秦 天，馬燕燕，董常娥，武文龍，司鑫鑫，史大華

(江蘇海洋大學 藥學院，江蘇 連云港 222005)

癌癥目前的致死率僅次于心血管疾病[1]。研究表明，多靶點配體可同時調控不同靶點用于癌癥治療，比單靶點藥物具有更大的治療優(yōu)勢[2-3]。許多多靶點藥物已經(jīng)被設計和合成用于治療癌癥[4-5]。Topo Ⅱα是DNA雙鏈裂解[6]過程中的關鍵酶，在不同的癌細胞中過量表達。已有研究表明，抑制Topo Ⅱα可以致使雙鏈DNA斷裂或ATP水解阻斷，最終使細胞生長停滯在G1，S和G2期或者直接誘導凋亡[7]。一些1,4-萘醌衍生物被報道具有Topo Ⅱα抑制活性，如散沫花的活性染料成分散沫花素，已被鑒定為有效的抗癌化合物，具有Topo Ⅱα抑制活性[8-10](見圖1)。p21蛋白是一種重要的細胞周期調控蛋白，它參與細胞的生長、分化、衰老及死亡過程，同時又與腫瘤發(fā)生密切相關，在細胞的生理、病理過程中發(fā)揮著重要的作用[11]。p21蛋白能夠與cyclin D/cdk形成復合物[12]，還可以通過C端與PCNA相互作用，阻斷PCNA活化DNA聚合酶的活性從而抑制DNA的合成，使腫瘤細胞周期停滯在G1期[13]。苯乙酸是一種苯丙氨酸的脫氨基產(chǎn)物,能抑制p21蛋白異戊二烯化,從而對腫瘤細胞有較強的增殖抑制和誘導分化作用[14]。

圖1 1,4-萘醌衍生物的設計

為了找到治療癌癥的新型1,4-萘醌衍生物，本文將1,4-萘醌(散沫花素的藥效基因)與苯乙酸經(jīng)縮合反應合成兩個1,4-萘醌苯乙酸衍生物，合成化合物對人乳腺癌細胞MCF-7和人肝癌細胞Bel-7402的抗增殖活性采用CCK-8法[15]進行檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Tensor 27型紅外光譜儀，瑞士Bruker公司；AVANCE Ⅲ-400型核磁共振儀，瑞士Bruker公司；Synapt G2型UPLC-TOF-MS質譜儀，美國Waters公司；柱層析硅膠(300～400目)購自青島海洋化工有限公司；薄層色譜采用硅膠GF-254預涂板，購自煙臺化學工業(yè)所。所有試劑均為市售，除非另有說明，否則使用時未作進一步純化。

1.2 化合物設計

如圖2所示，所設計化合物分為3部分，分別是1,4-萘醌基團(A環(huán))、連接基團和苯乙酸部分(B環(huán))。根據(jù)此前的分子對接研究結果，1,4-萘醌基團的羰基在與Topo Ⅱα的相互作用中起關鍵作用，形成多個氫鍵從而增大對Topo Ⅱα的選擇性。本研究利用酰胺鍵作為連接基團，原因是酰胺分子體積較小，可能利于插入Topo Ⅱα活性結合中段的狹窄區(qū)域。此外，酰胺鍵存在很多氫鍵受體，更易與相應靶向蛋白形成氫鍵，使之與結合口袋的結合能力增強，因此選用酰胺作為連接基團，以確保連接基團活性最優(yōu)。本研究在B環(huán)苯乙酸上引入不同體積的取代基以考察空間位阻因素對活性的影響。

圖2 1,4-萘醌衍生物的結構

1.3 化合物合成

本文合成化合物的初始原料為1,4-萘醌(1)，如圖3所示，將原料1和對苯二胺溶于無水乙醇，在室溫下反應8 h得到中間體化合物2[16]。然后，將兩個含有不同取代基的苯乙酸與縮合劑HATU、縛酸劑DIPEA溶入二氯甲烷中，冰浴攪拌2 h活化后再投入中間體化合物2，反應12 h后得終產(chǎn)物3a和3b[17]。目標化合物結構如圖4所示，均經(jīng)1H NMR,13C NMR和HRMS確證。

圖3 目標化合物的合成路線

圖4 化合物3a和3b的化學結構

N-(4-((1,4-二氧基-1,4-二氫萘-2-基)氨基)苯基)-2-(4-硝基苯基)乙酰胺(3a)，深紅色固體,熔點279～281 ℃，收率75%。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)，δ：10.40(s，1H)，9.21(s，1H)，8.26～8.20(m，2H)，8.07(d，J=7.7 Hz，1H)，7.96(d，J=7.6 Hz，1H)，7.89～7.85(m，1H)，7.79(td，J=7.6，1.4 Hz，1H)，7.69～7.61(m，4H)，7.37～7.31(m，2H)，6.05(s，1H),3.86(s，2H)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)，δ：182.9，182.1，166.5，149.9，146.6，139.0，136.2，136.1，135.6，135.3，133.3，133.1，132.9，130.8，130.1，126.5，125.7，121.1，119.5，111.8，111.7，109.0，102.5，55.3。HRMS(ESI)，C24H17N3O5,m/z(實測值(計算值)):428.124 5(428.124 6)[M+H]+。

2-(2，4-二氯苯基)-N-(4-((1，4-二氧基-1，4-二氫萘-2-基)氨基)苯基)乙酰胺(3b)，深紅色固體，熔點247～249 ℃，收率68%。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)，δ：10.36(s，1H)，9.22(s，1H)，8.07(dd，J=7.6，1.4 Hz，1H)，7.96(dd，J=7.7，1.3 Hz，1H)，7.87(td，J=7.5，1.4 Hz，1H)，7.79(td，J=7.5，1.4 Hz，1H)，7.68～7.65(m，2H)，7.63(d，J=2.1 Hz，1H)，7.48(d，J=8.3 Hz，1H)，7.43(dd，J=8.3，2.2 Hz，1H)，7.36～7.32(m，2H)，6.05(s，1H)，3.87(s，2H)。13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)，δ：182.9，182.8，167.9，146.7，136.9，135.3，135.6，133.9，133.6，133.6，133.2，132.9，132.7，130.9，128.9，127.7，126.5，126.4，125.8，125.7，124.8，120.3，114.6，102.1。HRMS(ESI)，C24H16Cl2N2O3，m/z(實測值(計算值)):451.061 2(451.061 6)[M+H]+。

1.4 化合物抗腫瘤活性研究

1,4-萘醌苯乙酸衍生物對體外細胞毒活性通過CCK-8法對Bel-7402細胞進行測定。細胞接種于96孔板中，密度為5×103個/孔，CO2(體積分數(shù)5%)培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，更換為DMSO和所需濃度的化合物孵育48 h。然后在每個孔中加入10 μL CCK-8溶液在37 ℃，5%CO2孵箱中孵育2 h。最后，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度，計算細胞存活率。

2 結果和討論

2.1 目標物的合成

關于實驗反應條件，由中間體化合物2合成化合物3a，3b，使用二異丙基乙胺(DIPEA)作為縛酸劑，既能夠提供堿性反應環(huán)境，相較于三乙胺還可以減少同分異構體的生成。由于二氯甲烷對苯乙酸的溶解性較好，故將其確定為溶劑。初始反應時間分別為8，12和24 h，同時利用TLC監(jiān)測反應物濃度。結果發(fā)現(xiàn)反應在12 h后已較為完全，最終確定反應時間為12 h。在酰胺縮合劑的選擇上，多次實驗發(fā)現(xiàn)縮合劑N,N′-羰基二咪唑(CDI)會在反應完成后產(chǎn)生咪唑類雜質，反應縮合劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)會產(chǎn)生無熒光雜質二環(huán)己基脲(DCU)，上述兩種縮合劑的雜質均不易除去。EDCI雖反應較快，但反應雜質過多，不利于終產(chǎn)物的分離。最終確定HATU為縮合劑，其反應后處理簡單，反應活性較強，產(chǎn)物易分離。

2.2 抗腫瘤活性評價

用CCK-8法評價目標化合物3a，3b，對人乳腺癌細胞MCF-7和人肝癌細胞Bel-7402進行抑制活性研究，所得數(shù)據(jù)見表1。

表1 目標化合物對MCF-7和Bel-7402的抑制活性

化合物3a對MCF-7的抑制率為27.32%，對Bel-7402的抑制率為14.83%。3b對MCF-7的抑制率為29.15%，對Bel-7402的抑制率為22.06%。與陽性對照物順鉑相比，化合物3a，3b對MCF-7的抑制作用略高于順鉑，對Bel-7402的抑制作用低于順鉑。兩個化合物均展現(xiàn)出了中等抑制活性(抑制率達到10%～80%為中等抑制活性)。3b對MCF-7和Bel-7402的抑制作用略高于3a，其在B環(huán)苯乙酸部分多了一個吸電子基團，說明B環(huán)吸電子基團的數(shù)量會對化合物的腫瘤細胞抑制活性產(chǎn)生影響。

3 結論

本文設計并合成了兩個1,4-萘醌苯乙酸衍生物，利用CCK-8法評價了所合成的化合物對人乳腺癌細胞MCF-7和人肝癌細胞Bel-7402的抑制活性，結果表明兩個化合物均展現(xiàn)出了中等抑制活性。綜上所述，化合物3a，3b是一個具有進一步研究潛力的化合物，它將有助于抗腫瘤藥物開發(fā)。