王玉文，關乃千，周 末，吳蒙嘉，孫 昆，穆懷志

(北華大學林學院，吉林 吉林 132013)

ATP合酶為多亞基復合體，廣泛分布于質膜、線粒體內膜和類囊體膜，是光合作用中光合磷酸化和呼吸作用氧化磷酸化反應的關鍵酶[1].ATP合酶可分為3大類，分別為儲能F-型、質膜P-型和液泡V-型，其中F-型ATP合酶(F1F0-ATP合酶)利用光合電子傳遞過程中產(chǎn)生的跨膜質子動力勢催化ADP與無機磷合成ATP，實現(xiàn)光能向化學能的轉化，產(chǎn)生細胞生命活動所需的ATP[2].因此，開展植物ATP合酶研究具有重要意義.

糠椴(Tiliamandshurica)又名遼椴，系椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬(Tiliaspp.)植物，廣泛分布于我國東北、內蒙古、河北、山東、江蘇北部，以及朝鮮、俄羅斯遠東地區(qū)[3].糠椴樹形通直、樹冠高大圓滿，不僅可以作綠化樹種，同時也是重要的蜜源植物，具有重大的經(jīng)濟價值[4].近年來，關于糠椴的研究主要集中在種群分布格局[5-6]、解剖結構[7-9]、種子休眠[10-11]、無性繁殖[12-13]、光合特性[14-16]、化學成分[17-18]等方面，而關于糠椴ATP合酶的研究未見報道.本研究利用生物信息學方法分析糠椴ATP合酶基因，研究結果可為后續(xù)糠椴ATP合酶的基因克隆提供參考.

1 材料及方法

1.1 材 料

用NCBI(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov)已有的糠椴6個ATP合酶亞基基因序列，以及紫椴(Tiliaamurensis)、少脈椴(Tiliapaucicostata)、粉椴(Tiliaoliveri)、蝴蝶樹(Heritieraparvifolia)、長柄銀葉樹(Heritieraangustata)、木棉(Bombaxceiba)、美麗梧桐(Firmianapulcherrima)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、梭羅樹(Reevesiapubescens)、滇桐(Craigiayunnanensis)、面包樹(Artocarpuscommunis)、黃秋葵(Abelmoschusesculentus)、木槿(Hibiscussyriacus)、梧桐(Firmianasimplex)、云南梧桐(Firmianamajor)、可可樹(The-obromacacao)、朱槿(Hibiscusrosa-sinensis)、榴蓮(Duriozibethinus)、施溫迪茫棉(Gossypiumschwendim-anii)、海濱木槿(Taliparitihamabo)等ATP合酶的核苷酸序列和氨基酸序列作為試驗材料.

1.2 方 法

分別利用ORF Finder、ProtParam、Protscale、TMHMMSERVER、PBIL、SWISS-MODE和MEGA7分析ATP合酶基因序列開放閱讀框、基本性質、親水性/疏水性、跨膜結構域、二級結構、同源建模、物種的同源進化樹.

2 結果與分析

2.1 同源性

NCBI數(shù)據(jù)庫中糠椴ATP合酶的序列號為NC_028589.1.糠椴ATP合酶由CF1和CF0兩部分atpA、atpB、atpE、atpF、atpH、atpI共6個亞基組成.其中，CF1由atpA、atpB和atpE組成，CF0由atpF、atpH和atpI組成.BLAST分析結果表明：糠椴ATP合酶每個亞基基因與不同物種該基因的同源性并不相同.與糠椴atpA亞基基因相似度達到100%的物種為紫椴、少脈椴、粉椴、蝴蝶樹、長柄銀葉樹、木棉、美麗梧桐、陸地棉和梭羅樹；與糠椴atpB亞基基因相似度達到100%的物種為紫椴、少脈椴、粉椴、木棉、滇桐、梭羅樹、梧桐、蝴蝶樹和面包樹；與糠椴atpE亞基基因相似度達到100%的物種為紫椴、少脈椴、粉椴、美麗梧桐、梧桐、施溫迪茫棉、蝴蝶樹、黃秋葵和木槿；與糠椴atpF亞基基因相似度達到100%的物種為紫椴、粉椴、少脈椴、梭羅樹、陸地棉、云南梧桐、蝴蝶樹、美麗梧桐和可可樹；與糠椴atpH亞基基因相似度達到100%的物種為朱槿、紫椴、粉椴、梭羅樹、木槿、施溫迪茫棉、蝴蝶樹、木棉和榴蓮；與糠椴atpI亞基基因相似度達到100%的物種為紫椴、少脈椴、粉椴、梭羅樹、蝴蝶樹、木棉、榴蓮、可可樹和海濱木槿.與糠椴ATP合酶各亞基基因序列相似度達到100%的物種見表1.

表1 與糠椴ATP合酶各亞基基因序列相似度達到100%的物種Tab.1 Species with 100% similarity of ATP synthase subunit gene sequences in Tilia mandshurica

2.2 開放閱讀框

利用ORF Finder分析糠椴ATP合酶不同亞基序列的開放閱讀框，結果見表2.由表2可見：6個亞基的序列長度差異較大，其中，atpA的基因序列最長，達到1 523 bp；其次為atpB(1 496 bp)和atpF(1 355 bp)；atpH的基因序列最短，僅為245 bp.

表2 糠椴ATP合酶亞基基因位置及長度Tab.2 Location and length of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica /bp

2.3 氨基酸組成

利用ProtParam分析糠椴ATP合酶各亞基的氨基酸組成、相對分子質量和理論等電點，結果見圖1、表3.結果表明：atpA亞基含有19種氨基酸，其中，丙氨酸含量最高(9.86%)，半胱氨酸含量最低(0.20%)，分子式為C2442H3974N678O764S12，相對分子質量為55 441.22，等電點為5.26；atpB亞基含有19種氨基酸，其中，亮氨酸含量最高(10.04%)，半胱氨酸含量最低(0.20%)，分子式為C2382H3680N648O728S16，相對分子質量為53 737.72，等電點為5.29；atpE亞基含有19種氨基酸，其中，丙氨酸和異亮氨酸含量最高，均為12.03%，半胱氨酸、組氨酸、苯丙氨酸含量最低，均為0.75%，分子式為C633H1059N189O195S4，相對分子質量為14 565.76，等電點為5.83；atpF亞基含有19種氨基酸，其中，亮氨酸含量最高(12.50%)，色氨酸含量最低(0.54%)，分子式為C915H1481N265O283S3，相對分子質量為20 818.61，等電點為6.33；atpH亞基含有16種氨基酸，其中，丙氨酸含量最高(19.75%)，酪氨酸和賴氨酸含量最低，均為1.24%，分子式為C264H599N93O103S2，相對分子質量為7 990.44，等電點為4.94；atpI亞基含有20種氨基酸，其中，亮氨酸含量最高(11.74%)，半胱氨酸含量最低(0.41%)，分子式為C1273H1947N297O339S5，相對分子質量為26 996.95，等電點為5.06.

A.丙氨酸；R.精氨酸；N.天冬酰胺；D.天冬氨酸；C.半胱氨酸；Q.谷氨酰胺；E.谷氨酸；G.甘氨酸；H.組氨酸；I.異亮氨酸；L.亮氨酸；K.賴氨酸；M.甲硫氨酸；F.苯丙氨酸；P.脯氨酸；S.絲氨酸；T.蘇氨酸；W.色氨酸；Y.酪氨酸；V.纈氨酸.圖1 糠椴ATP合酶亞基的氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica

表3 糠椴ATP合酶亞基氨基酸數(shù)量、相對分子質量和理論等電點Tab.3 Amino acid quantity，molecular weight and theoretical isoelectric point of ATP synthase subunit genes in Tilia mandshurica

2.4 蛋白質親/疏水性

糠椴ATP合酶的親/疏水性分析結果見圖2.結果表明：atpA、atpB、atpE和atpF為親水蛋白，atpH和atpI為疏水蛋白.atpA的GRAVY值為-0.102，其最大值(2.7)和最小值(-2.8)分別出現(xiàn)在190和20位點；atpB的GRAVY值為-0.038，最大值(2.3)出現(xiàn)在260位點，最小值(-2.7)出現(xiàn)在210位點；atpE的GRAVY值為-0.044，最大值(1.9)出現(xiàn)在40位點，最小值(-2.6)出現(xiàn)在107位點；atpF的GRAVY值為-0.352，最大值(3.3)出現(xiàn)在40位點，最小值(-2.5)出現(xiàn)在120位點；atpH的GRAVY值為1.002，最大值(3.3)出現(xiàn)在72位點，最小值(-2.0)出現(xiàn)在43位點；atpI的GRAVY值為0.668，最大值(3.6)出現(xiàn)在205位點，最小值(-1.8)出現(xiàn)在60位點.

圖2 糠椴ATP合酶各亞基的親/疏水性Fig.2 Hydrophobic and hydrophilic properties of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica

2.5 跨膜結構域

TMHMM分析顯示，糠椴ATP合酶不同亞基的跨膜結構不盡相同.其中，atpI的跨膜區(qū)最多，高達5個；atpH和atpF的跨膜區(qū)分別為2個和1個；atpA、atpB和atpE不存在跨膜結構(圖3).

圖3 糠椴ATP合酶各亞基的跨膜結構域Fig.3 Transmembrane domain of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica

2.6 二級結構與同源建模

利用PBIL分析糠椴ATP合酶的二級結構，結果見表4.由表4可知：不同亞基的二級結構組成不同，其中，atpA、atpB、atpE和atpI的二級結構由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成，而atpF和atpH僅由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，無β折疊.α螺旋比例較高的是atpH和atpF，分別達到86.42%和86.41%；其次是atpI，為71.26%；atpE最低，僅為29.32%.β折疊比例最高的是atpE，高達37.59%；其次是atpB和atpA，分別為18.27%和14.00%；atpI最低，僅為1.62%.無規(guī)則卷曲比例最高的是atpB，高達43.98%；其次是atpA，為43.40%；atpH最低，僅為13.58%.利用SWISS-MODEL對糠椴ATP合酶各亞基的氨基酸序列進行同源建模，得到的三維結構見圖4.

表4 糠椴ATP合酶亞基二級結構數(shù)量及比例Tab.4 Quantity and proportion of secondary structure of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica

圖4 糠椴ATP合酶及各亞基三維結構Fig.4 Three-dimensional structure of ATP synthase and its subunits in Tilia mandshurica

2.7 系統(tǒng)進化樹

利用MEGA7分別構建糠椴ATP合酶6個亞基與紫椴、少脈椴、粉椴、美麗梧桐、梧桐、云南梧桐、蝴蝶樹、長柄銀葉樹、陸地棉、木棉、梭羅樹、滇桐、面包樹、黃秋葵、施溫迪茫棉、木槿、海濱木槿、朱瑾、榴蓮和可可樹的進化樹，10個親緣關系較近樹種構建的進化樹見圖5.由圖5可見：不同亞基對應的進化樹結構并不相同.糠椴atpA、atpB、atpE、atpF和atpI亞基基因與粉椴、少脈椴和紫椴親緣關系較近；糠椴atpH亞基基因與木槿親緣關系較近，而與紫椴和粉椴的親緣關系相對較遠.

圖5 糠椴ATP合酶不同亞基基因系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ATP synthase subunit genes in Tilia mandshurica

3 結論與討論

ATP合酶廣泛分布于線粒體內膜、葉綠體類囊體、異養(yǎng)菌和光合菌的質膜上，參與氧化磷酸化和光合磷酸化，是生物能量轉換的關鍵酶，影響細胞生命活動所需ATP的產(chǎn)生[1，19].目前，已有很多有關ATP合酶基因的報道.林莉莉等[20]對ATP合酶的C1F1F0-ATP 基因進行紅藍光不同光質配比處理，發(fā)現(xiàn)白光促進杉木幼苗生長，說明C1F1F0-ATP 基因對白光的響應與杉木木材生長發(fā)育的調控有著密切關系.對砂蘚ATP合酶Ⅱ亞基的基因表達研究表明，該亞基在脫水脅迫和復水過程中的表達發(fā)生了明顯變化，說明ATP合酶Ⅱ亞基可能參與了砂蘚干旱脅迫的應答[21].MAO等[22]將水稻幼苗在低溫下處理不同時間，Northern雜交分析顯示其atpH亞基基因轉錄水平在低溫處理1 d時明顯下降，低溫處理2 d后完全被抑制.李生廣等[23]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇對ATP合酶表現(xiàn)為非競爭性抑制，說明乙醇并未直接與反應底物競爭結合位點，而是作用于ATP合酶上的乙醇敏感部位，導致CF1構象發(fā)生改變，從而使CF1上催化位點與調節(jié)位點解聚，進而影響活性部位，最終造成ATP水解受到抑制.姜曉旭等[24]從蒙古沙冬青幼苗中克隆得到ATP合酶的atpD亞基基因，發(fā)現(xiàn)該基因在低溫和干旱脅迫下的表達量明顯升高，說明該基因可受低溫和干旱脅迫誘導表達.

本研究表明，糠椴ATP合酶共有6個亞基，分別為atpA、atpB、atpE、atpF、atpH和atpI.糠椴ATP合酶由51.40%的α螺旋、13.10%的β折疊和35.50%的無規(guī)則卷曲組成.在6個亞基中，atpA、atpB、atpE和atpF為親水性蛋白；atpH和atpI為疏水蛋白.atpI有5個跨膜區(qū)，atpH和atpF分別有2個和1個跨膜區(qū)，atpA、atpB和atpE不存在跨膜結構.綜上所述，糠椴ATP合酶是一個鑲嵌在膜上且具有跨膜結構的酶，既有親水性部分，又有疏水性部分，且各亞基具有明顯差異.上述結果可為深入了解糠椴ATP合酶的結構以及通過基因克隆和轉基因技術驗證其功能提供參考.