叢啟杰,曾榮森,劉耘溪,孫競(jìng)

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

精神分裂癥是一種以思維與行為不協(xié)調(diào)為主要特征的重度精神類疾病,其發(fā)生與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因突變密切相關(guān)[1]。神經(jīng)調(diào)節(jié)素1(neuregulin 1, Nrg1)是精神分裂癥易感基因,在調(diào)控神經(jīng)元樹突發(fā)育、軸突髓鞘形成等神經(jīng)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[2-3]。值得注意的是,不同腦區(qū)基因表達(dá)變化與精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4],其中前額皮層是興奮性谷氨酸神經(jīng)系統(tǒng)投射以及大腦思維活動(dòng)控制的重要區(qū)域[5]。研究發(fā)現(xiàn),地卓西平誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)育精神分裂癥小鼠模型中NRG1蛋白表達(dá)下降；奧氮平、利培酮和氟哌啶醇能夠上調(diào)NRG1表達(dá)并發(fā)揮抗精神分裂癥行為異常的作用[6]。郭文平等[7]研究通過(guò)雙環(huán)己酮草酰二腙誘導(dǎo)的發(fā)育障礙精神分裂癥小鼠模型發(fā)現(xiàn),前額皮層Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達(dá)降低,推測(cè)Nrg1基因可能參與少突膠質(zhì)細(xì)胞的脫髓鞘和髓鞘再生。研究表明,前額皮層與其他腦區(qū)的功能性連接障礙[8]、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂[9]及精神分裂癥的異常行為存在關(guān)聯(lián),但前額皮層Nrg1基因突變對(duì)小鼠精神分裂癥行為異常的影響尚不清楚。因此,本研究通過(guò)腦立體定位注射技術(shù)構(gòu)建前額皮層Nrg1基因敲低C57BL/6小鼠,對(duì)其神經(jīng)行為表型進(jìn)行鑒定,以研究大腦前額皮層Nrg1基因敲低在C57BL/6小鼠精神分裂癥樣行為表型形成中的作用,并初步探究其導(dǎo)致精神分裂癥表型的相關(guān)分子信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 siRNA來(lái)源、主要試劑及儀器

陰性對(duì)照siRNA(產(chǎn)品編號(hào):siN0000004-4-10)購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Nrg1-siRNA(靶標(biāo)序列:GTCTAGGACATAGTGAGTA)委托廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成,通過(guò)2′甲氧基及5′膽固醇修飾siRNA,聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化siRNA,干粉狀態(tài)于-20 ℃保存。

PBS、Trizol裂解液、NanoDropTM8000分光光度計(jì)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；熒光定量試劑盒(德國(guó)Roche公司)；IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自碧云天試劑公司；蛋白質(zhì)常規(guī)分子標(biāo)志物、小鼠抗小鼠β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、兔抗小鼠NRG1單克隆抗體、兔抗小鼠囊泡型γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular GABA transporter,VGAT)多克隆抗體、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗均購(gòu)自武漢三鷹公司；小鼠抗小鼠囊泡型谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(vesicular glutamate transporter 1, VGLUT1)單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；腦立體定位儀(廣州瑞沃德公司)；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、高架十字迷宮均為上海然哲儀器設(shè)備公司產(chǎn)品；Noldus EthoVision XT軟件(北京諾達(dá)思公司)；LightCycler?96 System(德國(guó)Roche公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器公司)。

1.2 動(dòng)物模型建立

1.2.1 動(dòng)物及分組 8周齡SPF級(jí)成年雄性C57BL/6小鼠45只,體質(zhì)量22～25 g,購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0012?；跁鐖?chǎng)實(shí)驗(yàn)將小鼠分為3組:正常對(duì)照組,陰性對(duì)照組和Nrg1-siRNA組,每組15只。

1.2.2 腦立體定位注射 采用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉小鼠,剪去頭頂部毛發(fā),固定于腦立體定位儀。頭頂部正中切口,暴露前囟和后囟,調(diào)整固定器使前囟和后囟在同一水平面上。采用顱骨標(biāo)志定位,注射位點(diǎn)為矢狀縫左側(cè)1.5 mm,前囟前1.5 mm,顱骨平面向下1.5 mm處,另一側(cè)位與矢狀縫對(duì)稱。正常對(duì)照組兩側(cè)前額皮層注射2 μL PBS,陰性對(duì)照組和Nrg1-siRNA組小鼠兩側(cè)前額皮層分別注射2 μL 0.25 mmol/L陰性對(duì)照siRNA和Nrg1-siRNA,每側(cè)注射10 min,結(jié)束后滯留時(shí)間5 min。取出注射器,縫合皮膚,將小鼠放置于保溫環(huán)境中適應(yīng),觀察小鼠狀態(tài),4 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)

小鼠放入背景噪音為65 dB的檢測(cè)箱中適應(yīng)5 min,每15 s通過(guò)偽隨機(jī)試驗(yàn)進(jìn)行前脈沖抑制測(cè)試,測(cè)試包括6次驚嚇脈沖(120 dB,40 ms/次),144次混合類型脈沖,接著6次驚嚇脈沖后結(jié)束,共計(jì)156次測(cè)試?；旌项愋兔}沖包括:背景噪音(65 dB,80 ms/次),單獨(dú)驚嚇脈沖(120 dB,40 ms/次),5種單獨(dú)前脈沖(分別為69、73、77、81、85 dB,20 ms/次),5種單獨(dú)前脈沖與驚嚇脈沖聯(lián)合(140 ms/次)。前脈沖抑制率(%)=(1-前脈沖與驚嚇脈沖聯(lián)合刺激反應(yīng)幅度/單獨(dú)驚嚇脈沖反應(yīng)幅度)×100%。在每次測(cè)試之間,用75%乙醇徹底清洗檢測(cè)箱,以消除嗅覺(jué)提示再進(jìn)行下一組實(shí)驗(yàn)。

1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)

通過(guò)在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱中監(jiān)測(cè)小鼠的活動(dòng)來(lái)評(píng)估小鼠的自發(fā)活動(dòng)。將小鼠放置在設(shè)備的中央,自由記錄30 min。箱體上方裝備行動(dòng)軌跡采集攝像機(jī),Noldus EthoVision XT軟件分析處理運(yùn)動(dòng)軌跡和參數(shù)。分析運(yùn)動(dòng)軌跡和總步行距離判斷各組自發(fā)運(yùn)動(dòng)變化情況。在每次測(cè)試之間,用75%乙醇徹底清洗實(shí)驗(yàn)箱,以消除嗅覺(jué)提示。

1.5 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠焦慮狀態(tài)

高架十字迷宮是非條件反射模型,以動(dòng)物自發(fā)的恐懼反應(yīng)為行為學(xué)基礎(chǔ)。該設(shè)備由懸空的十字架型臂組成,包含一組開放臂和一組封閉臂。將小鼠頭部朝向非開放臂放置在四個(gè)臂的中央?yún)^(qū)域,自由記錄5 min。箱體上方裝備行動(dòng)軌跡采集攝像機(jī),通過(guò)Noldus EthoVision XT軟件分析處理運(yùn)動(dòng)軌跡和參數(shù)。記錄動(dòng)物進(jìn)入開放臂時(shí)間百分比和次數(shù)百分比。在每次測(cè)試之間,用75%乙醇徹底清洗實(shí)驗(yàn)箱,以消除嗅覺(jué)提示。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Nrg1 mRNA表達(dá)

取前額皮層區(qū)域注射部位腦組織50～70 mg,采用Trizol法提取總RNA。使用NanoDropTM8000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA含量和純度。逆轉(zhuǎn)錄體系包括總RNA模板5 μg,Oligo(dT)18引物1 μL,加無(wú)RNA酶水至12 μL,65 ℃加熱5 min。加入反應(yīng)緩沖液4 μL,RNA酶抑制劑1 μL,10 mmol/L dNTP混合液2 μL和RevertAid RT 1 μL,短暫離心后42 ℃加熱60 min,70 ℃加熱5 min。繼而取cDNA 2 μL,SYBR Green Master 10 μL,正向和反向引物各0.2 μL,無(wú)RNA酶水加至20 μL體系,行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。95 ℃ 預(yù)熱10 min；95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 s,95℃ 1 s；程序:37 ℃ 冷卻30 s。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算結(jié)果。β-肌動(dòng)蛋白:正向引物5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,反向引物5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′；Nrg1:正向引物5′-TTCCCATTCTGGCTTGTCTAGT-3′,反向引物5′-CCAGGGTCAAGGTGGGTAG-3′。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)NRG1、VGAT和VGLUT1蛋白表達(dá)

取注射部位前額皮層區(qū)域腦組織,低溫勻漿后冰上裂解30 min；4 ℃行14 000×g離心15 min,取上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液制備蛋白樣品,100 ℃煮沸5 min變性處理。經(jīng)12.5% SDS-PAGE分離蛋白；80 V分離20 min,110 V分離70 min；300 mA轉(zhuǎn)膜90 min至PVDF膜；將膜置于封閉液中室溫封閉1 h；TBST洗膜3次,每次15 min；將膜置于一抗稀釋液中(NRG1、VGAT和VGLUT1,稀釋比均為1 ∶1 000,β-肌動(dòng)蛋白稀釋比為1 ∶2 000,稀釋液為TBST),4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次,每次15 min；將膜置于二抗稀釋液中(羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗稀釋比均為1 ∶1 000,稀釋液為TBST),室溫孵育1 h；TBST洗膜3次,每次15 min；ECL超敏發(fā)光液曝光,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像拍照,Image J軟件用于灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Nrg1-siRNA注射降低前額皮層Nrg1 mRNA和NRG1蛋白表達(dá)量

注射后4 d,每組隨機(jī)抽取5只小鼠檢測(cè)前額皮層Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示,Nrg1-siRNA組小鼠前額皮層注射腦區(qū)Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達(dá)量均顯著低于正常對(duì)照組(t=9.860、5.770,P均<0.01)。與正常對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.069、1.436,P均>0.05)。由此表明,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠模型構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

a: P<0.01,與正常對(duì)照組比較

2.2 前額皮層Nrg1基因敲低小鼠前脈沖抑制受損

前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在前脈沖預(yù)刺激為69 dB、73 dB、77 dB、81 dB和85 dB時(shí),Nrg1-siRNA組小鼠的前脈沖抑制率均顯著低于正常對(duì)照組(t=3.481、3.296、3.755、3.489、3.498,P均<0.05)；正常對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。由此表明,Nrg1基因敲低小鼠前脈沖抑制受損。見(jiàn)圖2。

a: P<0.05,與正常對(duì)照組比較

2.3 前額皮層Nrg1基因敲低小鼠自發(fā)活動(dòng)量增加

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,Nrg1-siRNA組小鼠移動(dòng)總距離顯著增長(zhǎng)(t=6.874,P<0.01),平均速度也顯著升高(t=4.607,P<0.01),表明小鼠的自發(fā)活動(dòng)量增加。此外,Nrg1-siRNA組小鼠在中心滯留的時(shí)間顯著低于正常對(duì)照組(t=5.805,P<0.01),提示小鼠可能出現(xiàn)了焦慮行為。見(jiàn)圖3。

a: P<0.01,與正常對(duì)照組比較

2.4 前額皮層Nrg1基因敲低小鼠表現(xiàn)出焦慮行為

高架迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Nrg1-siRNA組小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)百分比和時(shí)間百分比顯著低于正常對(duì)照組(t=6.501、6.466,P均<0.01),正常對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。由此說(shuō)明Nrg1基因敲低小鼠出現(xiàn)了焦慮樣行為異常。見(jiàn)圖4。

a: P<0.01,與正常對(duì)照組比較

2.5 前額皮層Nrg1基因敲低對(duì)VGAT和VGLUT1蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡結(jié)果表明,與正常對(duì)照組相比,Nrg1-siRNA組小鼠前額皮層VGAT蛋白表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化,VGLUT1/VGAT比值明顯增加(t=10.180,P<0.01)。正常對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

a: P<0.01,與正常對(duì)照組比較

3 討論

siRNA作為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,可直接用于在體動(dòng)物轉(zhuǎn)染,與以病毒為載體的shRNA相比,具有毒性低、安全性高等特點(diǎn)。本研究采用腦立體定位注射Nrg1-siRNA構(gòu)建前額皮層Nrg1基因敲低小鼠,結(jié)果顯示,Nrg1-siRNA組小鼠大腦前額皮層Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達(dá)量均顯著降低,表明Nrg1基因敲低小鼠模型構(gòu)建成功。陰性對(duì)照組小鼠大腦前額皮層Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達(dá)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,驗(yàn)證了Nrg1-siRNA的特異性,不存在非特異性敲低現(xiàn)象,進(jìn)一步證實(shí)Nrg1基因敲低模型的可靠性。目前研究認(rèn)為,精神分裂癥癥狀主要分為陽(yáng)性癥狀、陰性癥狀和認(rèn)知功能障礙[10]。精神分裂癥患者感覺(jué)門控功能損傷是導(dǎo)致以前脈沖抑制率降低和言行不一致為表現(xiàn)的陽(yáng)性癥狀的主要原因之一[11]。Hong等[12]研究提出,Nrg1基因rs3924999的錯(cuò)義突變可能與精神分裂癥患者前脈沖抑制功能的減弱有關(guān)。本研究顯示,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠的前脈沖抑制率顯著降低,初步驗(yàn)證了以上結(jié)論。另一方面,自發(fā)活動(dòng)量增加被認(rèn)為是與精神分裂癥陽(yáng)性癥狀密切相關(guān)的異常行為[13]。本研究曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠的移動(dòng)總距離和移動(dòng)速度顯著增加,提示小鼠出現(xiàn)精神分裂癥陽(yáng)性癥狀。同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn),前額皮層Nrg1基因敲低小鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域滯留的時(shí)間顯著降低,這可能與小鼠的焦慮行為有關(guān),與精神分裂癥陽(yáng)性癥狀一致。臨床研究也發(fā)現(xiàn),約65%精神分裂癥患者會(huì)出現(xiàn)焦慮狀行為[14]。為進(jìn)一步驗(yàn)證小鼠的焦慮行為,本研究采用高架十字迷宮評(píng)價(jià)小鼠的焦慮情況。結(jié)果顯示,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠更加傾向于進(jìn)入封閉臂,進(jìn)入開放臂的時(shí)間百分比和次數(shù)百分比顯著低于正常對(duì)照組,表明Nrg1基因敲低會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為異常。以上結(jié)果表明,前額皮層Nrg1基因敲低會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)精神分裂癥樣的前脈沖抑制損傷、自發(fā)活動(dòng)量增加和焦慮樣行為,與臨床上觀察到的精神分裂癥患者陽(yáng)性癥狀一致。

為初步探究前額皮層Nrg1基因敲低誘導(dǎo)精神分裂癥陽(yáng)性癥狀的分子機(jī)制,本研究檢測(cè)了抑制性神經(jīng)元標(biāo)志物VGAT和興奮性神經(jīng)元標(biāo)志物VGLUT1的表達(dá)水平。VGAT為γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,VGLUT1為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,其發(fā)揮轉(zhuǎn)載神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)入囊泡并釋放進(jìn)入突觸間隙的作用,調(diào)節(jié)突觸間抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡[15]。本研究結(jié)果顯示,前額皮層Nrg1基因敲低增加了前額皮層VGLUT1蛋白的表達(dá)水平,對(duì)VGAT蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著影響,從而致前額皮層VGLUT1/VGAT比值升高,提示Nrg1基因敲低后突觸間興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)失衡,這可能是導(dǎo)致呈現(xiàn)精神分裂癥陽(yáng)性癥狀的原因之一。多項(xiàng)研究采用質(zhì)子磁共振光譜法發(fā)現(xiàn),精神分裂癥患者中谷氨酸升高[16],結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中VGLUT1蛋白升高的現(xiàn)象,本研究后續(xù)可進(jìn)一步探討谷氨酸代謝是否在Nrg1基因敲低導(dǎo)致的精神分裂癥樣行為異常中發(fā)揮作用。

本研究在成年C57BL/6小鼠模型中驗(yàn)證了前額皮層Nrg1基因敲低誘發(fā)的精神分裂癥樣行為異常,避免了基因編輯動(dòng)物維護(hù)成本高和周期長(zhǎng)的缺陷,為后期快速構(gòu)建精神分裂癥在體模型以及不同腦區(qū)精神分裂癥易感基因精準(zhǔn)調(diào)控研究提供了新的方法學(xué)研究基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以成年小鼠為模型,與精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育假說(shuō)的相關(guān)性還需加強(qiáng),后期應(yīng)進(jìn)一步探究易感基因突變影響局部腦區(qū)神經(jīng)發(fā)育異常的機(jī)制。

綜上所述,前額皮層Nrg1基因敲低可導(dǎo)致C57BL/6小鼠出現(xiàn)以前脈沖抑制損傷、自發(fā)活動(dòng)量增加以及焦慮為特征的精神分裂癥樣行為改變,其分子機(jī)制可能與前額皮層γ-氨基丁酸和谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)平衡失調(diào)有關(guān)。