚類圖進(jìn)行聚類分析。

單因素方差分析: 對所有指標(biāo)(同主成分)先進(jìn)行方差齊性檢驗, 對符合條件的指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析, 采用圖基HSD 法進(jìn)行事后檢驗(post hoc test)。

2 結(jié)果

2.1 角質(zhì)環(huán)形態(tài)比較

分布于中國沿海的 6 個群體的角質(zhì)環(huán)形態(tài)與Jereb 等(2010)的描述相符。雌性群體: 汕頭、東山和泰國灣群體的第三腕大吸盤角質(zhì)環(huán)具7 個寬板齒, 南麂島和寧波群體為6～8 個, 南通和陽江群體6～7 個,各群體觸腕穗角質(zhì)環(huán)齒數(shù)均在16～20 個之間(表2);雄性群體: 第三腕大吸盤角質(zhì)環(huán)全緣具齒, 南通、寧波、南麂島、東山、汕頭和陽江群體角質(zhì)環(huán)前端具8～10 個大寬板齒, 后端具3～5 個小板齒。泰國灣群體雄性第三腕角質(zhì)環(huán)具7 個寬板齒, 后端1/3 平滑, 雌性角質(zhì)環(huán)形態(tài)與其他6 個群體相似。所有群體的觸腕穗角質(zhì)環(huán)齒數(shù)范圍16～22 (表2, 圖1)。

圖1 杜氏槍魷7 個地理群體吸盤角質(zhì)環(huán)Fig.1 Sucker teeth of the seven geographic populations of U. duvaucelii

表2 杜氏槍魷7 個地理群體角質(zhì)環(huán)齒數(shù)信息Tab.2 The number of arm suckers of the seven geographic populations of U. duvaucelii

2.2 齒舌結(jié)構(gòu)觀察

泰國灣和陽江齒舌樣品的掃描電鏡結(jié)果見圖2。齒舌排列方式均為: 中央齒1 列, 由中央向兩側(cè)依次為第一側(cè)齒、第二側(cè)齒和第三側(cè)齒, 齒式3·1·3。齒舌形態(tài)特征的測量數(shù)據(jù)見表3。陽江樣品齒舌: 中央齒有3 個齒尖, 左右對稱, 高度為0.21～0.22 mm,寬度為高度的0.62～0.64, 兩側(cè)齒尖高度約為中央齒高的0.52～0.64; 第一側(cè)齒的形狀和中央齒相似, 比中央齒小, 高度約為中央齒的0.52～0.81; 第二側(cè)齒呈彎刀形, 由于其與第一和第三側(cè)齒連接太緊密,無法準(zhǔn)確測量其寬度和高度; 第三側(cè)齒也是彎刀形,寬度約為中央齒的0.52～0.59, 高度約是中央齒的兩倍。泰國灣樣品各齒與中央齒的占比與陽江樣品存在一定差異(表3): 中央齒高度在0.10～0.19 mm, 寬度為中央齒高度的0.63～1.00, 兩側(cè)齒尖高度約為中央齒高度的0.45～0.64; 第一側(cè)齒高度和中央齒相同;第二側(cè)齒呈彎刀形; 第三側(cè)齒寬度約為中央齒的0.58～0.64, 高度約是中央齒的2～3.5 倍。

表3 齒舌形態(tài)比較Tab.3 Comparison in morphology of radulae

圖2 杜氏槍魷齒舌電鏡觀察Fig.2 Radula of U. duvaucelii

2.3 主成分分析

雌性群體的KMO (Kaiser-Meyer-Olkin)和巴特利檢測(Bartlett)檢驗結(jié)果為0.634 和901.020 (P＜0.005),表明這19 個形態(tài)指標(biāo)可以進(jìn)行主成分分析(表4)。共構(gòu)建5 個主成分(特征值均大于1.0), 累積貢獻(xiàn)率為63.395%。主成分1 中影響群體形態(tài)差異的指標(biāo)為MWI、HcL%、RALI2、RALI3、RALI4、LAWI4、RAWI1、RAWI2、RAWI3 和RAWI4, 主成分2 中影響群體差異的指標(biāo)為TWI、FWI、LALI4 和RFLI, 主成分3 中影響群體差異的指標(biāo)為VMLI、HWI、HLI和RALI1, 主成分4 中影響群體差異的指標(biāo)為LFLI,主成分5 中影響群體差異的指標(biāo)為EDI。主成分1 和2 繪制的散點(diǎn)圖顯示泰國灣能與其他群體區(qū)分開來,而其他群體間存在較多重疊(圖3)。

圖3 杜氏槍魷7 個雌性地理群體主成分1、2 散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of the first and second principal components for principal component analysis of seven female populations of U. duvaucelii

雄性群體的 KMO 和巴特利檢測檢驗結(jié)果為0.698 和789.302 (P＜0.005), 表明這20 個形態(tài)指標(biāo)可以進(jìn)行主成分分析(表4)。共構(gòu)建5 個主成分(特征值均大于1.0), 累積貢獻(xiàn)率為67.591%。主成分1 中影響群體形態(tài)差異的指標(biāo)為 FWI、LALI4、RALI1、RALI2、RALI3、RALI4、LAWI4、RAWI1、RAWI2、RAWI3 和RAWI4, 主成分2 中影響群體差異的指標(biāo)為TW, 主成分3 中影響群體差異的指標(biāo)為VMLI、MWI、HWI 和HLI, 主成分4 中影響群體差異的指標(biāo)為LFLI 和RFLI, 主成分5 中影響群體差異的指標(biāo)為EDI?；谥鞒煞? 和2 繪制的散點(diǎn)圖顯示縱軸和橫軸所有群體均有重疊(圖4)。

圖4 杜氏槍魷雄性7 個地理群體主成分1、2 散點(diǎn)圖Fig.4 Scatter plot of the first and second principal components for principal component analysis of seven male populations of U. duvaucelii

表4 杜氏槍魷形態(tài)特征主成分的負(fù)荷值和貢獻(xiàn)率Tab.4 Contribution and load of principal components to morphological characteristics of U. duvaucelii

2.4 判別分析

采用逐步判別法分別對雌、雄群體進(jìn)行判別分析,建立費(fèi)希爾判別函數(shù)。雌性群體判別函數(shù):

寧波群體:Y2= -0.276X1+1.759X2+4.652X3-0.565X4+156.767X5-190.200

南麂島群體:Y3= -0.098X1+2.421X2+3.619X3+1.065X4+99.192X5-190.436

東山群體:Y4= -0.329X1+2.104X2+4.686X3-0.570X4+154.315X5-197.538

汕頭群體:Y5= -0.311X1+2.025X2+4.691X3-0.380X4+156.680X5-206.161

陽江群體:Y6=0.109X1+1.532X2+4.616X3-0.353X4+

153.744X5-198.697

泰國灣群體:Y7=-0.123X1+1.788X2+4.887X3-0.463X4+

150.934X5-205.114

判別函數(shù)中,X1為TW、X2為HWI、X3為RFLI、X4為FWI、X5為RALI1。

雄性群體判別函數(shù):

南通群體:Y1= 1.741X1+2.004X2+7.895X3-88.597

寧波群體:Y2= 2.083X1+0.824X2+7.810X3-48.995

南麂島群體:Y3= 1.762X1+1.696X2+5.891X3-63.808

東山群體:Y4= 1.469X1+1.864X2+5.805X3-65.988

汕頭群體:Y5= 1.360X1+1.671X2+5.841X3-56.897

陽江群體:Y6= 3.191X1+1.478X2+8.968X3-97.242

泰國灣群體:Y7=2.731X1+1.777X2+5.833X3-88.873

判別函數(shù)中,X1為 TW、X2為 LALI4、X3為LAWI4。

為驗證其有效性, 將所有樣品相對應(yīng)變量值分別代入判別函數(shù)中, 被判別樣品屬于最大函數(shù)值所對應(yīng)的群體(表5)。雌性群體綜合判別準(zhǔn)確率為58.7%,南麂島群體的判別準(zhǔn)確率最高, 為80.0%, 南通和泰國灣群體的判別準(zhǔn)確率較低, 分別為26.7%和25.0%(表5)。雄性群體的綜合判別準(zhǔn)確率為57.3%, 陽江群體的判別準(zhǔn)確率最高, 為93.8%, 南麂島群體的判別準(zhǔn)確率最低, 為23.5% (表5)。

表5 杜氏槍魷7 個地理群體判別分析結(jié)果Tab.5 Discriminant results of seven geographic populations of U. duvaucelii

2.5 聚類分析

雌、雄群體的聚類分析結(jié)果相似, 南通及陽江與泰國灣群體聚為一支, 寧波、南麂島、東山和寧波群體聚為一支。在雌性群體中, 東山和汕頭群體距離最近, 最先聚為一支, 然后再與南麂島和寧波群體聚合。雄性群體中, 寧波和汕頭群體先聚為一支, 然后再與東山和南麂島群體聚合。

2.6 單因素方差分析

雌性群體分析結(jié)果顯示, 東山和汕頭與南通、陽江和泰國灣群體之間的TW 存在顯著差異, 與寧波和南麂島群體差異不顯著, 其他形態(tài)指標(biāo)差異不顯著(表6)。雄性群體所有形態(tài)指標(biāo)差異均不顯著(表7)。

表6 杜氏槍魷雌性群體多性狀多重比較Tab.6 Multiple comparisons on multiple characters of different female populations of U. duvaucelii

表7 杜氏槍魷雄性群體多性狀多重比較Tab.7 Multiple comparisons on multiple characters of different male populations of U. duvaucelii

3 討論

多元統(tǒng)計分析方法具有適用范圍廣、分析精準(zhǔn)等特點(diǎn), 廣泛應(yīng)用于頭足類的物種鑒定及群體形態(tài)差異研究(Sinet al, 2009; Liaoet al, 2010; 高曉蕾等,2019; 霍莉莉等, 2021; 李嘉華等, 2022)。主成分分析能夠?qū)⒍鄠€測量數(shù)據(jù)降維、轉(zhuǎn)換為新的綜合指標(biāo), 分析結(jié)果可以反映群體間的主要形態(tài)差異(魏源博等,2021)。使用主成分分析法分析形態(tài)差異時, 累積貢獻(xiàn)率可以根據(jù)樣本容量的大小來調(diào)整(Vossetal,1990)。本研究中雌、雄群體的主成分累計貢獻(xiàn)率均較低, 這可能與該種類具有近海洄游的習(xí)性及群體間地理隔離不完全等因素有關(guān)。雌、雄群體的散點(diǎn)圖均顯示各群體間的形態(tài)差異較小(圖3, 圖4)。聚類分析和單因素方差均表明各群體的形態(tài)測量指標(biāo)無顯著差異。雌、雄群體的判別分析結(jié)果基本一致, 綜合判別準(zhǔn)確率均較低, 表明各群體的形態(tài)差異不顯著,判別分析不能根據(jù)形態(tài)差異做出準(zhǔn)確分析。此外, 南通雌性和雄性群體的判別率均較低, 這可能是由于

其獨(dú)特的地理位置導(dǎo)致的。南通地處長江入?？诒辈?易受到夏秋季長江沖淡水北支的影響, 中國臺灣暖流、黃海暖流和東海沿岸流分別沿海岸線流動, 水文條件復(fù)雜, 促進(jìn)了杜氏槍魷幼體和成體的擴(kuò)散, 增加了南通和其他群體間基因交流的概率(Wuetal, 2014;何利軍等, 2021)。

圖5 杜氏槍魷7 個地理群體聚類圖Fig.5 Diagram of cluster analysis of seven geographic populations of U. duvaucelii

槍魷吸盤上具角質(zhì)環(huán), 不同種類的角質(zhì)環(huán)上小齒的齒形和齒數(shù)存在差異, 性成熟個體小齒的形態(tài)和齒數(shù)較穩(wěn)定, 是分類鑒別的重要特征(董正之, 1988;盧重成等, 2017)。第三腕角質(zhì)環(huán)齒數(shù)在泰國灣雄性樣品(7 個)與其他群體樣品(11～15 個)間存在較大差異。采用掃描電鏡技術(shù)對泰國灣和陽江群體的齒舌進(jìn)行觀察和比較分析, 發(fā)現(xiàn)其齒舌的形態(tài)和大小也具有明顯差異(圖2, 表3)。泰國灣為半封閉水域, 位于太平洋最西端, 地理位置特殊, 不易受到表層海流以及沿岸流的影響, 特殊的環(huán)境因素和地理條件可能阻礙該地區(qū)杜氏槍魷群體與其他群體的基因交流, 使其在形態(tài)上向著獨(dú)立的方向進(jìn)化, 導(dǎo)致形態(tài)產(chǎn)生差異(李立, 2014)。其余6 個群體間形態(tài)特征無顯著差異, 可能是由于中國沿岸流(東海表層環(huán)流、東海沿岸流和南海表層流等)作用使得群體間能夠頻繁進(jìn)行基因交流, 無形態(tài)差異產(chǎn)生(Chao, 1990; Fangetal,2005; 何利軍等, 2021)。

4 結(jié)論

本研究基于形態(tài)學(xué)觀察和多元統(tǒng)計分析方法分析了南通、寧波、南麂島、東山、汕頭、陽江和泰國灣的杜氏槍魷群體的形態(tài)差異。結(jié)果表明, 泰國灣群體與其他6 個群體形態(tài)差異顯著, 主要差異在于雄性第三腕大吸盤角質(zhì)環(huán)齒數(shù)和齒舌形態(tài), 是否由環(huán)境因素還是遺傳變異導(dǎo)致的, 尚需深入研究。本研究為杜氏槍魷的分類鑒定和多樣性保護(hù)提供了形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)參考。

致謝 中國海洋大學(xué)漁業(yè)海洋學(xué)實驗室博士研究生郭建忠和碩士研究生李志新提供樣品, 中國海洋大學(xué)貝類遺傳育種研究室碩士研究生王麗華和黃俊杭協(xié)助實驗, 謹(jǐn)致謝忱。