劉馨竹，林 睿，安麗萍，杜培革，郭 笑

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

過(guò)氧化物氧還蛋白(Peroxiredoxins，Prxs)家族是一類不斷擴(kuò)展的巰基特異的抗氧化蛋白家族，該蛋白家族通過(guò)其過(guò)氧化物酶活性還原或降解氫過(guò)氧化物、過(guò)氧化亞硝酸鹽和多種有機(jī)氫過(guò)氧化物，進(jìn)而在拮抗機(jī)體產(chǎn)生的活性氧、維持機(jī)體的氧化還原平衡上發(fā)揮重要作用[1-3].有研究[4-5]表明：Prxs還有許多其他生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞的增殖分化、血紅素代謝及增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性等.在哺乳動(dòng)物組織中至少有6個(gè)Prx成員(Prx 1～6)，根據(jù)參與氧化還原反應(yīng)的半胱氨酸(cysteine，Cys)數(shù)目不同將其分為兩類，其中Prx 1～5為2-Cys Prx，主要以硫氧化蛋白為供電子體，而Prx6是唯一的1-Cys Prx以谷胱甘肽為供電子體[6].盡管各成員在細(xì)胞氧化還原保護(hù)中功能各不相同，但它們都具有細(xì)胞內(nèi)H2O2還原活性，可以控制細(xì)胞內(nèi)H2O2的水平[7].

研究[8-9]發(fā)現(xiàn)：Prx6具有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPx活性和磷脂酶A2雙功能活性，它能夠清除過(guò)氧化氫、脂肪氫過(guò)氧化物及磷脂氫過(guò)氧化物等，在機(jī)體抗氧化的防御生理功能中具有重要作用.細(xì)胞水平研究[10-11]表明：過(guò)表達(dá)Prx6能明顯減少脂質(zhì)過(guò)氧化作用，降低細(xì)胞質(zhì)膜損傷，而抑制Prx6表達(dá)則可觀察到明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化、脂膜損傷及細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象.活體水平研究[12]表明：Prx6轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)高氧損傷有顯著的保護(hù)作用，Prx6基因敲除小鼠的抗氧化損傷能力明顯降低.由此可見(jiàn)，越來(lái)越多的研究證明了Prx6具有重要的抗氧化損傷功能.國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)Prx6抗氧化功能進(jìn)行了一系列研究，而對(duì)其性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的研究相對(duì)較少，本研究通過(guò)構(gòu)建攜帶hPrx6基因的原核表達(dá)載體，使hPrx6基因在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)一步對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為后續(xù)其催化機(jī)制、生物學(xué)功能的研究提供理論依據(jù).

1 儀器與材料

PCR儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；電泳儀(BioRad公司，美國(guó))；培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；超聲破碎儀(上海比朗儀器制造有限公司)；分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司).

質(zhì)粒pColdⅠ、大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α及人宮頸癌hela細(xì)胞株cDNA文庫(kù)(北華大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存)；Premix Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、瓊脂糖、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(TaKaRa)(大連寶生物工程有限公司)；胰蛋白胨、酵母粉(OXOID公司，英國(guó))；氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甘油等(鼎國(guó)生物有限公司).

2 方 法

2.1 hPrx6基因的調(diào)取

以人宮頸癌hela細(xì)胞株cDNA文庫(kù)為PCR反應(yīng)的模板，根據(jù)hPrx6基因序列設(shè)計(jì)引物hPrx6-F：5′-CCCAAGCTTATGCCCGGAGGTC-3′；hPrx6-R：5′-GCTCTAGATTAAGGCTGGGGTG-3′.

PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性2 min；94 ℃變性50 s，52～57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫8 min；4 ℃保持.

PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1.

表1 PCR反應(yīng)體系Tab.1 PCR reaction system

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將獲得的PCR產(chǎn)物hPrx6及質(zhì)粒pColdI進(jìn)行Hind III/Xba I雙酶切，利用膠回收試劑盒回收酶切片段，將酶處理后的hPrx6基因片段和質(zhì)粒按照5∶1(物質(zhì)的量比)的比例進(jìn)行16 ℃連接過(guò)夜.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐西林抗性的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子.再分別通過(guò)雙酶切及PCR鑒定，最后將陽(yáng)性克隆提取的質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測(cè)序.

2.3 表達(dá)菌種的篩選

將pColdI-hPrx6轉(zhuǎn)化在BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐西林抗性的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子.挑取陽(yáng)性菌種克隆于含有5 mL新鮮LB的培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.6～0.8時(shí)，加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4 h后收集菌體，應(yīng)用SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)情況.

2.4 重組蛋白的分離純化

收集菌體，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液制備菌懸液，超聲破碎后離心，離心后的上清通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，先用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡柱體，然后再分別用含有20、50、100、200 mmol/L咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，最后應(yīng)用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白.

2.5 純化產(chǎn)物Western檢測(cè)

取純化后產(chǎn)物20 μL，上樣于12%的分離膠SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后進(jìn)行Western印記分析.一抗為鼠抗組氨酸抗體，二抗為HRP-羊抗鼠IgG，抗原抗體結(jié)合后與DAB底物溶液反應(yīng)顯色.

2.6 酶活力測(cè)定

應(yīng)用Wilson酶偶聯(lián)方法測(cè)定hPrx6的GPx活力，反應(yīng)體系為1 mL，其中包含50 mmol PBS、2 mmol NaN3、1 mmol EDTA、0.05 mmol NADPH、0.3 mmol GSH、0.25 U谷胱甘肽還原酶和50 nmol的蛋白樣品.反應(yīng)混合物37 ℃預(yù)熱5 min，然后加入終濃度為0.5 mmol的H2O2啟動(dòng)反應(yīng).在 340 nm 處測(cè)定NADPH吸光度值的變化情況，酶活力為37 ℃下該蛋白氧化1 μmol/min NADPH所需酶的量為一個(gè)活力單位，其酶活力單位用U/μmol表示.

2.7 酶學(xué)性質(zhì)分析

最適溫度：將等量純化后的hPrx6于4、10、20、30、37、50、60、70、80 ℃條件下測(cè)定酶活力，所測(cè)最高酶活力設(shè)為100%，計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力，探討溫度對(duì)酶活力的影響.

最適pH：將等量純化后的hPrx6置于pH為3.6～10的緩沖液中，于37 ℃反應(yīng)測(cè)定酶活力，以所測(cè)最高酶活力為100%，計(jì)算不同pH下的相對(duì)酶活力，探討pH對(duì)酶活力的影響.

穩(wěn)定性研究：為觀察hPrx6的穩(wěn)定性，將純化后的hPrx6于4 ℃分別放置1、2、4、7、10 d，檢測(cè)其活力變化.

2.8 結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件Expasy(http：∥web.expasy.org/protparam)對(duì)氨基酸組成及理化性質(zhì)進(jìn)行分析，利用SOPMA (http：∥prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home) 對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用PDB(http：∥www.rcsb.org/pdb/home/home.do)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).

3 結(jié) 果

3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果見(jiàn)圖1 a.在500～750 bp之間有條帶與已知hPrx6的基因片段大小(686 bp)結(jié)果相符，且無(wú)其他非特異性擴(kuò)增.重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1 b.質(zhì)粒雙酶切后有兩條帶，位于下面的條帶與目的基因片段大小相符.測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒pColdⅠ-hPrx6構(gòu)建成功.

a：M.marker DL2000；1～2.hPrx6 PCR產(chǎn)物.b：M.marker DL2000；1.p Cold I-hPrx6經(jīng)Hind III和Xba I雙酶鑒定.圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of hPrx6

3.2 p Cold I-hPrx6誘導(dǎo)表達(dá)及純化

含p Cold I-hPrx6的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)LB培養(yǎng)誘導(dǎo)后，進(jìn)一步對(duì)菌體表達(dá)情況進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2 a.菌體誘導(dǎo)前后在約27 kDa處有一條明顯蛋白條帶，利用Ni-NTA柱親和層析純化目的蛋白，純化后蛋白在約27 kDa處有單一條帶，由此證明我們得到了純度較高的目的蛋白.Western Bolt鑒定表達(dá)蛋白見(jiàn)圖2 b，DAB顯色后可見(jiàn)一條清晰條帶，進(jìn)一步表明目的蛋白得到了有效表達(dá)及純化.

a：M.marker；1.轉(zhuǎn)化p Cold I-hPrx6的BL21(DE3)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2.轉(zhuǎn)化p Cold I-hPrx6的BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；3.hPrx6純化后蛋白.b：M.蛋白質(zhì)marker；1.純化后hPrx6蛋白.圖2 SDS-PAGE和Western Bolt分析hPrx6蛋白表達(dá)及純化Fig.2 Expression and purification of hPrx6 protein by using SDS-PAGE and Western Bolt analysis

3.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

利用Wilson酶偶聯(lián)方法在不同溫度和不同pH條件下測(cè)定hPrx6的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3 a.在10～50 ℃下，hPrx6的活力相對(duì)較高，溫度在30 ℃時(shí)酶活力值最高.圖3 b為hPrx6和pH變化曲線，其最適反應(yīng)pH為7.由此可見(jiàn)，外界環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)活力有較大的影響.

圖3 溫度和pH對(duì)活力的影響Fig.3 Effect of temperature and pH on activity

為了研究hPrx6的穩(wěn)定性，將該蛋白存儲(chǔ)于4 ℃下一段時(shí)間，觀察其活力變化.由圖4可見(jiàn)：隨存儲(chǔ)時(shí)間的增長(zhǎng)，hPrx6的活力顯著下降，10 d后活力基本喪失.

圖4 存儲(chǔ)時(shí)間對(duì)hPrx6活力的影響Fig.4 Effect of storage time on hPrx6 activity

3.4 結(jié)構(gòu)分析

hPrx6酸性氨基酸總數(shù)(Asp+Glu=32)多于堿性氨基酸總數(shù)(Arg+Lys=30)，其不穩(wěn)定系數(shù)為43.26，歸類為不穩(wěn)定蛋白.利用SOPMA對(duì)hPrx6二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，結(jié)果表明：該蛋白主鏈原子排列以無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈為主.其中無(wú)規(guī)則卷曲占43.75%、α-螺旋占25.89%、延伸鏈占21.43%、β-折疊占8.93%.人Prx6的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5.在三級(jí)結(jié)構(gòu)中蛋白無(wú)規(guī)則卷曲分布較多，α螺旋在中間區(qū)域分布較集中，與上述二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果大致相同.

圖5 hPrx6的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 3D structure of hPrx6

4 討 論

活性氧是生物體有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，研究[13-15]發(fā)現(xiàn)：人類幾乎所有疾病的產(chǎn)生和進(jìn)展都與活性氧有關(guān).因此，抗氧化酶的研發(fā)及應(yīng)用具有重要意義.Prx蛋白家族擁有過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物水平具有重要作用，并且隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)Prx家族成員在細(xì)胞生命活動(dòng)中還承擔(dān)著許多重要角色，如保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[16-17].

本研究首次在人宮頸癌cDNA文庫(kù)中調(diào)取hPrx6基因，進(jìn)而將其構(gòu)建于p Cold I載體上進(jìn)行異源表達(dá)，這為今后hPrx6的深入研究提供了參考.本研究還對(duì)hPrx6酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了探討，結(jié)果表明：hPrx6最適溫度為30 ℃，最適pH為7，且受環(huán)境因素影響較大.對(duì)其穩(wěn)定性研究的結(jié)果表明hPrx6的活力隨著存儲(chǔ)時(shí)間的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，對(duì)hPrx6氨基酸組成及理化性質(zhì)分析表明其為不穩(wěn)定蛋白.本研究還對(duì)hPrx6酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了探討，在后續(xù)研究中，我們將通過(guò)基因工程改造手段試圖提高其催化活性及穩(wěn)定性.此外，通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)其二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，有助于了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性功能間的關(guān)系，并為hPrx6的優(yōu)化及改造提供信息，大大縮短了研發(fā)時(shí)間和成本，使研究更具有目的性及方向性，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供了理論依據(jù).