陳凝, 孫紅, 鄭煒平, 周夢, 劉劍雯, 嚴(yán)青, 高飛, 林禾

(1. 福建省立金山醫(yī)院內(nèi)科,福建 福州 350001； 2. 福建省立醫(yī)院藥學(xué)部,福建 福州 350001； 3. 福建省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,福建 福州 350001)

高尿酸血癥在中國已成為繼高血壓、高血脂和高血糖后的“第四高”,高尿酸血癥患者更易發(fā)生冠心病、腦卒中等多種心腦血管疾病[1-2]。非布司他是一種新型選擇性黃嘌呤氧化酶抑制劑,自2009年美國FDA批準(zhǔn)上市后廣泛用于痛風(fēng)及高尿酸血癥的治療[3]。目前關(guān)于非布司他是否會改善血管內(nèi)皮功能仍有爭議,國內(nèi)外多家研究機構(gòu)也相繼發(fā)布相關(guān)研究結(jié)果,但結(jié)論不一[4-5]。長期非布司他治療是否可以降低心腦血管疾病的風(fēng)險目前并不確定,有必要做進一步的研究。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)和輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17, Th17)是CD4+T淋巴細(xì)胞的不同亞群。Treg細(xì)胞具有抑制免疫的作用,以利于機體維持免疫穩(wěn)態(tài)。Th17細(xì)胞通過分泌IL-17等促炎細(xì)胞因子,促進機體的炎癥反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明Treg/Th17失衡在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6],其可能機制為免疫炎癥反應(yīng)參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成[7]。近年也有研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者Th17細(xì)胞增多、Treg/Th17下調(diào),提示Treg/Th17失衡可能參與了痛風(fēng)的發(fā)病。本研究擬觀察非布司他對高尿酸血癥大鼠Treg/Th17平衡、血管內(nèi)皮功能的影響,探討其治療高尿酸血癥的可能機制,為解決上述臨床問題提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

雄性SD大鼠32只,SPF級,8周齡,體重200～250 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,合格證號:SCXK(滬)2009-3。動物實驗經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品和試劑

酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司),氧嗪酸鉀(中國MACKLIN公司),非布司他(江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限公司),別嘌醇片(重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司)。佛波酯、離子霉素及莫能霉素(美國Pepro Tech公司)。大鼠抗CD4-FITC 、抗CD25-APC、抗Foxp3-PE及抗IL-17A-APC(美國BD公司)。血清尿酸、一氧化氮(NO)及內(nèi)皮素-1(ET-1)ELISA試劑盒(美國R&D公司),血清IL-6 ELISA試劑盒(美國RayBiotech公司),蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),伊紅染色液及改良Masson三色染色液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 動物造模、實驗分組及給藥

32只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、非布司他組和別嘌醇組,每組8只。模型組予以高酵母飼料(含20%酵母膏)及氧嗪酸鉀灌胃(200 mg·kg-1·d-1)。非布司他組和別嘌醇組除了給予高尿酸血癥大鼠造模方案外,還分別予以非布司他(10 mg·kg-1·d-1)和別嘌醇(50 mg·kg-1·d-1)灌胃。正常對照組大鼠灌胃生理鹽水。治療方案維持6周。用藥結(jié)束后,乙醚麻醉大鼠。大鼠頸動脈取血,血清保存于-80 ℃。分離大鼠胸主動脈,用4%甲醛固定,石蠟包埋。

1.4 血清尿酸、IL-6、NO和ET-1的含量檢測

ELISA法檢測血清尿酸、IL-6、NO及ET-1含量,按照試劑盒說明書進行。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠脾臟Treg及Th17的水平

取大鼠脾臟研磨制成單細(xì)胞懸液,紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,1 600 r/min離心5 min,PBS重懸并計數(shù),將細(xì)胞終濃度調(diào)至1×107/mL。將單細(xì)胞懸液用流式管分兩管,分別檢測Treg、Th17細(xì)胞。

檢測Treg細(xì)胞:取200 μL細(xì)胞懸液,加入抗CD4-FITC 及抗CD25-APC(1 ∶200稀釋), 室溫避光孵育20 min,PBS洗滌后加入固定破膜劑,固定破膜1 h后,PBS洗滌,加入抗Foxp3-PE(1 ∶100稀釋)避光孵育 30 min,PBS洗滌后Calibur流式儀上機檢測。

檢測Th17細(xì)胞:取200 μL細(xì)胞懸液,以200 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸,加入佛波酯(0.1 μg/mL)、離子霉素(5 μg/mL)、莫能霉素(25 μg/mL),于細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激4 h,PBS洗滌,加入抗CD4-FITC(1 ∶200稀釋), 避光孵育20 min,PBS洗滌后加入細(xì)胞固定破膜液,固定15 min,PBS洗滌,加入抗IL-17A-APC(1 ∶100稀釋)避光孵育30 min,PBS洗滌后Calibur流式儀上機檢測。

1.6 胸主動脈病理學(xué)觀察

取石蠟包埋的大鼠胸主動脈組織,切片,用二甲苯及不同濃度乙醇脫蠟、水化,蘇木素及伊紅HE染色,并用Masson復(fù)合液染色,光鏡下觀察主動脈組織的病理變化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清尿酸、IL-6含量比較

模型組較正常對照組大鼠血清尿酸、IL-6含量明顯升高(P<0.05); 非布司他和別嘌醇治療后血清尿酸、IL-6含量明顯降低(P<0.05)；與別嘌醇組相比,非布司他組血清尿酸、IL-6含量降低更為顯著(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠血清NO、ET-1含量比較

模型組較正常對照組大鼠血清NO含量明顯降低(P<0.05),ET-1含量明顯升高(P<0.05);非布司他和別嘌醇治療后血清NO含量明顯升高(P<0.05),ET-1含量明顯降低(P<0.05)；非布司他與別嘌醇對兩者的作用無顯著差異。見表1。

表1 各組大鼠血清尿酸、IL-6、NO和ET-1含量比較

2.3 各組大鼠脾臟Treg/Th17細(xì)胞水平比較

流式結(jié)果如圖1所示,正常對照組、模型組、非布司他組和別嘌醇組脾臟Treg細(xì)胞百分比分別為(11.84±2.37)%、(9.30±3.15)%、(13.89±3.58)%和(11.08±2.57)%,各組間Treg細(xì)胞百分比無明顯差異(F=2.11,P=0.12)。正常對照組、模型組、非布司他組和別嘌醇組脾臟Th17細(xì)胞百分比分別為(1.55±1.04)%、(3.20±1.40)%、(1.81±0.88)%和(2.84±0.83)%,經(jīng)方差檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.92,P<0.05),進一步行LDS-t檢驗,非布司他組Th17細(xì)胞百分比較模型組明顯下降(P<0.05)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠脾臟Treg和Th17細(xì)胞水平

正常對照組、模型組、非布司他組和別嘌醇組脾臟Treg/Th17比值分別為13.38±10.46、4.27±3.30、10.34±6.11和4.17±1.13,經(jīng)方差檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.29,P<0.05),進一步行LDS-t檢驗,非布司他組Treg/Th17比值較模型組明顯上升(P<0.05)。

2.4 各組大鼠主動脈HE染色和Masson染色結(jié)果

HE染色顯示,模型組大鼠主動脈見內(nèi)皮細(xì)胞呈立方形樣腫脹、平滑肌纖維層排列紊亂；非布司他組和別嘌醇組大鼠主動脈內(nèi)膜層內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯減輕,其中非布司他組改善更明顯。Masson染色顯示,模型組大鼠主動脈中可見纖維組織增生,膠原纖維沉積；非布司他組和別嘌醇組大鼠主動脈內(nèi)增生纖維組織和沉積的膠原纖維減少。非布司他組與別嘌醇組兩組間改善程度未見明顯差異,見圖2。

圖2 各組大鼠主動脈HE及Masson染色(×400)

3 討論

高尿酸血癥和痛風(fēng)的患病率呈逐年上升趨勢,我國最近的流行病學(xué)調(diào)查顯示,高尿酸血癥的患病率為13%[8],而痛風(fēng)的患病率為2%[9]。臨床觀察到高尿酸血癥與心血管疾病有密切聯(lián)系,可能與高尿酸血癥損傷血管內(nèi)皮功能有關(guān)。有研究表明,高尿酸血癥患者抗氧化能力降低,清除自由基的能力受到抑制,炎癥因子水平升高[10]。近年來研究表明黃嘌呤氧化酶途徑是心血管系統(tǒng)活性氧的主要來源[11],由該途徑介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在心血管疾病的病理生理過程中起重要作用,如慢性心力衰竭、血管內(nèi)皮功能障礙等。別嘌醇是黃嘌呤氧化酶的抑制劑,目前的動物實驗及臨床試驗均表明別嘌醇具有一定的抗氧化能力,可抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心血管系統(tǒng)代謝紊亂,從而發(fā)揮心血管保護作用[12]。非布司他是高選擇性黃嘌呤氧化酶抑制劑的降尿酸藥物,藥效和安全性優(yōu)于別嘌醇。但非布司他是否也具有血管內(nèi)皮保護功能,目前研究仍有爭議。CARES的臨床研究結(jié)果顯示,相比于別嘌醇,非布司他會增加痛風(fēng)患者的心血管死亡風(fēng)險[13]。但也有臨床研究如FREED[14]、FEATHER[15]隊列研究顯示,相比于別嘌醇或安慰劑,非布司他并未增加心血管事件和心血管死亡風(fēng)險。

Treg細(xì)胞可抑制炎癥反應(yīng),而Th17細(xì)胞可促進炎癥反應(yīng),兩者協(xié)同發(fā)揮作用,Treg/Th17平衡維持了機體的免疫穩(wěn)態(tài)。有多項臨床研究表明,冠心病患者中存在Treg/Th17失衡,并且與冠心病的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)[16]。其可能機制為Treg/Th17失衡導(dǎo)致機體的炎癥反應(yīng),從而引起血管內(nèi)皮損傷,加速動脈粥樣硬化的形成。也有研究動態(tài)監(jiān)測了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的脾臟Treg和Th17細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞比例增多、Treg/Th17比值在病程中持續(xù)下調(diào)[17]。但目前相關(guān)研究較少,痛風(fēng)及高尿酸血癥患者的Treg和Th17細(xì)胞變化仍有待探索。

Treg和Th17平衡最重要的影響因素是細(xì)胞因子。IL-6在TGF-β存在的情況下,可促進Th17的分化,同時IL-6還可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的Treg分化,提示IL-6是決定Treg/Th17平衡的關(guān)鍵因素之一[18]。研究發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥患者血清IL-6水平明顯高于健康者[19],其可能原因如下:高尿酸血癥患者尿酸鹽結(jié)晶沉積于血管壁,引起血管內(nèi)膜的慢性炎癥損傷,單核細(xì)胞大量黏附于血管內(nèi)膜上并釋放IL-6等炎癥因子；尿酸鹽本身也可促進白細(xì)胞釋放IL-6等炎癥因子[20-21]。本研究結(jié)果顯示高尿酸血癥大鼠血清IL-6含量升高,非布司他可顯著降低血清IL-6含量。本研究結(jié)果與Khan等[22]的結(jié)果一致,他們認(rèn)為非布司他降低IL-6可能與其抑制NF-κB炎癥信號通路有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)非布司他可恢復(fù)Treg/Th17平衡。因此,我們推測非布司他可能通過抑制IL-6水平改善高尿酸血癥Treg/Th17失衡。

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的內(nèi)分泌功能,可分泌NO、ET-1等血管活性物質(zhì)。NO、ET-1的水平可反映內(nèi)皮細(xì)胞功能狀態(tài)[23]。本研究觀察了非布司他對高尿酸血癥大鼠內(nèi)皮功能的治療作用,發(fā)現(xiàn)非布司他可升高高尿酸血癥大鼠血清NO含量,降低ET-1含量,并且可改善高尿酸血癥大鼠主動脈病理結(jié)構(gòu)。

綜上所述,非布司他干預(yù)可降低高尿酸血癥大鼠血清IL-6水平,糾正Treg/Th17失衡,改善血管內(nèi)皮功能。本研究結(jié)果為探討非布司他治療高尿酸血癥的機制提供了新的理論依據(jù)。