劉凱雙，閆 研，殷 果，王鐵杰*

（1. 深圳市藥品檢驗研究院，廣東 深圳 518057；2. 深圳藥品質量標準研究重點實驗室，廣東 深圳 518057）

復方氨酚葡鋅片是由對乙酰氨基酚、葡萄糖酸鋅、鹽酸二氧丙嗪和板藍根浸膏粉組成的中西藥結合的復方制劑，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘和抗病毒作用[1]。目前國內共有3家生產企業(yè)，現(xiàn)行標準為3個國家藥品標準[2-4]，國內外藥典均未收載。經查詢《中國藥典》2020年版二部[5]對乙酰氨基酚及其相關制劑標準，均有對氨基酚的檢查項。本品含有對乙酰氨基酚，但現(xiàn)行標準均未對其特征物質對氨基酚進行控制。查詢文獻[6-8]發(fā)現(xiàn)目前缺少中西藥復方制劑中西藥有關物質檢測的相關研究。復方氨酚葡鋅片為典型的中西藥結合復方制劑，由1個中藥浸膏成分和3個西藥成分組成，為了更好控制復方氨酚葡鋅片質量，徹底去除中藥浸膏成分對對氨基酚檢測結果的干擾，前處理采用乙醇提取、流動相稀釋的方法，檢測采用HPLC檢測對氨基酚。本方法經方法學驗證，回收率、準確度良好，且專屬性強，靈敏度高，為復方氨酚葡鋅片質量標準的提高提供依據(jù)，也為中西藥復方制劑中有關物質研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀（DAD3000檢測器，德國賽默飛）；XS105DU型電子天平。

1.2 試藥

復方氨酚葡鋅片（成人規(guī)格處方為對乙酰氨基酚100.0 mg，葡萄糖酸鋅70.0 mg，鹽酸二氧丙嗪1.0 mg，板藍根浸膏粉250 mg；兒童規(guī)格處方為對乙酰氨基酚30.0 mg，葡萄糖酸鋅21.0 mg，鹽酸二氧丙嗪0.3 mg，板藍根浸膏粉75 mg，均由河北恒利集團制藥股份有限公司提供），原輔料（由河北恒利集團制藥股份有限公司提供），對氨基酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100802-201604，含量：100 %），對乙酰氨基酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100018-201610，含量：99.9 %）。乙醇、甲醇（色譜純，Merck公司），超純水，醋酸銨為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.05 mol/L醋酸銨溶液-甲醇（97:3）；流速1.0 ml/min；檢測波長230 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μl，按外標法以峰面積計算。理論板數(shù)按對乙酰氨基酚峰計算應不低于5 000，對氨基酚和對乙酰氨基酚峰的分離度應符合要求。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液 取對氨基酚對照品10 mg和對乙酰氨基酚對照品25 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶，加無水乙醇適量，振搖使對氨基酚和對乙酰氨基酚溶解，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 ml，置入5 ml量瓶，加無水乙醇稀釋至刻度，再精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，加流動相稀釋制成每1 ml中分別約含對氨基酚2 μg和對乙酰氨基酚5 μg的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復方氨酚葡鋅片20片（兒童規(guī)格30片），精密稱定，研細，取本品細粉適量（約相當于對乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，置入5 ml量瓶，加無水乙醇適量，振搖使對乙酰氨基酚溶解，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。精密量取上述續(xù)濾液1 ml，置入10 ml量瓶，加流動相稀釋制成每1 ml中約含對乙酰氨基酚2 mg的溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 分別按成人規(guī)格和兒童規(guī)格處方和說明書，稱取除對乙酰氨基酚外的其他主藥、輔料和包衣劑，置入5 ml量瓶，按2.2.2項方法，分別配制陰性對照溶液（1）和陰性對照溶液（2）。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗 分別精密吸取2.2項下制得的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，按上述方法和色譜條件測定，記錄色譜圖，結果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

混合對照品溶液色譜圖中各色譜峰峰形良好，對氨基酚和對乙酰氨基酚之間的分離度為33.39，理論板數(shù)按照對乙酰氨基酚峰計算為19304，均符合要求（圖1，B）。

供試品溶液色譜圖中在與對照品溶液色譜圖中相應位置，未檢測出對氨基酚峰，只檢測出對乙酰氨基酚峰。提取方法和檢測方法可完全去除中藥成分板藍根浸膏峰的干擾，基線較平，對氨基酚峰的保留時間可延長至6 min，不受溶劑峰干擾，且與對乙酰氨基酚峰之間分離度較好（圖1，C～D）。陰性對照溶液（1）和陰性對照溶液（2）在兩種主成分相應位置處均無色譜峰出現(xiàn)，表明空白輔料和其他主成分對主峰無干擾（圖1，E～F）。

2.3.2 線性試驗 精密量取對氨基酚對照品的無水乙醇溶液（20 μg/ml）0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，分別置入10 ml量瓶，用流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml含對氨基酚0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 μg的對照品溶液。

分別精密吸取上述各濃度對照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，以對氨基酚濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到的線性回歸方程（n=6）為：A=0.5852C+0.0020，r=0.9998。結果表明，對氨基酚在0.8～2.8 μg/ml濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗 精密量取線性試驗項下對氨基酚對照品溶液（2.0 μg/ml）10 μl，連續(xù)進樣6次，記錄對氨基酚峰峰面積，對氨基酚峰峰面積RSD為0.87 %（n=6），結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 檢測限和定量限 取2.3.2項中2.0 μg/ml的對氨基酚對照品溶液，用流動相逐級稀釋，按上述色譜條件進樣10 μl，以信噪比為3:1時測得對氨基酚的最低檢測濃度為0.05 μg/ml，即最低檢測限為0.05 μg；以信噪比為10:1時測得對氨基酚的定量檢測濃度為0.20 μg/ml，即定量限為0.20 μg。

2.3.5 回收率試驗 精密稱取樣品細粉適量（成人規(guī)格、兒童規(guī)格）（相當于對乙酰氨基酚100 mg）共9份，分為3組，分別置入5 ml量瓶，每組加入0.1 mg/ml的對氨基酚對照品溶液0.8，1，1.2 ml（各3份），用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾。分別精密量取上述溶液各1 ml，置入10 ml量瓶，用流動相稀釋至刻度，分別制得對氨基酚濃度為1.6，2.0，2.4 μg/ml的3組加標溶液。取上述加標溶液，按2.2項色譜條件測定含量，記錄色譜，計算回收率，結果見表1～2。

表1 回收率試驗結果（n=9）（成人規(guī)格）

表2 回收率試驗結果（n=9）（兒童規(guī)格）

2.3.6 耐用性試驗 取含對氨基酚2.0 μg/ml成人規(guī)格的和兒童規(guī)格的供試品加標溶液，另取兩根250 mm（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱（Phenomenex Kinetex C18、Agilent ZORBAX SBAq C18）和兩根150 mm（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱（Phenomenex Luna C18、Waters SunFire C18），分別精密吸取供試品加標溶液和對照品溶液各10 μl按2.2項下色譜條件測定。

在更換色譜柱后，對氨基酚峰的保留時間變化范圍較大，約4.763～7.817 min。在不同色譜柱上，僅對流動相組成比例（分別考察95:5和98:2兩個比例）與柱溫（分別考察25和35 ℃）稍作調整，對氨基酚峰均可與其他峰分離良好（分離度＞1.5），分離效果、理論板數(shù)均符合要求，表明系統(tǒng)耐用性較好。供試品加標溶液色譜圖見圖2～3。

圖2 供試品加標溶液色譜圖（成人規(guī)格）

圖3 供試品加標溶液色譜圖（兒童規(guī)格）

2.4 樣品含量測定

取成人規(guī)格2批和兒童規(guī)格1批的的復方氨酚葡鋅片，依法制備供試品溶液。精密量取各溶液10 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算對氨基酚的含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n=2）

3 討論

3.1 流動相的選擇和干擾峰溯源

本研究分別考察了《中國藥典》2020年版二部[5]對乙酰氨基酚有關物質檢測項及其相關制劑標準中對氨基酚檢查項下的色譜條件，經調整流動相比例發(fā)現(xiàn)，以0.05 mol/ml醋酸銨溶液-甲醇（97:3）為流動相和溶劑時對氨基酚色譜峰分離較好，對氨基酚峰的出峰時間可延長至6 min（圖4），但對氨基酚峰受其他峰干擾嚴重，達不到基線分離，經干擾峰溯源發(fā)現(xiàn)，干擾峰均來自復方氨酚葡鋅片處方成分之一板藍根浸膏粉（圖5）。

圖4 對氨基酚對照品（A）和供試品溶液（B）色譜圖（以流動相為溶劑）

圖5 板藍根浸膏溶液色譜圖（以流動相為溶劑）

3.2 檢測波長的選擇

本研究使用紫外分光光度法對對氨基酚對照品溶液在190～600 nm波長范圍內進行掃描。結果表明，對氨基酚在230nm處有較好的吸收，故選擇230 nm作為檢測波長。

3.3 提取溶劑的選擇

復方氨酚葡鋅片是由1個中藥浸膏成分和3種西藥成分共同組成的復方制劑，由于中藥成分的復雜性，且處方中板藍根浸膏占比較大，對氨基酚是對乙酰氨基酚的特殊雜質，含量較低，上述問題給對氨基酚的檢出帶來較大困難。實驗表明，主要干擾來源于板藍根浸膏（圖5），為了去除板藍根浸膏的干擾，查詢板藍根浸膏的制備工藝可知，板藍根浸膏是采用“水提醇沉（60 %乙醇）”法制備。本研究嘗試用60 %乙醇和無水乙醇作為提取溶劑，結果表明，以無水乙醇為提取溶劑時，可完全去除板藍根浸膏的干擾（圖1，C～D）。

3.4 樣品制備方法和進樣體積的選擇[9-10]

以無水乙醇作為提取溶劑，可完全去除板藍根浸膏的干擾，但對氨基酚對照品峰由于溶劑作用，出現(xiàn)肩縫。當以流動相作為對氨基酚對照品的溶劑時，對氨基酚峰峰形良好，故采用先用無水乙醇提取以去除其他峰的干擾，再用流動相稀釋的方法制備對照品溶液和供試品溶液。經考察，用無水乙醇提取后，再用流動相稀釋時，將對照品溶液和供試品溶液中的乙醇濃度控制在10 %以下，進樣量為10 μl時，不僅可以去除供試品中板藍根浸膏峰的干擾（圖1，C～D），同時也可使對氨基酚峰峰形良好（圖6A，圖7A）。

圖6 不同乙醇終濃度對氨基酚對照品溶液色譜圖（A：10 %，B：20 %）

圖7 不同進樣體積對氨基酚對照品溶液色譜圖（A：10 μl，B：20 μl）

4 小結

綜上所述，本研究建立的復方氨酚葡鋅片中有關物質對氨基酚的HPLC檢查法，經方法學驗證，本法具有前處理簡便、快捷、方法準確的特點，且靈敏度高，適用于復方氨酚葡鋅片中對氨基酚檢測，有利于復方氨酚葡鋅片的質量控制。