吳 鵬，姬振偉，王志學(xué)，馮重陽(yáng)

骨質(zhì)疏松癥是一種慢性全身性骨骼代謝疾病，主要表現(xiàn)為骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化和破壞，骨脆性增加，易導(dǎo)致骨折。其病因是成骨細(xì)胞的活性小于破骨細(xì)胞，在老年和絕經(jīng)后的女性中更易發(fā)。骨質(zhì)疏松癥的防治一般包括促進(jìn)骨礦化和骨形成，抑制骨吸收，但這些治療方法都存在一定不良反應(yīng)或并發(fā)癥。破骨細(xì)胞是一種源自單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞譜系的多核細(xì)胞，在破骨細(xì)胞形成的過(guò)程中，許多轉(zhuǎn)錄因子正向或者負(fù)向調(diào)控破骨細(xì)胞的增殖和分化。miRNAs是一組約22個(gè)核苷酸的非編碼調(diào)控RNA分子，在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮多種調(diào)控功能。骨質(zhì)疏松是由于成骨細(xì)胞功能活性降低，破骨細(xì)胞功能活性升高，使骨形成和骨吸收失去平衡導(dǎo)致凈骨量丟失。miR-214-5p是一種高度保守的非編碼RNA，在骨肉瘤形成中發(fā)揮重要作用，抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten,PTEN)是一種不同尋常的磷酸酶，在胚胎發(fā)育過(guò)程中非常重要。相關(guān)研究表明，敲除PTEN促進(jìn)了生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分化，導(dǎo)致突變體顱骨厚度明顯增加。也有研究表明，PTEN在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生命周期和揭示胚系PTEN基因突變所導(dǎo)致的骨骼發(fā)育異常中具有重要作用。目前，已有相關(guān)研究探討了關(guān)于miR-130a靶向調(diào)節(jié)PTEN基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞多柔比星敏感性的影響，但關(guān)于miR-214-5p通過(guò)PTEN的表達(dá)對(duì)破骨分化和骨質(zhì)疏松的影響的報(bào)道較少。本研究重點(diǎn)挖掘PTEN調(diào)控的上游分子，試圖描述miR-214-5p和PTEN在骨質(zhì)疏松癥中的調(diào)控作用，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的方向。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2019-03至2020-05在空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院外科進(jìn)行脊柱手術(shù)且大于50歲的絕經(jīng)女性為研究對(duì)象，按照臨床骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為骨質(zhì)疏松的患者20例作為骨質(zhì)疏松組，同時(shí)選取非骨質(zhì)疏松癥患者20例為對(duì)照組。骨質(zhì)疏松組平均(60.24±6.73)歲,對(duì)照組平均(61.59±5.81)歲,兩組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過(guò)倫理委員會(huì)審批，并經(jīng)過(guò)患者知情確認(rèn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和破骨細(xì)胞分化 從中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)Raw264.7單核巨噬細(xì)胞，添加10%胎牛血清100 U/ml和青霉素100 mg/ml，加入50 μg/L的M-CSF、1α和100 μg/L的核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand ,RANKL), 置于37 ℃ 5% 的CO中培養(yǎng)，12 d后倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，直到成熟的破骨細(xì)胞形成。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 經(jīng)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞以5×10/ml接種于6孔板中，添加DMEM培養(yǎng)液過(guò)夜培養(yǎng)，24 h后，去除培養(yǎng)液，根據(jù)脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染使用說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-214-5pmimics(miR-214-5pmimics組)、miR-214-5p空質(zhì)粒(miR-214-5pvector組)、shZFAS1載體(sh PTEN組)、shZFAS1空載體(shvector組)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞采用1.2.1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄熒光定量 PCR(reversetranscription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)檢測(cè)用注射器抽取術(shù)中患者骨髓血15 ml放入離心管中，加入Ficoll分離液，離心45 min，室溫1200 r/min,離心半徑9 cm，采用Ficoll液密度梯度離心法分離獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，在采用RT-qPCR 檢測(cè)骨質(zhì)疏松患者和非骨質(zhì)疏松癥患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的miR-214-5p和PTEN mRNA水平，同時(shí)檢測(cè)經(jīng)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞中NFaTc1、MMP9、TRAP、CTSK的mRNA水平，首先采用TRIZOL法從細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，利用miR-214-5p、PTEN和GAPDH引物在應(yīng)用生物系統(tǒng)7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)條件92 ℃，預(yù)變性30 min;72 ℃變性 50 s，60 ℃ 退火 20 s，52 ℃ 延伸15 s，共設(shè)置45個(gè)循環(huán)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistnt acid phosphatase,TRAP) 細(xì)胞去掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入2.5%的戊二醛固定液固定10 min，預(yù)熱處理，在37 ℃孵育60 min，PBS沖洗，TRAP染色陽(yáng)性顆粒為酒紅色，采用倒置相差顯微鏡觀察TRAP染色陽(yáng)性顆粒的分布情況，并計(jì)算TRAP染色的陽(yáng)性率。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot) RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移PVDF膜上。脫脂奶粉封閉膜30 min，在4 ℃孵育一抗PTEN、NFATc1、AKT和PI3K和GADPH，TBST洗滌，添加二抗室溫孵育60 min，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過(guò)網(wǎng)址為http://www.targetscan.org/vert_71/ 的Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-214-5p在PTEN mRNA的3′-UTR處的結(jié)合的位點(diǎn)。采用PCR技術(shù)從基因組擴(kuò)增與miR-214-5p結(jié)合的PTEN-WT或者PTEN-MUT的3′-UTR序列，克隆到pGL-3熒光素酶報(bào)告載體中，將熒光素酶報(bào)告載體與miR-214-5p mimics和對(duì)照組共轉(zhuǎn)染到破骨細(xì)胞中，48 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試盒檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 miR-214-5p和PTEN的表達(dá)RT-qPCR 檢測(cè)骨質(zhì)疏松組和對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-214-5p和PTEN的表達(dá)，骨質(zhì)疏松組miR-214-5p水平的表達(dá)(2.96±0.32)高于對(duì)照組(0.78±0.06)，PTEN的表達(dá)(0.69±0.08)低于對(duì)照組(1.79±0.25)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-214-5p對(duì)破骨分化的影響 通過(guò)TRAP染色結(jié)果顯示，對(duì)照組、miR-214-5p vector組和miR-214-5p inhibitor組TRAP表達(dá)陽(yáng)性率為(4.19±0.73)%、(4.62±0.72)%和(29.18±5.24)%，miR-214-5pinhibitor組破骨細(xì)胞較對(duì)照組和miR-214-5p vector組相比，體積形成較大，且miR-214-5p inhibitor組中TRAP表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組和miR-214-5p vector組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.001，圖1)。

圖1 過(guò)表達(dá)miR-214-5p對(duì)破骨分化的影響(TRAP，100×)

2.3 沉默PTENP對(duì)破骨分化的影響 通過(guò)TRAP染色結(jié)果顯示，對(duì)照組、sh vector組和sh PTEN組TRAP表達(dá)陽(yáng)性率為(3.94±0.69)%、(4.02±0.70)%和(26.81±4.98)%，sh PTEN組破骨細(xì)胞較對(duì)照組和sh vector組體積形成較大較多，且sh PTEN組中TRAP表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組和sh vector組(<0.001，圖2)。

圖2 沉默PTENP對(duì)破骨分化的影響(TRAP，100×)

2.4 過(guò)表達(dá)miR-214-5p對(duì)破骨分化相關(guān)基因的表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，對(duì)照組NFaTc1 、MMP9、TRAP和CTSK水平與miR-214-5p vector組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, miR-214-5p mimics組中的NFaTc1 、MMP9、TRAP和CTSK水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表1)。

表1 過(guò)表達(dá)miR-214-5p各組破骨分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)

2.5 沉默PTEN對(duì)破骨分化相關(guān)基因的表達(dá) 通過(guò)RT-qPCR法檢測(cè)破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)照組NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK水平與sh vector組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, sh PTEN組中的NFaTc1 、MMP9、TRAP和CTSK水平顯著高于對(duì)照組(<0.05，表2)。

表2 沉默PTEN各組破骨分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)

2.6 過(guò)表達(dá)miR-214-5p對(duì)破骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組NFATc1、AKT和PI3K蛋白表達(dá)與miR-214-5p vector組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-214-5p mimics組NFATc1、AKT和PI3K蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(<0.05，圖3)。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-214-5p對(duì)RAW 264.7細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7 沉默PTEN對(duì)破骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組NFATc1、AKT和PI3K蛋白表達(dá)與sh vector組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，shPTEN組NFATc1、AKT和PI3K蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(<0.05，圖4)。

圖4 沉默PTENP過(guò)表達(dá)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.8 miR-214-5p和PTEN靶向關(guān)系 通過(guò)TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-214-5p潛在的靶基因，發(fā)現(xiàn)PTEN的3’-UTR區(qū)域與miR-214-5p具有靶向結(jié)合的位點(diǎn)。通過(guò)熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-214-5p降低了PTEN-WT基因的熒光素酶活性(<0.05，圖5)，但是過(guò)表達(dá)miR-214-5p對(duì)PTEN-MUT的熒光素酶活性沒(méi)有變化(>0.05)。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-214-5p與PTEN的生物信息學(xué)分析

2.9 過(guò)表達(dá)miR-214-5p表達(dá)對(duì)PTEN的影響 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組PTEN蛋白表達(dá)與miR-214-5p vector組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-214-5pmimics組的PTEN蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，圖6)。

圖6 過(guò)表達(dá)miR-214-5p表達(dá)對(duì)PTEN的影響

2.10 過(guò)表達(dá)miR-214-5p抑制PTEN對(duì)破骨分化的影響 挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-214-5p空載組、miR-214-5p mimics組、miR-214-5p mimics+PTEN空載組、miR-214-5p mimics+PTEN組中TRAP表達(dá)陽(yáng)性率分別為(3.87±0.65)%、(27.31±4.96)%、(28.62±5.03)%和(11.53±2.98)%，與miR-214-5p空載組相比，miR-214-5pmimics組、miR-214-5pmimics+PTEN空載組中TRAP表達(dá)陽(yáng)性率明顯升高(<0.05)；miR-214-5p mimics組和miR-214-5pmimics+PTEN空載組中TRAP表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與miR-214-5p mimics組相比，miR-214-5pmimics+PTEN組中TRAP表達(dá)陽(yáng)性率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，圖7)。

圖7 過(guò)表達(dá)miR-214-5p抑制PTEN對(duì)破骨分化的影響(TRAP，100×)

3 討 論

破骨細(xì)胞黏附于骨基質(zhì),可以加快骨吸收，在骨質(zhì)疏松中起重要作用。骨髓中的單核/巨噬細(xì)胞是破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生關(guān)系密切。相關(guān)研究表明，在巨噬細(xì)胞集落刺激因子與核因子κB受體活化素配體的相互作用，骨髓中的單核/巨噬細(xì)胞可以分化為破骨細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-214-5p和PTEN之間調(diào)控破骨細(xì)胞的體外分化，通過(guò)對(duì)骨質(zhì)疏松癥和非骨質(zhì)疏松癥患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞miR-214-5p和PTEN表達(dá)的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松組miR-214-5p水平的表達(dá)顯著上調(diào)， PTEN的表達(dá)顯著降低；同時(shí)miR-214-5p調(diào)控著PTEN的表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-214-5p會(huì)降低PTEN蛋白表達(dá)，miR-214-5p的表達(dá)與PTEN 水平的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。

miRNAs是由大小15～22個(gè)核苷酸組成的單鏈小分子RNA，是按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因在3’-UTR以及編碼區(qū)的特定序列結(jié)合，抑制靶基因的翻譯和直接促進(jìn)靶基因的mRNA的降解。miRNAs可以參與破骨細(xì)胞的成熟分化，對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有巨大的治療潛力。研究報(bào)道，miR-34a靶向Tgif2抑制破骨細(xì)胞分化，防止骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)移。也有研究證明，miR-214與PTEN在調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲方面存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松組miR-214-5p顯著上調(diào)，PTEN顯著下降，并且miR-214-5p直接靶向PTEN調(diào)節(jié)RANKL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞破骨細(xì)胞的形成。miR-214-5p過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞破骨細(xì)胞分化。文獻(xiàn)[15]報(bào)道，抑制miR-214-5p可以促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的分化，與本研究類(lèi)似。

骨質(zhì)疏松癥已成為危害人類(lèi)健康的比較嚴(yán)重的公共問(wèn)題，骨質(zhì)疏松癥骨量的減少是由于破骨細(xì)胞導(dǎo)致的骨吸收增加或者成骨細(xì)胞引起的骨形成減少。長(zhǎng)期平衡絕經(jīng)引起的骨形成和骨吸收是治療本病的主要出發(fā)點(diǎn)。目前臨床的主要治療手段是增加骨的吸收，但并未有報(bào)道闡明miR-214-5p和PTEN在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能中的作用。本研究證明了miR-214-5p和PTEN可能參與破骨細(xì)胞的分化。還能夠直接調(diào)控RAW 264.7細(xì)胞和相關(guān)基因和蛋白，NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK對(duì)破骨細(xì)胞生成過(guò)程至關(guān)重要，在這些信號(hào)途徑中，它們具有共同刺激免疫受體的RANKL，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NFATc1 的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在破骨細(xì)胞中起重要作用。NFATc1 是破骨細(xì)胞分化中的主要轉(zhuǎn)錄因子，過(guò)表達(dá)miR-214-5p或者沉默PTEN，NFATc1水平都會(huì)明顯上升。也就是說(shuō)過(guò)表達(dá)miR-214-5p可能通過(guò)靶向PTEN抑制破骨細(xì)胞分化。

綜上所述，抑制miR-214-5p的表達(dá)可以上調(diào)PTEN水平，抑制破骨細(xì)胞分化，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的思路和方法。