向文娟，王孝雯，孫大文,*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.華南理工大學(xué)現(xiàn)代食品工程研究中心，廣東 廣州 510006；3.廣東省冷鏈?zhǔn)称分悄芨兄c過程控制工程技術(shù)研究中心，廣東省農(nóng)產(chǎn)品智能冷鏈物流設(shè)備工程實驗室，廣東 廣州 510006）

枸杞（Lycium barbarum）是一種頗負盛名的傳統(tǒng)藥食同源果實，富含枸杞多糖、多酚、類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。枸杞表皮脆弱，富含水分，因此極易遭受機械損傷和發(fā)生腐敗變質(zhì)[3]。枸杞在常溫下的貨架期為2～3 d，在最佳貯藏溫度0～1 ℃下能保存7～14 d，故市面上80%的枸杞以干果形式銷售。但在干制過程中，枸杞中的營養(yǎng)物質(zhì)會大量損失，枸杞鮮果特有的風(fēng)味會發(fā)生改變，并消耗能量。因此尋找一種有效的枸杞保鮮方法對于枸杞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分重要。氣調(diào)包裝（modified?atmosphere?packaging，MAP）通過調(diào)節(jié)初始氣體環(huán)境或自身呼吸作用改變氣體環(huán)境組分，有效抑制呼吸作用，從而實現(xiàn)果蔬保鮮，受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，已廣泛應(yīng)用于桃子、枇杷和綠蘆筍等果蔬[4-6]。雖然MAP能通過抑制呼吸作用降低植物機體生理生化反應(yīng)，減少內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)消耗，從而延長貯藏期。但研究發(fā)現(xiàn)，氣體環(huán)境中氧氣含量迅速降低會造成能量供應(yīng)不足，從而影響機體的氧化還原狀態(tài)，進而引起抗氧化物質(zhì)的高消耗，降低貯藏品質(zhì)[6]。水楊酸（salicylic acid，SA）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的植物激素，不僅能激活抗氰呼吸途徑來調(diào)節(jié)機體能量狀態(tài)，還能增加植物機體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量，提高抗氧化能力[7]。目前已有較多將SA應(yīng)用于漿果和蔬菜等采后貯藏，通過增強抗氧化能力來平衡機體的氧化還原狀態(tài)，從而維持果蔬較好品質(zhì)的研究[8-9]。因此，通過SA結(jié)合MAP有望實現(xiàn)降低果蔬呼吸作用的同時維持果蔬機體的高抗氧化能力，緩解氧氣含量迅速降低引起的果蔬機體氧化還原狀態(tài)失衡和氧脅迫。目前鮮有應(yīng)用SA結(jié)合MAP貯藏枸杞的報道。因此，本研究采用SA結(jié)合MAP貯藏枸杞，探究枸杞貯藏品質(zhì)變化，并利用主成分分析（principal?component?analysis，PCA）判斷不同指標(biāo)對枸杞貯藏品質(zhì)的貢獻和不同處理方法對枸杞貯藏穩(wěn)定性的影響，以期為該復(fù)合方法應(yīng)用于其他易腐食品保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟的寧夏枸杞（‘寧杞5號’，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20.0%～22.0%，紅色面積占比大于80%）采摘于寧夏中衛(wèi)，在冷鏈條件下（（4.0±3.0）℃）24 h內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇?，暫時貯藏在0～1 ℃、相對濕度（relative humidity，RH）（93.0±3.0）%的生化培養(yǎng)箱內(nèi)，并立即挑選分級進行后續(xù)實驗。

食品級聚丙烯氣調(diào)盒 溫州利強包裝機械有限公司；氣調(diào)保鮮膜（厚度30?μm、氧氣透過率24?mL/（m2gd）、水蒸氣透過率8.0?g/（m2gd）） 東莞畢瑪時奇妙包裝有限公司。

水楊酸（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；植物交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）試紙條德國默克公司；愈創(chuàng)木酚（生化試劑） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CheckMate 3離線氣體分析儀 丹麥Dansensor公司；氣調(diào)包裝機 佛山市速科機械有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；BSA224S分析天平賽多利斯（北京）科學(xué)儀器有限公司；SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；Tissuelyser-24多樣品組織研磨儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；DW-86L578S醫(yī)用低溫保存箱 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PAL-1便攜式數(shù)顯折射計 日本愛拓公司；FT-02手持硬度計 意大利TR公司；RQflex?20反射儀 德國默克公司；CR-400色差儀日本柯美尼卡達能公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將枸杞分為4 組，每組進行4 次平行實驗，每次平行實驗所用枸杞質(zhì)量為（32.0±2.0）g（約35 顆）。第1組為SA處理組（SA組），將枸杞在2.0?mmol/L SA中浸泡6?min；第2組為MAP處理組（MAP組），將枸杞在蒸餾水中浸泡6?min，包裝在氣調(diào)盒內(nèi)，盒內(nèi)初始空氣組成為21.0% O2、0.0% CO2和79.0% N2；第3組為復(fù)合處理組（SA＋MAP組），先將枸杞在2.0?mmol/L SA中浸泡6?min，再包裝在氣調(diào)盒內(nèi)，盒內(nèi)氣體比例與MAP組相同；第4組為對照組，將枸杞在蒸餾水中浸泡6?min。樣品處理好后，將4 組樣品同時貯藏在（7.0±0.5）℃、RH（93.0±3.0）%的生化培養(yǎng)箱中。從第0天起，每4 d隨機選取枸杞進行指標(biāo)測定，并將剩余枸杞用液氮速凍，磨粉后保存在－80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 腐敗指數(shù)測定

參考Shu Pan等[10]的方法測定腐敗指數(shù)。根據(jù)果實表面皺縮腐爛面積將腐敗分為6 個等級：0級代表果實飽滿無腐爛特征；1級表示果實輕微腐爛，皺縮腐爛面積比例0～20%；2級表示果實輕度腐爛，皺縮腐爛面積比例20%～40%；3級表示果實中度腐爛，皺縮腐爛面積40%～60%；4級表示果實重度腐爛，皺縮腐爛面積60%～80%；5級表示果實完全腐爛，皺縮腐爛面積大于80%。按公式（1）計算腐敗指數(shù)。

1.3.3 呼吸速率測定

參考Wang等[11]的方法測定呼吸速率。將枸杞封閉在不透氣袋內(nèi)，在（7.0±0.5）℃黑暗條件下放置3 h，測定袋內(nèi)O2和CO2體積分?jǐn)?shù)變化。呼吸速率按公式（2）計算。

式中：m為袋內(nèi)枸杞質(zhì)量/kg；t為呼吸時間/h；n為袋內(nèi)空氣的物質(zhì)的量/mol；P0為初始O2體積分?jǐn)?shù)/%；Pt為結(jié)束時O2體積分?jǐn)?shù)/%。

1.3.4 質(zhì)量損失率測定

采用稱量法[12]測定質(zhì)量損失率，分別測定枸杞貯藏前（m0/g）和貯藏后（m1/g）的質(zhì)量，按公式（3）計算質(zhì)量損失率。

1.3.5 顏色測定

選擇每個果實中部3 個不同的點測定顏色，記錄亮度L*值、紅綠度a*值、黃藍度b*值，并按公式（4）、（5）分別計算色調(diào)角h和總色差ΔE。

1.3.6 硬度測定

采用FT-02手持硬度計測定果實硬度，探針直徑為6?mm，深度為5?mm。

1.3.7 可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

將枸杞擠壓成汁，用PAL-1便攜式數(shù)顯折射計測定可溶性固形物（total soluble solids，TSS）質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.8 抗壞血酸含量測定

取0.300?g枸杞粉末，加入1?mL?2.5?g/100?mL的偏磷酸溶液，充分混勻，在4 ℃下以5 521hg離心3?min，取上清液，用RQflex?20反射儀測定抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）含量。AsA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝1.089 4x－12.169（R2＝0.998 6）。

1.3.9 丙二醛含量測定

參照耿藝[13]的方法測定丙二醛含量。

1.3.10 過氧化物酶活力測定

參考劉萍等[14]的方法，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活力。稱取0.500?g枸杞粉末，加入1.0?mL?0.05?mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液，充分混勻，4 ℃、5 521hg離心25?min，上清液即為待測酶液。以緩沖液作參比調(diào)零，470?nm波長處測定酶液吸光度，每1?min記錄1 次數(shù)據(jù)，記錄4?min。以每克鮮組織每分鐘470?nm波長處吸光度變化0.01為1 個POD活力單位（U），根據(jù)公式（5）計算POD活力。

式中：ΔA470?nm為470?nm波長處反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；Vt為提取酶液總體積/mL；m為枸杞粉末質(zhì)量/g；Vs為測定時所用酶液體積/mL；t為反應(yīng)時間/min。

1.3.11 交替氧化酶活力測定

AOX活力測定采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定[15]，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 25.0軟件進行結(jié)果計算與分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用t檢驗對結(jié)果進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，用Graphpad?Prism?9.0軟件繪圖。采用SPSS 25.0軟件進行主成分分析，采用Kaiser-Meyer-Olkin（KMO）檢驗和Bartlett’s檢驗判斷數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)合理性，并用Origin?8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸結(jié)合氣調(diào)包裝對枸杞貯藏品質(zhì)的影響

2.1.1 對物理指標(biāo)的影響

質(zhì)量損失率、硬度、腐敗指數(shù)和顏色是判斷枸杞貯藏品質(zhì)變化最重要的指標(biāo)。由圖1A、B可知，貯藏期內(nèi)，4 組枸杞的質(zhì)量損失率和腐敗指數(shù)均呈上升趨勢，對照組和SA組枸杞的質(zhì)量損失率和腐敗指數(shù)顯著高于MAP組和SA＋MAP組枸杞（P＜0.05）。表明MAP更能有效控制枸杞質(zhì)量損失和腐敗，SA作用較微弱，可能是由于控制氣體濃度能有效抑制呼吸作用與微生物生長，同時MAP膜能減少水分耗散，而SA作為脅迫應(yīng)激激素在空氣狀態(tài)下對呼吸作用的抑制作用不顯著[16]。由圖1C可知，貯藏期內(nèi)4 組枸杞硬度呈下降趨勢，表明隨貯藏期延長，果實軟化加劇。但MAP組和SA＋MAP組枸杞具有更高的硬度，表明MAP能有效緩解果實軟化，這可能與MAP能有效控制呼吸作用，減緩枸杞體內(nèi)生化反應(yīng)活動，進而延緩果實成熟與營養(yǎng)物質(zhì)降解等相關(guān)，與Castellanos等[16]的研究結(jié)果相符。貯藏第28天時，對照組與SA組硬度出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），說明SA能有效緩解貯藏后期果實軟化，可能與SA能延緩采后生理生化反應(yīng)、抑制相關(guān)酶活性，從而減少纖維素和果膠等降解相關(guān)[17]。

圖1 不同處理對枸杞貯藏期間質(zhì)量損失率（A）、腐敗指數(shù)（B）和硬度（C）的影響Fig. 1 Effect of SA and/or MAP on mass loss (A), decay index (B) and firmness (C) of goji berries during storage

由表1可知，各組枸杞L*、a*、b*值和h貯藏期間呈下降趨勢，ΔE呈上升趨勢，表明各組枸杞均出現(xiàn)顏色劣變。貯藏28 d時，SA＋MAP組ΔE為7.0±1.4，SA組為14.4±2.4，MAP組為15.1±0.5，對照組為18.2±2.7，SA＋MAP組ΔE低于其他3 個組，SA組和MAP組低于對照組，表明SA和MAP對維持顏色均有效。這可能是因為SA和MAP均能延緩采后生理生化反應(yīng)，減少枸杞體內(nèi)的類胡蘿卜色素的降解，且能激活抗氧化酶活性[16-17]，但SA＋MAP處理對維持顏色效果最好，表明SA和MAP對于維持新鮮色澤有協(xié)同作用。由圖2可知，貯藏28 d后，SA＋MAP組枸杞果形飽滿，腐敗情況更輕微，顏色更鮮亮，表明復(fù)合處理對于枸杞外觀保持的效果最佳，與表1結(jié)果一致。

圖2 不同處理組枸杞貯藏28 d外觀圖Fig. 2 Effect of SA and/or MAP on apperance of goji beries stored for 28 days

2.1.2 對代謝產(chǎn)物的影響

果蔬的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)與果實成熟狀況[18]和水分含量有關(guān)。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，含量越低表示組織受氧化損傷程度越小[19]。AsA是機體抗氧化體系的主要成分，含量越高，表明抗氧化能力越強[6]。由圖3A、B可知，貯藏28 d時，4 組枸杞中TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)和MDA含量由高到低依次為對照組＞SA組＞MAP組＞SA＋MAP組（P＜0.05），表明SA和MAP能抑制枸杞成熟和氧化損傷，且復(fù)合處理效果最佳。這與Belay[20]、Giménez[21]等報道的SA和MAP能延緩果實成熟的結(jié)論相符，也驗證了Ge?Wanying等[22]研究發(fā)現(xiàn)SA能抑制MDA生成的結(jié)論。由于貯藏過程中，與MAP組相比，SA組的質(zhì)量損失率更高，水分損失更嚴(yán)重，而TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)更低，說明SA抑制TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升主要是通過延緩枸杞果實成熟，而不是通過減少水分散失。

由圖3C可知，MAP組和SA＋MAP組AsA含量顯著低于對照組和SA組（P＜0.05），表明低氧環(huán)境促進枸杞中的AsA消耗，這與6% O2MAP貯藏下綠蘆筍中AsA含量迅速降低的研究結(jié)果[6]相符合。貯藏前8 d，SA組和SA＋MAP組AsA含量分別顯著高于對照組和MAP組，表明采后施用SA能有效降低AsA的氧化損失，維持較好的貯藏品質(zhì)。貯藏前20 d，MAP組MDA含量高于SA組，與AsA含量結(jié)果共同證明低氧（MAP處理）不利于維持細胞完整性和抗氧化能力，與Yang?Mingyi等[23]的研究結(jié)果一致。

圖3 枸杞貯藏期間TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、MDA含量（B）和AsA含量（C）的變化Fig. 3 Effect of SA and/or MAP on TSS (A), MDA (B) and AsA (C)contents of goji berries during storage

2.1.3 對生理活動的影響

由圖4A、B可知，SA＋MAP組O2消耗量和CO2生成量低于MAP組，表明SA能延緩枸杞的呼吸高峰，減少呼吸過程中的氧消耗；但是SA＋MAP組呼吸速率低于MAP組（圖4C），說明SA激活了抗氰呼吸途徑。有研究表明，抗氰呼吸可以提高果蔬的抗氧化能力，降低組織氧化損傷程度[8,24]，這可能是引起SA＋MAP組枸杞中AsA含量更高、MDA含量更低的原因。由圖4C可知，從貯藏第4天起，MAP組和SA＋MAP組呼吸速率即顯著低于對照組和SA組（P＜0.05），從第16天起，SA＋MAP組枸杞的呼吸速率顯著低于MAP組（P＜0.05），是因為降低氧氣濃度能迅速有效抑制呼吸速率[25]，且SA在低氧條件下對呼吸速率的抑制作用效果更好[26]。

圖4 不同處理對枸杞貯藏期間氣體成分和呼吸速率的影響Fig. 4 Effect of SA and/or MAP on gas composition inside package and respiration rate of goji berries during storage

POD是引起機體顏色和風(fēng)味劣變的主要酶類之一[27]。AOX是植物體內(nèi)參與能量代謝、氧化反應(yīng)和防御反應(yīng)的重要酶類，AOX活力提高代表植物體抵御外界不利條件的能力增強[28-29]。由圖5可知，與對照組相比，SA、MAP和SA＋MAP組中POD活力上升的時間點往后推移，AOX的活力升高，表明SA、MAP和復(fù)合處理能增強機體抵御外界不利條件的能力，延緩貯藏期間枸杞的衰老腐敗，與果實外觀指標(biāo)和代謝產(chǎn)物變化情況相符。與對照組相比，在貯藏前8 d，SA組AOX活力較高，之后迅速降低，表明SA能夠在貯藏前期激活A(yù)OX活力，維持機體能量供應(yīng)，提高機體抵御貯藏環(huán)境的能力，這與SA組相比對照組前8 d質(zhì)量損失率、MDA含量增加、AsA含量降低程度更小等結(jié)果相符。但在貯藏后期，AOX活力開始下降，這可能是因為隨著貯藏時間的延長，枸杞體內(nèi)的氧化物含量不斷增多，氧化脅迫增加，對AOX活力抑制作用增強[28-29]。而SA＋MAP組AOX活力始終保持在較高水平，表明復(fù)合處理能有效維持高活力AOX，有利于抵御不利條件，維持枸杞貯藏品質(zhì)。

圖5 枸杞貯藏期間POD活力（A）和AOX活力（B）變化Fig. 5 Effect of SA and/or MAP on peroxidase (A) and AOX (B)activities of goji berries during storage

2.2 PCA結(jié)果

為了綜合分析物理指標(biāo)、內(nèi)部代謝產(chǎn)物和生理活動變化與枸杞貯藏品質(zhì)的關(guān)系，引入PCA可視化與量化不同指標(biāo)對于枸杞貯藏品質(zhì)的貢獻[30]。KMO值為0.623（大于0.6），Bartlett’s檢驗P＜0.001，表明PCA適用于本實驗。如圖6所示，提取特征值大于1的主成分（principal component，PC），共提取了3 個PC，累計貢獻率占總方差89.78%，表明這3 個PC能解釋89.78%的總信息[31-32]，其中PC1占48.34%，較能反映貯藏期枸杞品質(zhì)情況。

為了清晰地看出不同指標(biāo)在不同PC下的表現(xiàn)，將圖6拆分為圖7A～C。PC1正相關(guān)于質(zhì)量損失率、TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA含量、腐敗指數(shù)和ΔE，負相關(guān)于硬度和AOX活力。PC2正相關(guān)于a*值和b*值，負相關(guān)于POD活力。PC3正相關(guān)于呼吸速率和AsA含量。表明質(zhì)量損失率、TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA含量、硬度、AOX活力、腐敗指數(shù)和顏色等指標(biāo)能較好反映枸杞貯藏期品質(zhì)變化，因此，今后枸杞采后保鮮中可利用這些指標(biāo)快速監(jiān)測枸杞品質(zhì)變化和簡化檢測程序。

圖6 枸杞貯藏過程中不同指標(biāo)主成分載荷圖Fig. 6 Three-dimensional loading plot of principal component (PC) 1 versus PC2 versus PC3 for quality variables of stored goji berries

圖7 枸杞貯藏過程中不同指標(biāo)主成分投影圖Fig. 7 Loading plots of different principal components

PCA不僅能可視化和量化不同指標(biāo)對枸杞貯藏品質(zhì)的貢獻，還能反映不同處理下枸杞貯藏品質(zhì)的穩(wěn)定性。在PCA得分圖中，數(shù)據(jù)落點越接近，表示其具有更接近的綜合品質(zhì)[31]。如圖8所示，第28天時，4種處理的枸杞被分為了4 個大類，表明不同處理的枸杞經(jīng)過貯藏后品質(zhì)差異較大。其中SA＋MAP組離新鮮樣品最接近，表明SA＋MAP組枸杞品質(zhì)穩(wěn)定性最好，特別是質(zhì)量損失率、TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA含量、硬度、AOX活力、腐敗指數(shù)和顏色在貯藏過程中變化最小。這證明復(fù)合處理從內(nèi)部生理活動調(diào)節(jié)，到代謝產(chǎn)物，再到外部物理指標(biāo)方面均能將枸杞保持在更接近新鮮枸杞的狀態(tài)。

圖8 不同處理枸杞PCA圖Fig. 8 Three-dimensional score plot of PC1 versus PC2 versus PC3

3 結(jié) 論

在枸杞貯藏過程中，MAP對抑制質(zhì)量損失、腐敗及維持硬度效果明顯，SA對維持低水平MDA及高水平AsA、AOX活力和顏色效果好，SA＋MAP能綜合二者優(yōu)勢，更好地保持枸杞貯藏品質(zhì)。SA＋MAP能提高枸杞內(nèi)部AOX活力，抑制呼吸速率的同時減少AsA損失和MDA生成，延緩果實成熟，從而維持較低的質(zhì)量損失率、腐敗指數(shù)和較高的硬度與較好的顏色，呈現(xiàn)更好的貯藏品質(zhì)。PCA結(jié)果表明，質(zhì)量損失率、TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA含量、硬度、AOX活力、腐敗指數(shù)和顏色等指標(biāo)能較好地反映枸杞貯藏期品質(zhì)變化，本實驗可為今后枸杞貯藏保鮮品質(zhì)監(jiān)測和檢測流程簡化提供方向。