林 葉，劉 燦，江 怡，宮曉慶，劉川萍，楊 洋，侯曉明

（東北農(nóng)業(yè)大學動物細胞與遺傳工程黑龍江省重點實驗室，哈爾濱 150030）

乳脂是牛奶中重要營養(yǎng)物質(zhì)，相對于其他脂類更易消化吸收。甘油三酯（Triglyceride，TAG）是乳脂主要成分，在乳脂中約占98%[1]。因此，提高原料乳乳脂率需深入研究奶牛乳腺上皮細胞中TAG 合成調(diào)控機制。TAG 合成受多種基因、關鍵酶調(diào)控。陳坤琳等以中國荷斯坦奶牛為試驗材料發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺上皮細胞中TAG 合成受到PPARγ、SREBP1 等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[2]。溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（Sn-1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransfer?ase 6，AGPAT6）是TAG 合成過程中重要酶，催化溶血磷脂酸?；纬闪字?，隨后磷脂酸在二?；视王；D(zhuǎn)移酶作用下合成TAG[3]。Beigneux等研究發(fā)現(xiàn)AGPAT6 缺陷型小鼠乳腺發(fā)育障礙，乳脂合成和分泌明顯降低，脂質(zhì)代謝失調(diào)，導致磷脂酸、甘油二酯和TAG 合成減少[4-5]。Lee 等和Lv 等在牦牛和豬乳腺研究中發(fā)現(xiàn)AGPAT6 可與其他乳脂合成相關基因協(xié)調(diào)作用促進TAG 合成[6-7]。Kadegowda 等在奶牛乳腺中證明AGPAT6 的mRNA在泌乳期上調(diào)表達[8]，提示其可能在泌乳奶牛乳脂合成過程中具有調(diào)節(jié)作用，但具體功能和調(diào)節(jié)機制尚不明確。

磷脂酰肌醇-3 激酶（Phosphatidylinositol 3 ki?nase，PI3K）可應答外源氨基酸、脂肪酸、激素等營養(yǎng)素刺激[9]，通過激活AKT激酶，促進細胞中蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)生物合成[10-12]。在乳腺中，PI3KAKT信號通路在乳脂合成調(diào)控過程中處于中心樞紐位置。Knudsen 和張娜等研究發(fā)現(xiàn)，外源營養(yǎng)素可通過PI3K- AKT 信號促進下游DGAT1、FABP3、LPIN、SLC22A7 等基因表達上調(diào)，調(diào)控細胞中脂類合成[13-14]。Li等在泌乳的山羊乳腺中已證明短鏈脂肪酸可通過PI3K-AKT-SREBP-1c信號通路促進乳脂合成[15]。Li等研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸也激活牛乳腺上皮細胞中GPRC6A-PI3K-FABP5 信號通路，促進乳脂合成[16]。然而在泌乳奶牛乳腺上皮細胞中，AGPAT6 與PI3K-AKT 信號通路之間關系尚不清楚，AGPAT6 調(diào)節(jié)乳脂合成是否通過PI3K-AKT介導，還需通過試驗驗證。

本研究以不同生理時期奶牛乳腺組織為原料，采用熒光定量PCR 和Western blot 技術首先研究AGPAT6在奶牛乳腺組織中表達模式，隨后利用乙酸誘導具有乳脂合成能力的奶牛乳腺上皮細胞模型，研究AGPAT6過表達或抑制對乳脂合成的調(diào)節(jié)以及AGPAT6與PI3K-AKT-mTOR信號通路激活和乳脂合成之間關系，旨在闡明AGPAT6在奶牛乳腺乳脂合成中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：Ⅰ型膠原酶（購自上海Sigma），DMEM/F 12（購自美國Life technology），細胞總RNA微量抽提試劑盒（購自廣州美基生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自思科捷生物技術有限公司），TAG檢測試劑盒（購自北京普利來基因技術有限公司），BCA 濃度檢測試劑盒（購自大連TaKaRa），EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶（購自美國Ther?mo），Lipofectamine 2000（購自美國Invitrogen），siRNA-mate、AGPAT6 siRNA（購自上海吉瑪基因），AGPAT6 抗體（購自美國Proteintech），β-ACTIN 抗體（購自武漢ABclonal），AKT、mTOR、P70S6K、4E-BP1、p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K、p-4E-BP1（購自美國Cell Signaling Technology）。

主要儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱（購自美國Ther?mo），DFC280 倒置顯微鏡（購自德國Leica），PCR儀（購自美國Eppendoff），Real Time PCR system（購自美國Applied Biosystems），酶標儀（購自美國Thermo），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（購自北京賽智生物制品有限公司）。

1.2 奶牛乳腺組織獲取

取健康新鮮青春期12月、泌乳90日以及干奶30日奶牛乳腺組織，75% 乙醇消毒后，反復清洗；在無菌環(huán)境下去除結(jié)締組織和脂肪組織，剪成約1 cm3小塊置于液氮中速凍，-80 ℃保存，用于后續(xù)RNA和蛋白提取。

1.3 熒光定量PCR檢測乳腺組織中AGPAT6表達

將乳腺組織用液氮研磨至粉末，利用組織/細胞RNA 微量提取試劑盒提取不同時期乳腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用熒光定量PCR方法檢測AGPAT6 mRNA在不同生理時期表達情況。所用AGPAT6和β-ACTIN基因引物如表1所示。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of quantitative PCR primer

反應循環(huán)條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40 個循環(huán)，以β-ACTIN 的CT 值為內(nèi)參，AGPAT6 基因表達量計算方法為2-ΔΔCT，ΔCT=CTAGPAT6-CTβ-ACTIN。

1.4 奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)、純化與鑒定

采用膠原酶消化法從健康泌乳期奶牛乳腺實體組織中分離乳腺上皮細胞[17]。將剪碎的乳腺組織用膠原酶在37 ℃下消化3 h，過濾后室溫下1 000 g離心3次，每次10 min。將原代細胞置于含10% 胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)液中，同時添加青霉素（100 U·mL-1）、鏈霉素（100 μg·mL-1），放置在5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待單層細胞鋪滿培養(yǎng)皿后用胰蛋白酶消化，傳代3次后即可獲得純化乳腺上皮細胞。

將1×105個純化后細胞接種至3.5 cm 培養(yǎng)皿中，用4%多聚甲醛固定后加入5%BSA 的PBST 溶液進行封閉，然后用角蛋白18（Keratin 18，CK18）抗體（兔源，1∶50 稀釋）4 ℃孵育過夜，清洗一抗后用FITC 標記山羊抗兔的二抗（1∶200 稀釋）孵育1 h，用1 μg·mL-1DAPI 染細胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察CK18在細胞中表達。將純化的乳腺上皮細胞接種于6 孔板中，待細胞生長至70% 融合單層用無脂無血清培養(yǎng)液饑餓過夜，然后更換新的含12 mmol·L-1乙酸鈉無脂無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，誘導細胞中脂類合成后用于后續(xù)試驗。

1.5 AGPAT6表達載體構建

設計AGPAT6 基因特異性引物（見表2），以牛cDNA 為模板擴增牛AGPAT6 基因。將擴增序列和pcDNA3.1載體分別作EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切后連接構建重組體pcDNA3.1-AGPAT6，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。構建重組體送至哈爾濱擎科生物公司測序，利用DNAMAN軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列作比對。

表2 PCR引物序列Table 2 Sequences of PCR primer

1.6 轉(zhuǎn)染

當細胞中AGPAT6 過表達時，將2×105個乳腺上皮細胞接種到6 孔板中，待其密度接近70%時采用Lipofectamine 2000 將2.5 μg pcDNA3.1-AG?PAT6 載體轉(zhuǎn)染至細胞中，以pcDNA3.1（+）作為對照；當AGPAT6 過表達同時抑制PI3K 時，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-AGPAT6 的細胞中加入50 μmol·L-1LY294002，對照組中加入等量DMSO，48 h進行后續(xù)檢測；當干擾細胞中AGPAT6表達時，利用siR?NA-mate將6 μL siAGPAT6（20 μmol·L-1）轉(zhuǎn)染至細胞中，以Negative control（20 μmol·L-1）為對照，轉(zhuǎn)染后細胞繼續(xù)在37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h作后續(xù)檢測；AGPAT6 siRNA干擾片段序列見表3。

表3 干擾片段序列Table 3 Sequences of interfering fragments

1.7 Western blot 檢測AGPAT6 及相關信號通路分子表達

收集奶牛乳腺組織，用液氮研磨至粉末狀態(tài)后，加入適當裂解液低溫充分裂解混勻組織，12 000 r·min-1離心10 min，取上清備用；對不同處理奶牛乳腺上皮細胞，采用適當細胞裂解液低溫裂解細胞，12 000 r·min-1離心10 min，取上清備用。采用BCA 濃度測定試劑盒測定乳腺組織或乳腺上皮細胞總蛋白濃度，然后將20 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至NC膜。NC膜用含5%脫脂乳、0.1%（V/V）Tween-20的Tris緩沖液封閉2 h，然后與AGPAT6、AKT、mTOR、P70S6K、4E-BP1、p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K、p-4EBP1特異性抗體（所有抗體皆為兔源，1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜。將NC 膜用TBST 沖洗3 次后，用FITC標記的山羊抗兔IgG 37 ℃下孵育1 h。TBST洗滌NC膜，采用增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測印跡。

1.8 TAG 含量測定

裂解液低溫處理細胞約10 min，短暫離心后收集上清，普利萊TAG 檢測試劑盒測定不同處理牛乳腺上皮細胞TAG 含量；相應細胞樣品蛋白濃度由BCA 濃度檢測試劑盒測定，每個處理重復3 次，最終結(jié)果由細胞中總TAG 含量（mg）除以細胞總蛋白（mg）含量表示。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗所用PCR 引物由PREMIER 5.0 軟件設計；Western blot 條帶使用Image-Pro Plus 6.0 灰度掃描；試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，采用GraphPad Prism 6 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。使用t-檢驗方法比較2組數(shù)據(jù)；使用單因素方差分析以及Bon?ferroni 多重比較方法分析3組以上數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGPAT6在奶牛乳腺組織中表達

為比較AGPAT6基因在奶牛不同生理時期乳腺組織中表達，本試驗首先通過熒光定量PCR方法檢測青春期、泌乳期及干奶期奶牛乳腺組織中AGPAT6基因mRNA 水平表達變化。結(jié)果如圖1A 所示，AGPAT6 mRNA在泌乳期奶牛乳腺組織中表達極顯著高于青春期和干奶期（P＜0.01）。隨后采用Western blot方法檢測不同生理時期奶牛乳腺組織中AGPAT6蛋白水平表達變化，以β-ACTIN為內(nèi)參。結(jié)果顯示AGPAT6在泌乳期奶牛乳腺組織中表達極顯著高于青春期和干奶期（見圖1B、C，P＜0.01）。

圖1 奶牛乳腺組織中AGPAT6的表達Fig.1 Expression of AGPAT6 in mammary tissues of dairy cows

2.2 奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)與鑒定

本研究采用膠原酶消化法獲得原代奶牛乳腺上皮細胞。圖2A 顯示相差顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)呈現(xiàn)島嶼狀。由于CK18是奶牛乳腺上皮細胞標志性表達蛋白，所以采用免疫熒光方法檢測是否純化出奶牛乳腺上皮細胞，結(jié)果顯示細胞核呈藍色（見圖2B-a），綠色標記的CK18分布于細胞質(zhì)中（見圖2Bb），表明該細胞為已純化的奶牛乳腺上皮細胞（見圖2B）。用12 mmol·L-1乙酸鈉作用于奶牛乳腺上皮細胞，Western blot結(jié)果顯示12 mmol·L-1乙酸鈉處理細胞中AGPAT6表達比對照組高約52%（見圖2C、D），細胞中TAG含量也極顯著增加（見圖2E；P＜0.01），提示乙酸鈉可誘導奶牛乳腺上皮細胞中AGPAT6表達上調(diào)及TAG 合成，因此這種細胞模型可用于AGPAT6對奶牛乳腺上皮細胞乳脂合成的調(diào)節(jié)研究。

圖2 奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)鑒定及乙酸鈉對乳脂合成的影響Fig.2 Identification of mammary epithelial cells of dairy cows and the effect of sodium acetate on AGPAT6 expression and milk fat synthesis

2.3 AGPAT6 基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ毎橹铣傻挠绊?/h3>

為研究AGPAT6基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ毎橹铣捎绊懀狙芯繉⑴cDNA3.1-AGPAT6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至乙酸鈉處理的奶牛乳腺上皮細胞，以pcD?NA3.1（+）作為陰性對照。Western blot 結(jié)果顯示pcDNA3.1-AGPAT6 轉(zhuǎn)染的奶牛乳腺上皮細胞中AGPAT6 表達極顯著高于對照組（見圖3A、B；P＜0.01）；AGPAT6 過表達極顯著提高細胞中TAG 含量（見圖3C；P＜0.01）。相反，將AGPAT6 siRNA片段轉(zhuǎn)染至乙酸鈉處理的奶牛乳腺上皮細胞中，AGPAT6 siRNA 極顯著降低細胞中AGPAT6 表達（見圖3D、E；P＜0.01）以及乙酸鈉誘導的TAG合成（見圖3F；P＜0.01）。以上結(jié)果表明AGPAT6正向調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞中乳脂合成。

圖3 AGPAT6對奶牛乳腺上皮細胞中乳脂合成的影響Fig.3 Effect of AGPAT6 on milk fat synthesis in mammary epithelial cells of dairy cows

2.4 AGPAT6 通過PI3K-AKT-mTOR 信號通路調(diào)節(jié)乳脂合成

為研究AGPAT6調(diào)節(jié)乳脂合成的信號通路，本研究將pcDNA3.1-AGPAT6載體轉(zhuǎn)染至12 mmol·L-1乙酸鈉處理的奶牛乳腺上皮細胞。結(jié)果顯示AG?PAT6過表達對AKT、mTOR、p70S6K及4E-BP1表達無影響，但極顯著提高細胞中p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K、p-4E-BP1表達（見圖4；P＜0.01）。

圖4 AGPAT6過表達對PI3K-AKT-mTOR信號通路的影響Fig.4 Effect of AGPAT6 overexpression on PI3K-AKT-mTOR signaling pathway

為進一步確定AGPAT6 是否通過激活PI3KAKT-mTOR 信號通路調(diào)節(jié)乳脂合成，本研究采用50 μmol·L-1LY294002（PI3K-AKT 信號通路抑制劑）處理AGPAT6 過表達奶牛乳腺上皮細胞。結(jié)果顯 示LY294002 降 低AGPAT6 對p- AKT、 pmTOR、p-P70S6K 以及p-4E-BP1 激活作用（見圖5A，B；P＜0.01）；與AGPAT6 過表達但未添加LY294002 處理細胞比較，LY294002 使AGPAT6 誘導TAG合成下降約57%（見圖5C）。

圖5 抑制PI3K信號通路降低AGPAT6對乳脂合成的誘導作用Fig.5 Effect of PI3K inhibition on AGPAT6-induced milk fat synthesis

該結(jié)果表明在奶牛乳腺上皮細胞中AGPAT6通過激活PI3K-AKT-mTOR信號通路調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞中TAG合成。

3 討 論

AGPAT6 是脂類合成相關基因。Beigneux 等在水牛中研究發(fā)現(xiàn)，AGPAT6主要在棕色脂肪組織和乳腺組織中表達[4]，Vergnes 等研究發(fā)現(xiàn)在小鼠中，AGPAT6 缺陷導致雌鼠乳腺發(fā)育障礙、體重下降，不會發(fā)生高脂飼料誘導以及基因誘導的肥胖現(xiàn)象，表明AGPAT6介導乳腺和脂肪組織中脂類合成過程[17]。本研究通過熒光定量PCR 和Western blot方法研究奶牛不同生理時期乳腺組織中AGPAT6表達，結(jié)果顯示AGPAT6 mRNA和蛋白質(zhì)水平在泌乳期奶牛乳腺組織中表達均極顯著高于青春期和干奶期，進一步提示AGPAT6可在奶牛乳腺泌乳過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

前期研究表明，AGPAT6 基因促進小鼠脂肪合成相關組織中脂類合成代謝[17-19]。Nagle 等在AGPAT6敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)白色脂肪組織、棕色脂肪組織、肝臟以及乳腺上皮細胞中TAG 含量顯著降低[5]。在奶山羊中，AGPAT6被He等考慮作為泌乳性狀篩選候選基因[19]。金鑫等在泌乳奶牛乳腺中發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸可促進乳脂合成[20-22]。本試驗采用乙酸鈉處理體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞，結(jié)果顯示乙酸鈉可極顯著提高細胞中AGPAT6表達和TAG 合成。因此本研究以12 mmol·L-1乙酸鈉作為牛乳腺上皮細胞外源刺激物，研究AGPAT6 對奶牛乳腺上皮細胞中乳脂合成的影響，結(jié)果顯示AG?PAT6 過表達極顯著提高細胞中TAG 含量，而AG?PAT6基因沉默后TAG 含量極顯著降低。這些結(jié)果表明，在泌乳期奶牛乳腺上皮細胞中AGPAT6可正向調(diào)節(jié)乳脂合成。

PI3K-AKT信號通路是細胞內(nèi)物質(zhì)代謝核心通路，其可應答激素、氨基酸等外源營養(yǎng)物質(zhì)促進細胞中脂類和蛋白質(zhì)合成[23-24]。Chen 等研究表明PI3K-AKT 激活后促使mTOR 發(fā)生磷酸化，繼而激活下游調(diào)控蛋白[25]。本研究通過Western blot方法證明AGPAT6過表達促進AKT、mTOR、p70S6K、4EBP1 蛋白磷酸化水平；當細胞中添加PI3K 抑制劑LY294002 后，在添加乙酸鈉的乳腺上皮細胞中即使過表達AGPAT6，TAG合成也不再提高，進一步明確AGPAT6通過PI3K-AKT-mTOR通路，促進牛乳腺上皮細胞乳脂合成。本試驗在細胞水平上明確AGPAT6在奶牛乳腺乳脂合成中作用，為進一步深入研究乳脂合成調(diào)控機制提供理論支持。

4 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)AGPAT6基因在泌乳期奶牛乳腺組織中高表達，在奶牛乳腺上皮細胞中正向調(diào)控乳脂合成；AGPAT6基因通過激活PI3K-AKT-mTOR 信號通路調(diào)節(jié)乳脂合成。