楊洋, 楊夢婷, 許瀟

(江蘇大學醫(yī)學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

腦膠質瘤生存率極低,目前主要通過手術切除和化療等方法治療；由于其侵襲性較高,且易浸潤周圍腦組織,導致臨床治療效果有限[1]。前期研究發(fā)現(xiàn),醋酸棉酚(gossypol acetate,GAA)可以促進腦膠質瘤細胞的自噬和凋亡,有較好的抗腫瘤活性[2]。鐵死亡是鐵依賴性氧化應激的細胞死亡方式,與多種腫瘤細胞的生長調控相關[3]?；贕AA的化學本質,推測其可能是一種鐵死亡誘導劑,但對腦膠質瘤細胞鐵死亡的影響尚不清楚。因此,本研究擬探討GAA誘導腦膠質瘤細胞發(fā)生鐵死亡的生物學效應。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人腦膠質瘤U87MG、LN229和U251MG細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院。GAA購自上海生工生物公司；PBS和高糖DMEM購自美國Hyclone公司；澳洲胎牛血清購自美國Gibco公司；Transwell小室購自美國Coming Incorporated公司；CCK-8試劑、BCA蛋白質定量試劑盒購自南京諾唯贊公司；兔抗人β-微管蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；羊抗兔二抗購自ABclonal公司；微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(微板法)、丙二醛檢測試劑盒(TBA法)購自南京建成生物公司；特異性鐵死亡挽救劑3-氨基-4-環(huán)己基氨基苯甲酸乙酯(Ferrostatin-1)購自美國MedChemExpress公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 3種人腦膠質瘤細胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM,于5%CO2、37 ℃的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長密度達70%～90%時,用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。

1.2.2 細胞分組及處理 根據(jù)本課題組前期研究結果[4],U87MG、LN229和U251MG細胞的IC50分別為14.50、9.38和10.39 μmol/L。將3種人腦膠質瘤細胞各分為2組:0 μmol/L GAA組和10 μmol/L GAA組,分別予以對應濃度的GAA處理72 h；然后進行后續(xù)實驗。

另將3種人腦膠質瘤細胞各分為4組:0 μmol/L GAA+0 μmol/L Ferrostatin-1組、0 μmol/L GAA+1 μmol/L Ferrostatin-1組、10 μmol/L GAA+0 μmol/L Ferrostatin-1組、10 μmol/L GAA+1 μmol/L Ferrostatin-1組,分別予以對應濃度的GAA和Ferrostatin-1處理72 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖率 取“1.2.2”分組細胞接種于96孔板,每孔接種1 000個細胞,加入100 μL培養(yǎng)基,每組設3個復孔。分別在1、2、3、4、5、6 d每孔加入10 μL CCK-8,培養(yǎng)2 h；用酶標儀(BioTek 800TS)檢測每孔450 nm波長處光密度(D)值。細胞相對增殖率(%)=(D加藥-D空白)/(D未加藥-D空白)×100%。

1.2.4 細胞克隆形成實驗 取“1.2.2”分組細胞接種于6孔板,每孔接種1 000個細胞,加入2 mL培養(yǎng)基,每組設3個復孔,每隔4 d更換一次培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)14 d后,在倒置普通光學顯微鏡可以觀察到明顯的細胞集落。用4%多聚甲醛固定30 min；結晶紫染色15 min；PBS洗滌3遍；拍照并計算細胞克隆數(shù)。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測GPX4mRNA表達 取“1.2.2”分組細胞,按照Trizol試劑說明書提取總RNA,并逆轉錄成模板cDNA,進行qRT-PCR體系配置及擴增。配置10 μL反應體系:cDNA溶液0.5 μL,上、下游引物各0.2 μL,2×SYBR Premix ExTaqTM5 μL、無RNA酶雙蒸水4.1 μL。擴增程序:94 ℃預變性5 min,94 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,重復40個循環(huán)。GPX4mRNA引物序列:上游為5′-CCCATTCCTGAACCTTTCAA-3′,下游為5′-TCATGTCCCCAAAGCACG-3′；β-肌動蛋白引物序列:上游為5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′,下游為5′-CTTTAGCACGCACTGTAATTCCTC-3′。β-肌動蛋白作為內參,用2-ΔΔCt值計算目的基因mRNA相對表達量。

1.2.6 蛋白質免疫印跡法檢測GPX4蛋白表達 取“1.2.2”分組細胞,分別加入適量上樣緩沖液裂解細胞,100 ℃水浴10 min；4 ℃行12 000×g離心10 min,取上清液。取10 μL樣品行10% SDS-PAGE,恒壓100 V電泳1 h；300 mA恒流濕轉150 min將蛋白質轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗(GPX4稀釋比為1 ∶1 000,內參β-微管蛋白稀釋比為1 ∶2 500)4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次,每次10 min；加入羊抗兔二抗(稀釋比為1 ∶20 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜3次,每次10 min；ECL發(fā)光液顯影；利用凝膠成像儀(Minichemi 610)拍照保存并進行分析。

1.2.7 GSH和丙二醛含量測定 取“1.2.2”分組細胞,分別加入300 μL預冷PBS,超聲破碎細胞；4 ℃行3 500 r/min離心10 min,取上清液。根據(jù)試劑盒產(chǎn)品說明書,用酶標儀分別檢測405 nm和532 nm波長處D值。根據(jù)標準曲線計算濃度。根據(jù)BCA試劑盒測得的蛋白濃度,計算GSH和丙二醛相對含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 GAA抑制腦膠質瘤細胞增殖

CCK-8結果顯示,與 0 μmol/L GAA組比較,10 μmol/L GAA組U87MG、LN229和U251MG腦膠質瘤細胞相對增殖率從第3～6天均顯著降低(P均<0.05),且隨時間延長,細胞相對增殖率差值越來越大,在第6天時差異最顯著。細胞克隆形成實驗結果顯示,與0 μmol/L GAA組比較,10 μmol/L GAA組3種腦膠質瘤細胞克隆形成數(shù)均明顯減少(P均<0.05)。見圖1。由此可見,GAA可持續(xù)抑制腦膠質瘤細胞增殖。

A:CCK-8法檢測3種腦膠質瘤細胞相對增殖率；B:克隆形成實驗檢測3種腦膠質瘤細胞增殖能力；*:P<0.05,與對應時間點0 μmol/L GAA組相比；#:P<0.05,與0 μmol/L GAA組相比

2.2 GAA可引起腦膠質瘤細胞鐵死亡

CCK-8結果顯示,與10 μmol/L GAA+ 0 μmol/L Ferrostatin-1組相比,10 μmol/L GAA+1 μmol/L Ferrostatin-1組3種腦膠質瘤細胞相對增殖率明顯升高(P均<0.05),且LN229和U251MG細胞較U87MG細胞更為明顯。見圖2。由此表明,特異性鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1可部分挽救GAA引起的細胞死亡,推測GAA引起的細胞死亡可能與細胞鐵死亡相關,且LN229和U251MG細胞對其較為敏感。

*:P<0.05,與0 μmol/L Ferrostatin-1+10 μmol/L GAA組比較

2.3 GAA抑制腦膠質瘤中GPX4表達

結果顯示(圖3),在U87MG、LN229和U251MG 3種腦膠質瘤細胞中,與0 μmol/L GAA組相比,10 μmol/L GAA組GPX4mRNA表達水平均明顯降低(P均<0.05),其中U251MG細胞最明顯。蛋白質免疫印跡結果也顯示,與0 μmol/L GAA 組比較,10 μmol/L GAA組3種腦膠質瘤細胞中GPX4蛋白表達水平明顯降低(P均<0.05)。見圖4。由此推測,GAA可以通過抑制GPX4 mRNA和蛋白表達,誘導腦膠質瘤細胞發(fā)生鐵死亡。

*:P<0.05,與0 μmol/L GAA組比較

*:P<0.05,與0 μmol/L GAA組比較

2.4 GAA致腦膠質瘤細胞中GSH和丙二醛含量改變

結果如圖5所示,與0 μmol/L GAA組相比,10 μmol/L GAA組LN229和U251MG細胞中GSH相對含量明顯減少(P均<0.05),丙二醛含量明顯增加(P均<0.05)；但是,U87MG細胞中GSH和丙二醛相對含量無顯著變化(P>0.05)。由此提示,GAA可能誘導LN229和U251MG細胞發(fā)生鐵死亡,而對U87MG細胞作用效應不明顯。

*:P<0.05,與0 μmol/L GAA組相比

3 討論

GAA是一種多元酚醛類化合物,具有多種藥理活性,包括抗生育能力、抗菌、抗腫瘤和抗氧化等[5],是一種新型抗癌藥物[6]。目前已廣泛用于男性避孕和治療子宮肌瘤、子宮內膜異位癥等婦科疾病[7-8]。

本研究發(fā)現(xiàn),GAA可能通過抑制GPX4表達,誘導腦膠質瘤細胞發(fā)生鐵死亡,且其生物學效應具有細胞特異性。細胞鐵死亡的實質是由于GPX4失能,細胞內脂質氧化物代謝障礙,在鐵離子作用下,造成膜脂上活性氧自由基堆積,使細胞內氧化還原失衡,進而誘導細胞死亡[9]；常見的檢測指標包括細胞活性、細胞內鐵水平、細胞內脂質過氧化物以及細胞內與鐵死亡相關的因子(GPX4, SLC7A11等)。本研究發(fā)現(xiàn),特異性鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1可以顯著降低GAA引起的腦膠質瘤細胞死亡,并且GAA引起細胞內GSH含量下降、丙二醛含量增加,初步證明GAA誘導腦膠質瘤細胞發(fā)生鐵死亡進而發(fā)揮其抗腦膠質瘤的作用,理論上進一步補充了GAA的藥理作用機制。

GPX4是鐵死亡的主要靶點,其活性抑制可打破氧化平衡,導致脂質過氧化物破壞細胞膜結構,從而激發(fā)細胞鐵死亡[10]。早期研究發(fā)現(xiàn),GAA處理可導致腦膠質瘤細胞中線粒體蛋白質簇顯著減少,血紅素加氧酶1顯著上調[11],介導血紅素中鐵離子釋放及積蓄[12]。因此,推測GAA可能通過血紅素加氧酶1而誘導細胞發(fā)生鐵死亡,但具體機制尚需進一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn),GAA明顯抑制腦膠質瘤細胞中GPX4 mRNA和蛋白表達,并且致細胞內還原型GSH含量明顯降低,脂質過氧化物丙二醛含量顯著增加,由此表明GAA可以通過抑制GPX4途徑誘導腦膠質瘤細胞發(fā)生鐵死亡。

綜上所述,本研究表明GAA通過抑制GPX4途徑誘導腦膠質瘤細胞發(fā)生鐵死亡,從而抑制腦膠質瘤生長,由于腦膠質瘤細胞分型不同,其對藥物的生物學效應具有細胞特異性。GAA調控GPX4通路的具體機制以及對不同類型腦膠質瘤的敏感性差異仍有待進一步研究。