趙昕悅，劉 妍，孟祥偉，黨 斌，薛 瑩，李 航，李 備，侯 寧，李春艷*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.長(zhǎng)春長(zhǎng)光辰英生物科學(xué)儀器有限公司，長(zhǎng)春 130033）

近年來(lái)，我國(guó)畜禽養(yǎng)殖廢水大量排放給環(huán)境治理帶來(lái)巨大壓力。以養(yǎng)豬廢水為例，未經(jīng)處理的廢水中氮、磷含量較高，如果不加以處理，排入水體后導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，對(duì)人體造成巨大危害。當(dāng)前的傳統(tǒng)畜禽養(yǎng)殖廢水處理方法主要包括物化法和微生物法兩種[1]。物化方法對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水中氨氮、總磷、COD、重金屬有一定去除能力，但處理成本高，缺少實(shí)際應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，目前仍處于測(cè)試階段[2]。微生物法雖對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水中COD 去除效率較高，但對(duì)氮、磷去除效果并不理想，且運(yùn)行過(guò)程復(fù)雜，設(shè)備構(gòu)建成本高，占地面積大，資源化產(chǎn)物產(chǎn)率低[1]。例如，李東偉等采用投藥氣浮-UASB-SBR 組合工藝處理馬鈴薯淀粉廢水，出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)排放，但運(yùn)行過(guò)程中僅提取約4.0 kg·t-1蛋白飼料,資源化利用效率明顯偏低[3]。

近年來(lái)微藻處理模式日益受關(guān)注。微藻種類多，廣泛存在于自然界各類水環(huán)境中，具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、養(yǎng)殖成本低、光和效率高、對(duì)氮磷耐受力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[4]。微藻在合適溫度和光照等條件下利用養(yǎng)豬廢水，收獲較高生物質(zhì)產(chǎn)量。微藻還可高效去除廢水中COD、氮、磷等污染物，同時(shí)產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)、多糖、油脂等生物質(zhì)能源，這些資源化產(chǎn)物可作為飼料、肥料、生物質(zhì)燃料等[5]。因此，將廢水處理與微藻培養(yǎng)相結(jié)合，將是畜禽養(yǎng)殖廢水處理領(lǐng)域未來(lái)發(fā)展方向。

利用廢水培養(yǎng)微藻并生產(chǎn)蛋白質(zhì)、多糖、油脂、色素、維生素等有價(jià)值化合物，并應(yīng)用于生產(chǎn)化妝品、食品、飼料、藥物等是目前微藻研究中一個(gè)十分重要且極具前景的領(lǐng)域。本文研究的眾多資源化產(chǎn)物已在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮不同作用，其中酶制劑生產(chǎn)和利用是蛋白質(zhì)資源化利用的新興方向；微藻蛋白中存在許多活性肽和多糖成分，由于高價(jià)值多肽和復(fù)合多糖在抗氧化和抗腫瘤方面存在較大效用，例如，黃永梅等從海洋微藻中分離出多肽和多糖，這些活性物質(zhì)對(duì)結(jié)腸直腸癌癥起到一定預(yù)防作用[6]；此外，利用微藻生產(chǎn)生物柴油也是一種高效的生物質(zhì)能獲取方法，通常利用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)、超臨界甲醇脂交換法或高溫高壓液化技術(shù)將微藻產(chǎn)生的油脂轉(zhuǎn)化成生物柴油，并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[7-8]。

本研究利用單細(xì)胞分選儀PRECI SCS（型號(hào)HOOKE P30）直接分選目標(biāo)單細(xì)胞微藻ZM-3，單細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。研究篩選微藻ZM-3理化性質(zhì)，探索ZM-3 產(chǎn)油脂、蛋白質(zhì)及多糖能力。通過(guò)單因素試驗(yàn)，從溫度、pH、廢水濃度、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、碳氮比等方面，研究養(yǎng)豬廢水中COD、總氮、總磷含量，研究不同條件變化對(duì)微藻降解養(yǎng)豬廢水能力的影響。本研究可為基于微藻培養(yǎng)的蓄禽養(yǎng)殖廢水處理技術(shù)提供理想藻種和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)試劑：酒石酸銻氧鉀、氫氧化鈉、氯化氫、硫酸、抗壞血酸、過(guò)硫酸鉀、重鉻酸鉀、鉬酸銨等，其中化學(xué)試劑純度均為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水。

試驗(yàn)儀器：?jiǎn)渭?xì)胞分選儀器（型號(hào)HOOKE P30）、生化培養(yǎng)箱（型號(hào)BSP-100）、可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)UV-1800PC）、磁力攪拌器（型號(hào)MSB-1C）、COD 消解儀（型號(hào)58-3C）、高溫滅菌鍋（型號(hào)LDZX-30KBS）、離心機(jī)（5417R）和水浴鍋（DK-24）等。

樣品采集：試驗(yàn)所需微藻源為哈爾濱周邊哈爾濱市三寶種豬場(chǎng)附近人工濕地水體。

微藻培養(yǎng)基：采用BG-11 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組分為1.5 g·L-1NaNO3；0.075 g·L-1MgSO4·7H2O；0.036 g·L-1CaCl2·2H2O；0.006 g·L-1C6H8O7；0.006 g·L-1C6H8FeNO7；0.000049 g·L-1Co(NO3)2·6H2O；0.000079 g·L-1CuSO4·5H2O；0.001 g·L-1EDTA；0.00286 g·L-1H3BO3；0.04 g·L-1K2HPO4·3H2O；0.02 g·L-1Na2CO3；0.00039 g·L-1Na2MoO4·2H2O；0.00181 g·L-1MnCl2·H2O；0.000222 g·L-1ZnSO4·7H2O。

養(yǎng)豬廢水：試驗(yàn)所用養(yǎng)豬廢水配方及成分見(jiàn)表1。

表1 不同初始COD濃度養(yǎng)豬廢水指標(biāo)Table 1 Piggery wastewater index with different initial COD concentrations （g）

1.2 方法

1.2.1 單細(xì)胞分選

本研究利用激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移（Laser-induced forward transfer，LIFT）單細(xì)胞分選技術(shù)，將收集水樣充分混合均勻，取0.5 μL 樣品于分選芯片上，通過(guò)單細(xì)胞分選儀收集細(xì)胞顯微成像。其后，在顯微成像中定位目標(biāo)微藻單細(xì)胞并分離和接收單細(xì)胞。將接收器接收的微藻單細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有3.0 g·L-1葡萄糖BG-11 液體培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)管中，置于振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃，400 r·min-1轉(zhuǎn)速，24 h 光照培養(yǎng)。若單細(xì)胞成功增殖，則將此藻液繼續(xù)轉(zhuǎn)移至含有3.0 g·L-1葡萄糖BG-11 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。從擴(kuò)大培養(yǎng)后藻液中轉(zhuǎn)移15 μL藻液于BG-11 固體培養(yǎng)基中開(kāi)展三區(qū)劃線，直至出現(xiàn)單藻落。

1.2.2 目標(biāo)微藻18S rRNA鑒定

在含有BG-11 固體培養(yǎng)基平板上取三代純化后單藻落，使用Easy Pure TM Plant Genomic DNA Kit（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取微藻總DNA，采用通用引物18SF（5'CCTGGTTGATCCTG CCAG 3'）和18SR（5'TTGATCCTTCTGCAGGTTCA 3'）作PCR 擴(kuò)增后，送至北京六合華大基因科技有限公司作18S rRNA 測(cè)序。測(cè)序序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中作Blast比對(duì)分析，采用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 微藻生物量測(cè)定

本研究采用光密度（OD）法測(cè)定微藻生物量，將藻液室溫培養(yǎng)42 h，每隔2 h在波長(zhǎng)680 nm處測(cè)量藻液OD值，記錄并繪制其生長(zhǎng)曲線[9]。

1.2.4 微藻理化性質(zhì)檢測(cè)

本研究選用考馬斯亮藍(lán)法、蒽酮比色法和有機(jī)溶劑萃取法分別檢測(cè)分析微藻中蛋白質(zhì)、多糖和油脂含量[10-12]。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

選用單因素設(shè)計(jì)研究溫度、pH、養(yǎng)豬廢水濃度、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度和碳氮比對(duì)微藻去除養(yǎng)豬廢水能力的影響。首先，配置養(yǎng)豬廢水，調(diào)節(jié)溶液pH，放入轉(zhuǎn)子后高壓蒸汽滅菌廢水。取10 mL藻液，離心處理后棄上清，將藻細(xì)胞轉(zhuǎn)入養(yǎng)豬廢水中培養(yǎng)，待開(kāi)展試驗(yàn)時(shí)，分別于12、24、36、48、60 h 取樣，每次取樣20 mL，離心取上清，分析微藻去除養(yǎng)豬廢水中COD、TN、TP 能力。其中，按照表2所示控制條件作單因素試驗(yàn)，依次改變溫度、pH、廢水濃度、光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、碳氮比6個(gè)條件，當(dāng)改變?cè)囼?yàn)中某一因素時(shí)，固定其他因素條件不變，探究這6個(gè)環(huán)境因素對(duì)微藻降解廢水中污染物的能力。

表2 單因素試驗(yàn)控制條件Table 2 Single factor experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單細(xì)胞分選

如圖1a和b中分選過(guò)程所示，采用PRECI SCS單細(xì)胞分選儀識(shí)別目標(biāo)藻細(xì)胞，分選前在載物臺(tái)上對(duì)微藻單細(xì)胞完成精準(zhǔn)定位，分選中利用LIFT技術(shù)對(duì)目標(biāo)單細(xì)胞微藻進(jìn)行彈射分選，儀器接收系統(tǒng)自動(dòng)收集目標(biāo)單細(xì)胞，分選后原目標(biāo)藻細(xì)胞位置消失，其他細(xì)胞無(wú)變化。本研究方法是一種非侵入式方法，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞幾乎無(wú)影響，被采集器收集的單細(xì)胞可用于后續(xù)研究。

2.2 微藻ZM-3鑒定

提取微藻ZM-3 基因組DNA，PCR 擴(kuò)增其18S rRNA序列并測(cè)序，通過(guò)NCBI將測(cè)序所得序列進(jìn)行Blast比對(duì)，并用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖1c。結(jié)果顯示，ZM-3 與Desmodesmussp. GM4a（AB917128.1）、Desmodesmussp.GB1a（AB917097.1）、Desmodesmusabundans strain CCAP（MW471025.1）相似，相似度為99.94%。因此，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定該微藻屬于柵藻屬，并將其命名為Desmondesmussp.ZM-3，GenBank登錄號(hào)為MZ570911。

2.3 微藻ZM-3生長(zhǎng)

如圖1d 中所示，在42 h 內(nèi)培養(yǎng)并測(cè)定微藻ZM-3 光密度，發(fā)現(xiàn)其OD680在0.035～0.237 之間變化。在2～28 h內(nèi)OD680呈持續(xù)增加趨勢(shì)，由0.035指數(shù)增長(zhǎng)至0.237，因?yàn)槲⒃錤M-3 在短暫調(diào)整期過(guò)后立即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；而28～32 h微藻生長(zhǎng)保持穩(wěn)定狀態(tài)，OD680保持不變；在32 h 后OD680呈急速下降趨勢(shì)，微藻進(jìn)入衰亡期。

圖1 ZM-3分選、培養(yǎng)及鑒定Fig.1 Sorting,culture,and identification of ZM-3

2.4 理化性質(zhì)

微藻收集方式包括離心法、沉淀法、絮凝法等，本研究采用獲取微藻效率最高的離心法回收藻種。理化性質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果表明，柵藻ZM-3在處理養(yǎng)豬廢水同時(shí)，每克細(xì)胞還產(chǎn)生蛋白質(zhì)201.9 mg、多糖139.1 mg 和油脂41.5 mg。與其他研究[13-14]相比，本研究選用微藻產(chǎn)蛋白能力較強(qiáng)，產(chǎn)多糖能力次之，并產(chǎn)生少量油脂。

在藻細(xì)胞中，蛋白質(zhì)是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)主要成分，且在生產(chǎn)代謝中發(fā)揮十分重要作用，例如藻蛋白可作為光合作用催化酶。本研究分選得到ZM-3是一株產(chǎn)蛋白微藻，可在廢水處理同時(shí)產(chǎn)生201.9 mg·g-1蛋白質(zhì)。

此外，碳水化合物可附著在蛋白質(zhì)或脂類上形成復(fù)合多糖，成為微藻細(xì)胞資源化重要產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，柵藻ZM-3 可產(chǎn)生139.1 mg·g-1多糖，包括單糖、寡糖和多糖等，可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、個(gè)人護(hù)理品、飼料等行業(yè)。本研究選用有機(jī)溶劑萃取法從柵藻ZM-3 中提取41.5 mg·g-1油脂，后續(xù)可繼續(xù)轉(zhuǎn)化為生物燃料，如生物柴油、生物質(zhì)油、乙醇、脂肪酸、氫氣等。

2.5 不同條件柵藻ZM-3對(duì)養(yǎng)豬廢水降解能力研究

2.5.1 不同溫度

溫度是影響柵藻生長(zhǎng)代謝最重要因素之一，柵藻生長(zhǎng)最適溫度一般為22～30 ℃[15]。由圖2 可知，不同溫度下柵藻ZM-3 對(duì)養(yǎng)豬廢水中COD、TN、TP 降解能力相似，升高溫度可提高柵藻ZM-3 降解污染物能力，但過(guò)高溫度也導(dǎo)致微藻對(duì)COD、TN、TP 降解率降低，因此存在一個(gè)最適溫度區(qū)間。在20～30 ℃時(shí)，ZM-3 對(duì)養(yǎng)豬廢水中COD、TN、TP 去除率均呈現(xiàn)較高水平，在這一溫度范圍內(nèi)柵藻生長(zhǎng)代謝速度快、生物量高，因此降解效率高，超過(guò)30 ℃后去除率均有所下降。在24 h，溫度30 ℃時(shí)，ZM-3 對(duì)COD、TN、TP 降解率最高，分別達(dá)到62.57%、44.26%、55.82%，因此，在實(shí)際應(yīng)用中控制溫度條件在25～35 ℃，更有利于柵藻ZM-3去除廢水中COD、TN、TP。

圖2 不同溫度對(duì)柵藻ZM-3降解養(yǎng)豬廢水能力的影響Fig.2 Effects of different temperatures on the ability of ZM-3 to degrade pig wastewater

2.5.2 不同pH

pH 作為一種常見(jiàn)環(huán)境因子，也對(duì)柵藻生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生較大影響，柵藻生長(zhǎng)最適pH在6～8。李飛等提出微藻生長(zhǎng)中無(wú)機(jī)碳以重碳酸鹽和碳酸鹽形式存在，生長(zhǎng)過(guò)程中微藻吸收二氧化碳釋放氫氧根，使環(huán)境呈弱堿性；較高pH影響微藻生長(zhǎng)，促進(jìn)氨氮解吸去除和總磷沉淀化[16]。由圖3可知，本研究pH由5升至7時(shí)，COD、TN、TP降解率隨之升高，而繼續(xù)升高pH導(dǎo)致降解率有所下降，這可能是因偏堿性環(huán)境影響柵藻某種胞外酶活性從而危害其生長(zhǎng)代謝所致。綜上所述，柵藻ZM-3 降解COD、TN、TP最適條件為在pH 7時(shí)，最高降解率分別可達(dá)64.75%、45.61%、57.61%。在后續(xù)應(yīng)用中若控制pH在6～8則更利于柵藻ZM-3凈化養(yǎng)豬廢水。

圖3 不同pH對(duì)柵藻ZM-3降解養(yǎng)豬廢水能力的影響Fig.3 Effects of different pH on the ability of ZM-3 to degrade pig wastewater

2.5.3 不同廢水濃度

由于不同養(yǎng)豬廢水濃度影響營(yíng)養(yǎng)元素如碳、氮、磷、鉀、鈉、鎂含量，柵藻生長(zhǎng)代謝直接受到這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的影響，進(jìn)而影響其對(duì)廢水中COD、TN、TP 的降解能力。由圖4 可知，12 h時(shí)，取樣測(cè)得柵藻ZM-3對(duì)廢水降解率隨廢水濃度變化不明顯，結(jié)合圖4生長(zhǎng)曲線變化規(guī)律，這可能是時(shí)間較短導(dǎo)致柵藻在廢水中未穩(wěn)定生長(zhǎng)。12 h后，隨廢水濃度增加，ZM-3 對(duì)養(yǎng)豬廢水中COD、TN、TP 降解率也逐漸提高。Michalis-Menten 酶動(dòng)力模型提出隨廢水濃度升高微藻吸收污染物能力增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，微藻吸收速率趨于穩(wěn)定。本研究中隨廢水濃度升高，柵藻ZM-3 也符合以上規(guī)律，其中柵藻降解污染物最佳廢水濃度為600 mg·L-1，在實(shí)際大規(guī)模廢水處理中可適當(dāng)調(diào)節(jié)水體濃度，實(shí)現(xiàn)柵藻ZM-3高效應(yīng)用。

圖4 不同廢水濃度對(duì)柵藻ZM-3降解養(yǎng)豬廢水能力的影響Fig.4 Effects of different wastewater concentrations on the ability of ZM-3 to degrade pig wastewater

2.5.4 不同光照強(qiáng)度和光照時(shí)間

微藻作為一種光自養(yǎng)型生物，光強(qiáng)和光照時(shí)間直接影響柵藻光合速率，進(jìn)而影響微藻生長(zhǎng)及降解廢水。如圖5 所示，柵藻ZM-3 對(duì)養(yǎng)豬廢水中COD、TN、TP 降解能力與光照強(qiáng)度和光照時(shí)間均呈正比，可能因柵藻ZM-3光合作用直接受光照影響，光合作用過(guò)程中完成COD、TN、TP 的吸收。而在48和60 h時(shí)，隨光強(qiáng)及光照時(shí)間增加，ZM-3對(duì)廢水降解率呈下降趨勢(shì)，一方面可能是光強(qiáng)上升到一定程度造成的光損傷有損微藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低微藻生物量積累，進(jìn)而導(dǎo)致微藻對(duì)廢水降解能力變低[17]；另一方面可能是微藻密度過(guò)高遮擋光透射，產(chǎn)生光抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致藻生物量降低，影響微藻對(duì)廢水中污染物的降解[18]。綜合試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，柵藻ZM-3 在光照強(qiáng)度6 000 lx 和光照時(shí)間24 h 時(shí)，對(duì)COD、TN、TP 最高降解率分別可達(dá)62.57%，44.26%和55.82%，在實(shí)際應(yīng)用中可控制光照強(qiáng)度在6 000 lx 和光照時(shí)間在24 h。

圖5 不同光照強(qiáng)度和光照時(shí)間對(duì)柵藻ZM-3降解養(yǎng)豬廢水能力的影響Fig.5 Effects of different light intensity and light time on the capacity of ZM-3 to degrade pig wastewater

2.5.5 不同碳氮比

不同碳氮比對(duì)柵藻ZM-3降解養(yǎng)豬廢水能力的影響如圖6 所示，廢水中不同碳氮比對(duì)微藻降解COD、TN 和TP 差異明顯。其中，當(dāng)碳氮比為4∶3時(shí)，微藻ZM-3 對(duì)COD 去除效果最佳，降解率為62.57%；當(dāng)碳氮比為8∶1時(shí)，微藻ZM-3對(duì)TN去除效果最佳，降解率為46.72%；當(dāng)碳氮比為16∶1時(shí)，微藻ZM-3 對(duì)TP 去除效果最佳，降解率為68.34%。范同強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，氮源不足導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)胡蘿卜素及葉綠素含量有所降低[19]，因此可推斷氮含量低會(huì)降低柵藻ZM-3光合速率，其生長(zhǎng)代謝能力隨之減弱。在生產(chǎn)應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際污水處理需求適當(dāng)控制廢水中碳氮比，實(shí)現(xiàn)污水中污染物高效轉(zhuǎn)化。

圖6 不同碳氮比對(duì)柵藻ZM-3降解養(yǎng)豬廢水能力的影響Fig.6 Effects of different C/N ratio on the ability of ZM-3 to degrade pig wastewater

3 討 論

3.1 Desmondesmus sp.ZM-3單細(xì)胞分選

傳統(tǒng)平板劃線分離方法分離周期長(zhǎng)、分離操作密集且不適用于99%以上未培養(yǎng)微生物的分選操作。因此，迫切需要一種高效的微生物分選方法。目前，部分研究采用熒光活化細(xì)胞分選法（Fluorescence-activated cell sorting,FACS）篩選和分離微藻單細(xì)胞。然而，F(xiàn)ACS 在分選過(guò)程中可能破壞脆弱或受壓力的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加單細(xì)胞分選后擴(kuò)大培養(yǎng)難度。利用LIFT 系統(tǒng)可精確定位目標(biāo)單細(xì)胞，直接從復(fù)雜樣本中分離目標(biāo)單細(xì)胞。該系統(tǒng)分選單細(xì)胞無(wú)需外部標(biāo)記分子，可將對(duì)目標(biāo)分離細(xì)胞的負(fù)面影響降到最低，使分選后微藻單細(xì)胞有擴(kuò)大培養(yǎng)的可能。本研究結(jié)果表明，Desmondesmussp.ZM-3 經(jīng)LIFT 系統(tǒng)分選后開(kāi)展大規(guī)模培養(yǎng)。因此，LIFT 系統(tǒng)可作為一種結(jié)合單細(xì)胞分選技術(shù)作微藻分選的新方法。

3.2 Desmondesmus sp. ZM-3 廢水降解及資源化研究

隨環(huán)境友好型需求日益增長(zhǎng)，養(yǎng)豬廢水合理處理和資源化研究逐步成為焦點(diǎn)。生物技術(shù)作為相對(duì)廉價(jià)的處理技術(shù)，如膜生物反應(yīng)器、人工濕地和高速率藻池近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)。但人工濕地等處理技術(shù)僅局限于廢水處理效果。然而，基于微藻的生物處理技術(shù)不僅具有廢水生物修復(fù)能力，且可積累生物質(zhì)組分（蛋白質(zhì)等）。本研究中，Desmondesmussp. ZM-3 對(duì)養(yǎng)豬廢水中碳、氮和磷有較高處理效果，且同時(shí)在藻細(xì)胞中積累具有資源化價(jià)值的生物質(zhì)（油脂41.5 mg·L-1、蛋白201.9 mg·L-1和多糖139.1 mg·L-1）。李亞麗等研究也表明，微藻可有效去除養(yǎng)豬廢水中碳、氮、磷等物質(zhì)，并在能源、食品、藥物等方面具有資源化價(jià)值[20]。與其他研究相比，本研究選用的微藻產(chǎn)蛋白能力較強(qiáng)，產(chǎn)多糖能力次之，并產(chǎn)生少量油脂。結(jié)果表明，Desmondesmussp. ZM-3 在食品和醫(yī)藥方面應(yīng)用價(jià)值較高。

3.2.1 Desmondesmus sp.ZM-3產(chǎn)蛋白

近年關(guān)于產(chǎn)蛋白微藻研究中，王浩華測(cè)定紅藻G.sulphuraria074G 蛋白產(chǎn)率發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)條件下，其蛋白產(chǎn)量可達(dá)到17.25 mg·L-1，而本文所篩選得到柵藻ZM-3 蛋白產(chǎn)量相比074G 仍高出2.94%[21]。D'Este 等以海帶為基質(zhì)培養(yǎng)異養(yǎng)微藻C.protothecoides，其蛋白質(zhì)產(chǎn)量為（0.07±0.06）g·L-1，相對(duì)本研究柵藻ZM-3 蛋白產(chǎn)量低13.1%[22]。微藻蛋白中含有多種活性肽成分，大多是具有高利用價(jià)值的功能活性多肽。此外，微藻蛋白中還含有卵清蛋白、乳球蛋白等優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，是哺乳動(dòng)物無(wú)法合成的必需氨基酸，因此被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）列為21 世紀(jì)綠色食品。李孟研等從微藻裂殖壺菌中酶解得到的肽混合物（MESH）可用于治療水產(chǎn)魚(yú)類腸道炎癥[23]。因此推測(cè)，柵藻ZM-3 中多肽也可能具有抗氧化、抗癌癥功能，且其微藻蛋白在生物制藥、抗氧化功能食品加工和化妝品等領(lǐng)域也將具有一定應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。

3.2.2 Desmondesmus sp.ZM-3產(chǎn)多糖

微藻多糖作為微藻通過(guò)光合及代謝合成的一種有機(jī)質(zhì)，大多具有生物活性。且微藻中多糖種類多樣，研究發(fā)現(xiàn)其主要具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗炎免疫、降血糖、調(diào)血脂等多種生物活性作用[24]。某些多糖還具有抗炎癥和潤(rùn)膚作用，可廣泛應(yīng)用于化妝品中。周妍等研究5 種海洋微藻多糖對(duì)小鼠體外免疫細(xì)胞功能的影響，從中篩選出免疫調(diào)節(jié)活性較強(qiáng)的紫球藻多糖，其具有增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠體外免疫活性功能[25]。因此推測(cè)，ZM-3 產(chǎn)多糖可能具備抗氧化、增強(qiáng)免疫等功能，其應(yīng)用價(jià)值有待發(fā)現(xiàn)及推廣。

3.2.3 Desmondesmus sp.ZM-3產(chǎn)油脂

由微藻產(chǎn)油脂轉(zhuǎn)化而來(lái)的生物燃料可通過(guò)熱裂解生物質(zhì)等技術(shù)得到長(zhǎng)鏈脂肪酸的單烷基酯，是一種非常重要的可再生資源，且效能高、污染少。油脂還以脂肪酸形式形成生物柴油，與動(dòng)植物生產(chǎn)生物柴油相比，微藻產(chǎn)油效率高，不占用耕地，在國(guó)內(nèi)外研究較多[26-27]?？姇粤岬壤卯悩愚D(zhuǎn)化細(xì)胞工程技術(shù)獲取小球藻細(xì)胞，熱解小球藻獲得生物質(zhì)燃油熱值高達(dá)33 MJ·kg-1，油脂含量高達(dá)55%，其后再通過(guò)蒸餾干燥萃取等方式獲得生物柴油[28]。柵藻ZM-3 中也存在此微藻油脂，可通過(guò)同樣手段提取生物柴油用于生產(chǎn)生活。近年來(lái)，世界多家化工石油公司已致力于微藻生產(chǎn)生物柴油領(lǐng)域，雖然目前存在產(chǎn)油率低和成本高等問(wèn)題，但隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，微藻產(chǎn)油在未來(lái)必然會(huì)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段。

3.3 Desmondesmus sp.ZM-3單因素研究

任何軍等研究證實(shí)環(huán)境因素之間的影響并不獨(dú)立，存在相互作用[29]。然而，本研究通過(guò)控制單一環(huán)境因素變化，研究其對(duì)Desmondesmussp.ZM-3降解效果的影響，結(jié)果具有一定局限性。通過(guò)模型綜合研究多環(huán)境因素的相互影響是進(jìn)一步研究方向。此外，如何平衡廢水降解和資源回收可能是一個(gè)有待解決的問(wèn)題。Gu?tin等發(fā)現(xiàn)提高廢水處理效果同時(shí)，資源化效果明顯降低[30]。同時(shí)，也有研究為提高資源化效果，廢水處理效果不甚理想。因此，如何同時(shí)提高生物質(zhì)積累和廢水處理是未來(lái)研究方向。

4 結(jié)論

本研究對(duì)ZM-3開(kāi)展單細(xì)胞分選、18S rRNA鑒定、理化性質(zhì)檢測(cè)和單因素試驗(yàn)，并探討其資源化利用產(chǎn)物應(yīng)用以及環(huán)境因子對(duì)污水降解能力的影響，得到以下結(jié)論：

a.通過(guò)無(wú)需標(biāo)記、快速簡(jiǎn)便的單細(xì)胞分選方式得到目標(biāo)藻細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后經(jīng)18S rRNA 鑒定可知該微藻屬于柵藻屬，并將其命名為Desmondes?mussp.ZM-3。

b. 對(duì)Desmondesmussp. ZM-3 細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、多糖、油脂作定量分析，結(jié)果顯示ZM-3對(duì)廢水資源化利用產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量較高，達(dá)到201.9 mg·g-1，含有多糖139.1 mg·g-1，油脂41.5 mg·g-1。作為一株產(chǎn)蛋白柵藻，ZM-3在食品生產(chǎn)和生物制藥等方面經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。

c.Desmondesmussp. ZM-3 在30 ℃，pH 7，廢水濃度為600 mg·L-1，光照強(qiáng)度6 000 lx，光照時(shí)間24 h條件下，對(duì)養(yǎng)豬廢水中COD、TN、TP 降解率最高。若后續(xù)應(yīng)用柵藻ZM-3開(kāi)展大規(guī)模廢水處理過(guò)程中，控制條件因素指標(biāo)可增強(qiáng)ZM-3對(duì)污染物降解能力，提高污水凈化效率。