胡文斌 劉瓊 張少飛 楊文

摘要：為給半夏組織培養(yǎng)和工廠化育苗體系的建立提供參考，以半夏葉柄為外植體，研究了不同消毒措施以及不同濃度激素對(duì)誘導(dǎo)外植體一次性成苗的影響。結(jié)果顯示，以75%乙醇消毒30 s，再用0.1%HgCl溶液消毒6 min的滅菌效果最好；最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

關(guān)鍵詞：半夏；組織培養(yǎng)；快繁

中圖分類號(hào)：S567.239 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2097-2172（2022）02-0194-03

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2022.02.019

Study on One-step Plantlet Formation of Pinellia ternate by

Petiole Tissue Culture

HU Wenbin， LIU Qiong， ZHANG Shaofei， YANG Wen

（Longnan Teachers College， Chengxian Gansu 742500， China）

Abstract： In order to provide reference for the establishment of tissue culture system and factory seedling system of Pinellia ternate， the petiole of Pinellia ternate was used as explants to study the effects of different disinfection measures and different concentrations of hormones on inducing one-step plantlet formation. The results showed that the best sterilization measure was to sterilize with 75% ethanol for 30 s， and then sterilize with 0.1% HgCl solution for 6 min; The best induction medium was MS + sucrose 30 g/L + agar 8 g/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L.

Key words： ?Pinellia ternate; Tissue culture; Rapid propagation

半夏（Pinelliaternata）為天南星科（Araceae）多年生草本藥用植物。作為我國(guó)珍貴藥材之一，半夏不僅具有去痛、降壓、抗腫瘤、抗早孕的作用，也具有鎮(zhèn)咳祛痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效［1 ］。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求的持續(xù)增長(zhǎng)，野生半夏資源不斷減少，種源缺乏、土壤退化以及病蟲(chóng)害等因素，已成為制約半夏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸［2 ］。隨著科技的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)也得到了迅速發(fā)展，已在多種珍稀植物上得以應(yīng)用，其中關(guān)于一步成苗技術(shù)的研究也越來(lái)越多。一步成苗是將外植體接種到培養(yǎng)基上直接形成完整植株的過(guò)程，從而有效減少組織培養(yǎng)過(guò)程的步驟，具有再生周期短、易操作、節(jié)約人力物力財(cái)力等優(yōu)勢(shì)，以及廣闊的發(fā)展前景［3 ］?；诖?，我們以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物激素6-BA和NAA，對(duì)半夏葉柄進(jìn)行組織培養(yǎng)，一次性誘導(dǎo)無(wú)菌芽苗，以期為半夏組織培養(yǎng)和工廠化育苗體系的建立提供參考。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

試驗(yàn)材料為野生半夏，取葉柄備用。主要儀器為超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱及培養(yǎng)架等。試劑為6-卞氨基嘌呤（6-BA），萘乙酸（NAA）。

1.2 ? 方法

1.2.1 ? ?培養(yǎng)基配制 ? ?基本培養(yǎng)基為MS，含蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L，配制好后用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.0左右，分裝于容量100 mL的三角瓶中，每瓶20～35 mL。用棉塞封口后置于高壓鍋滅菌，壓力1.1 kg/cm2，121 ℃下滅菌20 min［4 - 5 ］。

1.2.2 ? ?外植體消毒 ? ?將半夏植株用棉花蘸自來(lái)水清洗干凈后流水沖洗過(guò)夜。在超凈工作臺(tái)上將葉柄剪成長(zhǎng)2 cm左右的片段，用75%乙醇分別消毒15、30、60 s，無(wú)菌水沖洗2～3次。再用0.1%HgCl溶液消毒，消毒時(shí)間設(shè)4、6、8 min（240、360、480 s）（表1），用無(wú)菌水沖洗5次。消毒后將外植體接種于MS基本培養(yǎng)基上，接種完成后置于光照培養(yǎng)架上進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2 000～3 000 Lx，光照周期12 h/d，培養(yǎng)室溫度保持（25±2）℃。20 d后統(tǒng)計(jì)外植體的污染率及成活率，統(tǒng)計(jì)分析乙醇及HgCl溶液的最佳消毒時(shí)間［3， 6 ］。

1.2.3 ? ?接種及成苗培養(yǎng) ? ?依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)篩選的消毒方法對(duì)外植體進(jìn)行消毒，消毒完成后將外植體接種于附加不同濃度激素的MS培養(yǎng)基（表2），研究激素配比對(duì)外植體誘導(dǎo)的影響。接種后于不同時(shí)間段觀察并統(tǒng)計(jì)芽的分化及生長(zhǎng)狀況，60 d后統(tǒng)計(jì)每瓶出芽數(shù)，計(jì)算不定芽增殖系數(shù)，以確定植物激素的最適添加量［3， 7 - 8 ］。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 外植體最佳消毒時(shí)間的確定

由表1可知，乙醇消毒30 s處理的成活率最高，為90%；消毒60 s處理的污染率最低，但由于消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致外植體表面發(fā)黑，降低了成活率。HgCl溶液消毒360 s處理的成活率最高，達(dá)90%；480 s處理的污染率雖然最低，但生長(zhǎng)狀態(tài)并不佳，可能是由于過(guò)長(zhǎng)的消毒時(shí)間導(dǎo)致外植體表面被破壞，進(jìn)而影響了其生長(zhǎng)狀態(tài)。由此可見(jiàn)，半夏外植體的最佳消毒時(shí)間以75%乙醇消毒30 s，0.1%的HgCl溶液消毒6 min為宜。

2.2 ? 不同培養(yǎng)基對(duì)半夏葉柄叢生芽的誘導(dǎo)

由表2可知，當(dāng)6-BA濃度為1.0、1.5 mg/L時(shí)，隨著NAA 濃度的增高，平均出芽數(shù)呈先增加后減少趨勢(shì)，NAA的最適濃度可設(shè)定為0.2 mg/L；當(dāng)NAA 濃度不變時(shí)，隨著6-BA 濃度增高，平均出芽數(shù)也呈先增加后減少趨勢(shì)，因此6-BA的最適濃度可設(shè)定為1.0 mg/L。處理5平均出芽數(shù)最多，且不定芽的增殖系數(shù)也最大。

對(duì)每瓶平均出芽數(shù)進(jìn)行雙因素方差分析，通過(guò)主體間效應(yīng)檢驗(yàn)（表3），發(fā)現(xiàn)6-BA和NAA 之間存在交互效應(yīng)，可能是由于NAA在促進(jìn)生根的同時(shí)也在促進(jìn)細(xì)胞分裂。

對(duì)不同濃度6-BA誘導(dǎo)下半夏叢生芽出芽數(shù)進(jìn)行多重比較可以看出（表4），當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，與濃度為0.5、1.5 mg/L的出芽數(shù)均有顯著差異（P < 0.05），而6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)的出芽數(shù)與濃度為1.5 mg/L時(shí)的出芽數(shù)沒(méi)有顯著差異（P > 0.05）。

同樣，對(duì)不同濃度NAA誘導(dǎo)下半夏叢生芽出芽數(shù)進(jìn)行多重比較可以看出（表5），當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，與濃度為0.1 、0.5 mg/L的出芽數(shù)均有顯著差異（P < 0.05），而當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)的出芽數(shù)與濃度為0.5 mg/L時(shí)的出芽數(shù)沒(méi)有顯著差異（P ?> 0.05）。

綜上可知，試驗(yàn)條件下，半夏葉柄誘導(dǎo)不定芽分化最適激素濃度為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

2.3 ? 半夏葉柄組織培養(yǎng)不定芽的誘導(dǎo)與植株再生進(jìn)程

接種7ｄ，半夏葉柄兩端慢慢膨大；接種15ｄ，出現(xiàn)淡黃色愈傷組織；接種30ｄ，愈傷組織慢慢分化，長(zhǎng)出不定芽；接種60ｄ，不定芽繼續(xù)增殖，而早前分化的不定芽已在基部生出不定根（圖1）。芽苗長(zhǎng)至5 cm左右時(shí)即可將芽苗分離，然后進(jìn)行煉苗及移栽。

3 ? 討論與結(jié)論

植物激素是影響愈傷組織誘導(dǎo)和器官分化的主要因子，是植物形態(tài)調(diào)控及建成的主要影響因素［8 ］。半夏組織培養(yǎng)可以選用塊莖、珠芽、莖尖、根、葉片和葉柄等作為外植體［9 - 10 ］。塊莖、珠芽、莖尖及根誘導(dǎo)的芽苗數(shù)量太少，葉片誘導(dǎo)的芽苗雖然繁殖系數(shù)最高，但誘導(dǎo)周期過(guò)長(zhǎng)；葉柄誘導(dǎo)芽苗數(shù)量多，周期也比葉片短［11 ］，是半夏組織培養(yǎng)理想的外植體材料。

本研究以半夏葉柄為外植體，研究了不同消毒措施以及不同濃度激素對(duì)誘導(dǎo)外植體一次性成苗的影響。結(jié)果顯示，外植體消毒方法以75%乙醇消毒30 s，用0.1%的HgCl溶液消毒6 min為宜。最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。對(duì)于組培苗煉苗、移栽的條件仍需進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2022 - 05 - 20

基金項(xiàng)目：隴南市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020-ZD-10）；甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2021B-367）。

作者簡(jiǎn)介：胡文斌（1984 — ），男，甘肅成縣人，講師，碩士，主要從事植物組織培養(yǎng)方面的教學(xué)與研究工作。Email： hwbcl195927@163.com。