李富恒，張宏發(fā)，張永芳，于 萍，張曉雯

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；3.北京閱微基因技術(shù)股份有限公司，北京 100044)

老山芹是東北林區(qū)主要山野菜之一，為傘形科獨(dú)活屬多年生宿根草本植物[1]，包括短毛獨(dú)活（Heracleum moellendorffiiHance）和興安獨(dú)活（Hera?cleum dissectumLedeb）兩個種。其富含維生素C、核黃素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，具有祛風(fēng)除濕、退熱解毒、清潔血液、降糖降壓等功效，被稱為山野菜中的“綠色黃金”[3]。

老山芹種子具有較強(qiáng)休眠特性，采收后種胚尚未發(fā)育完全，需經(jīng)歷后熟過程，秋季播種后到第二年春天才發(fā)芽。生產(chǎn)上存在種子發(fā)芽率低、出苗不整齊、育苗技術(shù)不成熟、育苗周期過長等問題，成為老山芹規(guī)?；斯ぴ耘嘞拗埔蛩?。在需求量不斷增加、野生資源日益枯竭情況下，開展老山芹育苗技術(shù)研究具有重要理論及實(shí)踐意義，滿足保護(hù)林區(qū)生態(tài)環(huán)境、發(fā)展林下經(jīng)濟(jì)、實(shí)現(xiàn)老山芹大面積人工栽培需求。

選擇高成熟度種子是完善育苗技術(shù)前提和保障，有利于提高種子處理效果和發(fā)芽率。以往老山芹研究主要集中于植株及種子生長發(fā)育特性[4]、遮陰處理對幼苗生長及生理特性影響[5]、層積條件下種子后熟過程[6]、變溫層積效果比較[7]、提取物活性成分及作用[8]、層積過程中種胚主要發(fā)育期間差異蛋白變化[9]等方面。本研究前期對老山芹種子成熟度差異研究結(jié)果表明，種子采收時個體間胚發(fā)育狀態(tài)不一致，主要處于心形胚和魚雷形胚時期；種子質(zhì)量與種子形態(tài)和胚發(fā)育各項(xiàng)指標(biāo)密切相關(guān)，質(zhì)量越大，成熟度越高[10]。但有關(guān)老山芹不同成熟度種子對層積效果影響相關(guān)研究尚未見報道。

本研究以夏季采收短毛獨(dú)活種子為材料，種子按成熟度分成高、中、低3 組，分別層積處理，測定層積過程中種子及種胚形態(tài)指標(biāo)，觀測并記錄層積過程中種胚所處發(fā)育時期，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)量，比較不同成熟度種子后熟過程動態(tài)變化及種子發(fā)芽率差異。為深入研究老山芹種子休眠及萌發(fā)機(jī)制、提高種子處理效果和發(fā)芽率、保障種苗供應(yīng)、發(fā)展老山芹產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為短毛獨(dú)活種子，于2020年8月采集于黑龍江省森林植物園（哈爾濱市）試驗(yàn)田。

1.2 方法

1.2.1 種子按成熟度分組

利用直徑為7.5、6.0 及5.0 mm 篩子將種子分成3 組，分別作為高成熟度（平均質(zhì)量12.5 mg）、中成熟度（平均質(zhì)量9.2 mg）和低成熟度（平均質(zhì)量6.1 mg）種子。

1.2.2 種子及基質(zhì)處理

種子用75%乙醇消毒30 s，蒸餾水沖洗干凈后浸種6 h，撈出備用。取干凈細(xì)砂置于110 ℃烘箱中高溫滅菌3 h，晾至室溫后加水?dāng)嚢杈鶆颍蛊浜窟_(dá)70%左右。

1.2.3 層積處理

將處理后種子與細(xì)砂按1∶3 攪拌均勻，放入長×寬×高分別為19 cm×13 cm×11 cm塑料盒中，在蓋子上打孔以利于空氣交換，于4 ℃低溫條件下層積處理，每隔10 d清洗1次。

1.2.4 取樣

分別在層積0、20、40、60、80、100、120 d時取樣，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.5 種子形態(tài)指標(biāo)測定

利用游標(biāo)卡尺測定種子最大長度及寬度（mm）、胚乳最大長度及寬度（mm），分別代表種長及種寬、胚乳長及胚乳寬，重復(fù)測量10次，取平均值。

1.2.6 種胚形態(tài)指標(biāo)觀測

利用解剖刀切開種子并剝離種胚制成臨時裝片，在顯微鏡下運(yùn)用直線式測微尺分別測定胚長、胚寬，重復(fù)測量10次，取平均值，計(jì)算胚率。

測量標(biāo)準(zhǔn)如下：

胚長（mm）：直線測微尺測量種胚長度最大值；

胚寬（mm）：直線測微尺測量種胚寬度最大值；

胚率計(jì)算公式：胚率（%）=胚長（mm）/胚乳長（mm）×100%；

測微尺校正：將目微尺放于目鏡內(nèi)，臺微尺放在顯微鏡載物臺上。移動臺微尺至兩尺平行，起點(diǎn)線重合，確定另一兩尺刻度重合處，記錄起點(diǎn)線到重合線間各尺刻度（格數(shù)）。按下式計(jì)算該放大倍數(shù)下目微尺每格所代表實(shí)際長度：

目鏡測微尺每格所代表實(shí)際長度=（臺微尺格數(shù)/目微尺格數(shù)）×10 μm。

1.2.7 種胚發(fā)育時期觀測

利用解剖刀切開種子并剝離種胚制成臨時裝片，在顯微鏡下觀測胚發(fā)育時期差異并作顯微攝影。各處理每次解剖30 粒種子，重復(fù)測量3 次，取平均值。

種胚發(fā)育時期包括心形胚前、中及后期，魚雷形胚前、中及后期，子葉期胚前、中及后期，共分為9個發(fā)育時期。

1.2.8 種子發(fā)芽數(shù)量統(tǒng)計(jì)和計(jì)算

在層積期間定期觀察記錄各處理已發(fā)芽種子數(shù)量，計(jì)算發(fā)芽率。分析各處理層積期間種子發(fā)芽率動態(tài)變化過程，比較各處理間差異。種子發(fā)芽率計(jì)算公式如下：

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用SPSS Statistics 19 和Excel 2019 軟件分析處理數(shù)據(jù)并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 層積過程中不同成熟度種子種胚發(fā)育進(jìn)程動態(tài)變化與比較

2.1.1 種胚發(fā)育進(jìn)程

老山芹種子存在形態(tài)后熟現(xiàn)象，即采收時種胚未發(fā)育完全，在層積過程中種胚繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)心形胚-魚雷形胚-子葉期胚階段，逐漸完成胚后熟過程。僅完成形態(tài)后熟后種子才可能發(fā)芽。不同成熟度種子層積前種胚所處發(fā)育時期有差異，層積過程中在種胚形態(tài)、發(fā)育進(jìn)程等方面也有區(qū)別。

層積前高、中、低三類成熟度種子種胚大小不同，所處發(fā)育時期也有區(qū)別。高、中兩類成熟度種子胚所處發(fā)育時期多數(shù)在心形胚后期（見圖1 A1 和B1），低成熟度種子胚所處發(fā)育時期多數(shù)在心形胚中期（見圖1 C1）。

層積至20 d 時，高、中兩類成熟度種子胚發(fā)育時期多為魚雷形胚前期（見圖1 A2 和B2），低成熟度種子胚發(fā)育時期多為心形胚后期（見圖1 C2）。此時低成熟度種子胚形態(tài)與高、中兩類成熟度種子未層積時種胚相似。高成熟度種子胚伸長，子葉原基基部向內(nèi)凹陷。

層積至40 d 時，高、中兩類成熟度種子仍保持較一致的胚發(fā)育進(jìn)程，種胚發(fā)育時期主要集中在魚雷形胚中期（見圖1 A3 和B3）。低成熟度種子種胚發(fā)育時期主要集中在魚雷形胚前期（見圖1 C3）。與層積20 d相比，高成熟度種子子葉原基基部向內(nèi)凹陷更明顯，子葉原基向內(nèi)彎曲程度更大，兩原基間夾角也變大；中成熟度種子子葉原基基部向內(nèi)凹陷，子葉原基尖端向內(nèi)彎曲；低成熟度種子子葉原基尖端稍向內(nèi)測彎曲，無子葉原基基部向內(nèi)凹陷。

層積至60 d 時，高、中兩類成熟度種子胚發(fā)育時期主要集中在魚雷形胚后期（見圖1 A4 和B4），低成熟度種子胚發(fā)育時期多在魚雷形胚中期（見圖1 C4）。此時高成熟度種子子葉原基及胚軸進(jìn)一步變寬變長，初具子葉輪廓；中成熟度種子胚出現(xiàn)與高成熟度種子類似現(xiàn)象，但變化幅度較??；低成熟度種子胚形態(tài)發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)較為清晰的子葉原基基部向內(nèi)凹陷。

層積至80 d 時，高、中兩類成熟度種子胚發(fā)育時期已進(jìn)入子葉期胚前期階段（見圖1 A5 和B5），低成熟度種子胚發(fā)育時期還處在魚雷形胚后期階段（見圖1 C5）。與層積60 d 相比，高成熟度種子子葉原基已初步發(fā)育成子葉，子葉主脈已能觀察到，胚軸變細(xì)伸長，不再是橢圓形；中成熟度種子剛剛形成子葉輪廓，未觀察到主脈；低成熟度種子子葉原基與胚軸進(jìn)一步伸長。

層積至100 d時，多數(shù)高、中兩類成熟度種子胚發(fā)育至子葉期胚中期階段（見圖1 A6 和B6），低成熟度種子種胚發(fā)育時期仍集中在魚雷形胚后期階段（見圖1 C6）。此時高成熟度種子子葉進(jìn)一步變長、變寬，兩子葉間夾角變大，子葉主脈清晰可見，網(wǎng)狀脈序基本形成；中成熟度種子兩片子葉上出現(xiàn)主脈；部分低成熟度種子胚發(fā)育時期仍處于魚雷形胚后期階段，但胚軸、子葉原基伸長生長較明顯，形態(tài)與高、中兩類成熟度種子層積60 d時接近。

層積至120 d 時，多數(shù)高成熟度種子胚發(fā)育至子葉期胚后期階段（見圖1 A7），完成形態(tài)后熟；中成熟度種子胚發(fā)育仍集中在子葉期胚中期階段（見圖1 B7）；低成熟度種子胚發(fā)育時期集中在子葉期胚前期階段（見圖1 C7）。與層積100 d 時相比，高成熟度種子胚進(jìn)一步生長發(fā)育，子葉上網(wǎng)狀脈序已清晰可見，子葉及胚軸變寬、變長，兩子葉間夾角進(jìn)一步變大；中成熟度種子胚進(jìn)一步生長發(fā)育，胚軸變長，子葉間夾角變大，子葉主脈更清晰；低成熟度種子胚發(fā)育進(jìn)入子葉期胚前期階段，大致輪廓與中成熟度種子層積80 d 時種胚狀態(tài)類似，子葉主脈尚不清晰。

圖1 層積過程中不同成熟度種子種胚發(fā)育進(jìn)程Fig.1 Development process of seed embryo in different maturity during stratification

由以上分析可見，不同成熟度種子在層積過程中胚發(fā)育進(jìn)程區(qū)別明顯，成熟度越高，胚發(fā)育進(jìn)程越快。選擇高成熟度種子可縮短層積時間，有利于種子早發(fā)芽及發(fā)芽整齊，提高育苗質(zhì)量。

2.1.2 種胚發(fā)育進(jìn)程量化分析

老山芹種子成熟度不一致，雖將種子分成高、中和低成熟度三類，但每類種子內(nèi)部依然存在這種差異。因此，有必要量化分析不同成熟度種子在層積過程中胚發(fā)育進(jìn)程，定量化比較這三類種子胚發(fā)育進(jìn)程差異。

由表1可看出，層積前，高、中和低三類不同成熟度種子，可觀測到種胚發(fā)育時期及其所占比例有區(qū)別。其中高和中兩類成熟度種子，部分種子已發(fā)育至魚雷形胚后期，分別占6.67%和3.33%，而低成熟度種子僅有4.44%發(fā)育至魚雷形胚中期；高和中兩類成熟度種子，心形胚后期種胚占比最高，分別占供試種子總數(shù)31.11%和42.22%，低成熟度種子心形胚中期種胚占比最大，為35.56%。說明低成熟度種子種胚發(fā)育程度低于高和中兩類成熟度種子；種子成熟度越高，其種胚發(fā)育程度亦高，二者呈正相關(guān)關(guān)系。

層積至20 d 時，高成熟度種子可觀測到由心形胚中期至子葉期胚中期7個種胚發(fā)育時期，其中占比最高是魚雷形胚前期種子，占供試種子總數(shù)28.89%，極顯著高于除心形胚后期外其他各發(fā)育時期種子所占比例；占比最低是子葉期胚中期種子，占供試種子總數(shù)3.33%，極顯著低于除心形胚中期和子葉期胚前期外其他各發(fā)育時期種子所占比例。中成熟度種子也可觀測到心形胚前期至子葉期胚前期7個種胚發(fā)育時期，其中占比最高是魚雷形胚前期，占供試種子總數(shù)35.56%，除與心形胚后期種子占比差異不顯著外，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子所占比例；占比最低是子葉期胚前期種子，占供試種子總數(shù)2.22%，除與魚雷形胚中期及后期種子所占比例差異不顯著外，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子所占比例。低成熟度種子可觀測到心形胚前期至魚雷形胚后期6個種胚發(fā)育時期，比高和中成熟度處理少一個發(fā)育時期，其中占比最高是心形胚后期，占供試種子總數(shù)27.78%，極顯著高于除心形胚中期及魚雷形胚前期外其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是魚雷形胚后期種子，占供試種子總數(shù)3.33%，除與魚雷形胚中期種子占比差異不顯著外，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。

層積至40 d 時，高成熟度種子可觀測到由心形胚中期至子葉期胚后期8個種胚發(fā)育時期，比層積20 d時多一個發(fā)育時期，2.22%種子已進(jìn)入子葉期胚后期，但占比最低，除與心形胚及子葉期胚中期種子占比差異不顯著外，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最高是魚雷形胚中期，占供試種子總數(shù)23.33%，極顯著高于除心形胚后期外其他各發(fā)育時期種子占比。中成熟度種子可觀測到心形胚前期至子葉期胚中期8 個種胚發(fā)育時期，其中占比最高的處于魚雷形胚中期，占供試種子總數(shù)26.67%，除與魚雷形胚前期種子占比差異不顯著外，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是心形胚前期種子，僅占供試種子總數(shù)2.22%，除與心形胚及子葉期胚中期種子占比差異不顯著外，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。低成熟度種子此時也可觀測到心形胚前期至子葉期胚中期8個種胚發(fā)育時期，其中占比最高是魚雷形胚前期，占供試種子總數(shù)26.67%，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是心形胚前期種子，僅占供試種子總數(shù)3.33%，極顯著低于除子葉期胚中期之外其他各發(fā)育時期種子占比。

層積至60 d 時，高成熟度種子可觀測到由心形胚后期至子葉期胚后期7個種胚發(fā)育時期，其中占比最高是魚雷形胚后期，占供試種子總數(shù)24.44%，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是魚雷形胚前期，占供試種子總數(shù)7.78%，極顯著低于除子葉期胚前期之外其他各發(fā)育時期種子占比。中、低兩類成熟度種子均可觀測到心形胚中期至子葉期胚后期8 個種胚發(fā)育時期，其中中成熟度種子占比最高也是魚雷形胚后期，占供試種子總數(shù)21.11%，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是心形胚中期，僅占供試種子總數(shù)3.33%，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。低成熟度種子占比最高是魚雷形胚中期，占供試種子總數(shù)22.22%，極顯著高于除魚雷形胚前期外其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是心形胚中期及子葉期胚后期種子，均占供試種子總數(shù)4.44%，極顯著低于除心形胚后期外其他各發(fā)育時期種子占比。

層積至80 d 時，高成熟度種子可觀測到種胚發(fā)育時期與層積60 d 時一致，仍為心形胚后期至子葉期胚后期7個種胚發(fā)育時期，但占比最高的發(fā)育時期由魚雷形胚后期變?yōu)樽尤~期胚前期，占供試種子總數(shù)32.22%，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低的發(fā)育時期由魚雷形胚前期變?yōu)樾男闻吆笃冢瑑H占供試種子總數(shù)2.22%，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。中、低兩類成熟度種子也均可觀測到與高成熟度一致的心形胚后期至子葉期胚后期7個種胚發(fā)育時期，但占比不同，其中占比最高的發(fā)育時期分別為子葉期胚前期和魚雷形胚后期，分別占供試種子總數(shù)24.44%和26.67%，均極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低的與高成熟度種子一致，均為心形胚后期，分別占供試種子總數(shù)6.67%和4.44%，中成熟度種子除與魚雷形胚后期、低成熟度種子除與子葉期胚后期種子占比差異不顯著外，均極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。

層積至100 d時，高成熟度種子可觀測到由魚雷形胚前期至子葉期胚后期6個種胚發(fā)育時期，其中占比最高是子葉期胚中期，占供試種子總數(shù)38.89%，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是魚雷形胚前期，僅占供試種子總數(shù)4.44%，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。中、低成熟度種子可觀測到仍為心形胚后期至子葉期胚后期7個種胚發(fā)育時期，其中中成熟度種子占比最高的發(fā)育時期為子葉期胚中期，占供試種子總數(shù)22.22%，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；而低成熟度種子占比最高的發(fā)育時期仍為魚雷形胚后期，占供試種子總數(shù)23.33%，極顯著高于除魚雷形胚中期外其他各發(fā)育時期種子占比，此時發(fā)育至子葉期胚種子占比顯著上升；占比最低仍為心形胚后期，分別占供試種子總數(shù)3.33%和2.22%，均極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。

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層積至120 d時，高成熟度種子可觀測到種胚發(fā)育時期仍為魚雷形胚前期至子葉期胚后期6個種胚發(fā)育時期，其中占比最高的時期由子葉期胚中期變?yōu)樽尤~期胚后期，占供試種子總數(shù)45.56%，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低的仍是魚雷形胚前期種子，僅占供試種子總數(shù)2.22%，極顯著低于除魚雷形胚中期外其他各發(fā)育時期種子占比。中和低兩類成熟度種子也均可觀測到魚雷形胚前期至子葉期胚后期6個種胚發(fā)育時期。其中中成熟度種子占比最高的發(fā)育時期仍與上一次取樣時一致，處于子葉期胚中期，占供試種子總數(shù)30.00%，較上一時期顯著上升，除與子葉期胚后期種子占比差異不顯著外，均極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是魚雷形胚前期，占供試種子總數(shù)6.67%，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。低成熟度種子占比最高是子葉期胚前期種子，占供試種子總數(shù)24.44%，極顯著高于其他各發(fā)育時期種子占比；占比最低是魚雷形胚前期種子，占供試種子總數(shù)5.56%，極顯著低于其他各發(fā)育時期種子占比。

由以上分析可知，不同成熟度種子在不同取樣期均可觀察到多個種胚發(fā)育時期，但總體上高成熟度種子種胚發(fā)育更快，最先進(jìn)入子葉期胚后期階段。

2.1.3 種胚后熟過程快慢比較

老山芹種子成熟度不一致，各取樣時期均包括多個胚發(fā)育進(jìn)程，后續(xù)比較各處理種胚后熟過程存在困難。為此，僅以高、中和低三類成熟度種子占比最大的發(fā)育時期為研究對象，用占比最大的胚發(fā)育時期代表此時種胚發(fā)育狀況，比較各處理種胚后熟過程快慢。

由圖2可見，層積前高、中和低三類成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時期均在心形胚時期，其中高和中兩類成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時期為心形胚后期，而低成熟度種子是心形胚中期。

圖2 層積過程中不同成熟度種子占比最大的種胚發(fā)育時期動態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of the largest proportion of seeds with different maturity during seed embryo development during stratification process

層積至20 d 時，高和中兩類成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時期已進(jìn)入魚雷形胚階段（魚雷形胚前期），而低成熟度種子還停留在心形胚階段（心形胚后期）。

層積至80 d 時，高和中兩類成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時期已進(jìn)入子葉期胚階段（子葉期胚前期），而低成熟度種子還停留在魚雷形胚階段（魚雷形胚后期）。

層積至120 d時，高成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時期已達(dá)到子葉期胚后期階段，即多數(shù)種子已完成形態(tài)后熟，陸續(xù)進(jìn)入發(fā)芽階段；中成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時期達(dá)到子葉期胚中期階段；低成熟度種子占比最大的胚發(fā)育時期達(dá)到子葉期胚前期階段。三類成熟度種子均進(jìn)入了子葉期胚階段。

計(jì)算層積過程中各處理占比最大種胚發(fā)育速率（每經(jīng)歷一個胚發(fā)育時期所需層積天數(shù)，d·D-1），結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在層積80 d范圍內(nèi)，各成熟度處理占比最大胚發(fā)育速率相同，均為20 d·D-1；在層積100 d 時間范圍內(nèi)，高和中兩類成熟度處理占比最大的胚發(fā)育速率保持不變，為20 d·D-1，而低成熟度種子占比最大的胚發(fā)育速率變慢，為25 d·D-1；在整個層積過程中，高成熟度處理占比最大的胚發(fā)育速率為20 d·D-1，而中和低成熟度種子為24 d·D-1。

表2 層積過程中不同成熟度種子占比最大的種胚發(fā)育速率動態(tài)變化Table 2 Dynamic change of embryo development rate was the largest proportion of seeds with different maturity during stratification

2.2 層積過程中不同成熟度種子形態(tài)指標(biāo)動態(tài)變化

2.2.1 種子形態(tài)指標(biāo)動態(tài)變化

由圖3可知，隨層積時間增加，不同成熟度種子種長、種寬、胚乳長及胚乳寬等形態(tài)指標(biāo)均呈現(xiàn)前期增加后期變緩趨勢。在層積40 d 以前，各形態(tài)指標(biāo)增長幅度較大，40 d以后無變化。原因是層積前期種子吸水膨脹，各形態(tài)指標(biāo)數(shù)值變大，種子充分吸水膨脹后變化停止。

圖3 層積過中不同成熟度種子形態(tài)指標(biāo)動態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of seed morphology indexes of seeds with different maturity during stratification

三類成熟度種子種長、種寬、胚乳長及胚乳寬差別較大，這與各處理種子采收時種胚發(fā)育程度不同有關(guān)。成熟度越高，種胚發(fā)育程度也高，體積和質(zhì)量大，各形態(tài)指標(biāo)高于成熟度低處理。

2.2.2 胚形態(tài)指標(biāo)動態(tài)變化

由圖4可知，胚長與胚率間為正相關(guān)關(guān)系，即胚長越長，胚率越大；層積過程中不同成熟度種子胚長及胚率增長幅度及達(dá)到最大增幅時間均有差異。

圖4 層積過程中不同成熟度種子胚長及胚率動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of long embryo rate of seed embryos with different maturity during stratification

層積前，高、中和低三類成熟度種子胚長及胚率差別明顯，胚長分別為0.82、0.61和0.46 mm，胚率分別為17.47%、14.13%和12.74%。高成熟度種子胚長及胚率為中成熟度種子1.34 和1.24 倍，是低成熟度種子1.78 和1.37 倍。中成熟度種子胚長及胚率是低成熟度種子1.33 和1.11 倍。高成熟種子胚長和胚率顯著高于中、低兩類成熟度種子。

層積至20 d 時，高、中、低三類成熟度種子胚長分別為1.19、0.80 和0.55 mm，胚率分別為25.11%、18.22%和15.10%，較層積前胚長增幅分別為45.12%、31.15%和19.57%，胚率增幅分別為43.73%、28.95%和18.52%。高成熟度種子胚長和胚率增幅極顯著高于中、低成熟度種子，中成熟度種子極顯著高于低成熟度種子。

層積至40 d 時，高、中、低三類成熟度種子胚長分別為1.86、1.15 和0.68 mm，胚率分別為36.74%、24.61%和17.64%，相比上一取樣時期胚長增幅分別為56.30%、43.75%和23.64%，胚率增幅分別為46.32%、35.07%和16.82%。胚長和胚率較上一層積時期增幅同樣表現(xiàn)為高成熟種子極顯著高于其他兩類成熟度種子。此時高成熟度種子胚長及胚率增幅均達(dá)到最大值，而其他兩類成熟度種子尚未達(dá)到最大值。

層積至60 d 時，高、中、低三類成熟度種子胚長分別為2.74、1.75 和0.98 mm，胚率分別為53.26%、36.92%和25.06%，相比上一取樣時期胚長增幅分別為47.31%、52.17%和44.12%，胚率增幅分別為44.96%、50.02%和42.06%。中成熟度種子胚長和胚率增幅極顯著高于高和低兩類成熟度種子，而高和低兩類成熟度種子之間差異不顯著。此時中成熟度種子胚長及胚率增幅均已達(dá)層積期間最大值，比高成熟度種子增幅達(dá)到最大值時間晚20 d左右。

層積至80 d 時，高、中、低三類成熟度種子胚長分別為3.36、2.41 和1.43 mm，胚率分別為64.74%、50.48%和36.37%，相比上一取樣時期胚長增幅分別為22.63%、37.71%和45.92%，胚率增幅分別為21.55%、36.73%和45.13%。此時低成熟度種子胚長和胚率增幅達(dá)到最大值，極顯著高于高、中兩類成熟度種子，比中成熟度種子增幅達(dá)到最大值時間晚20 d，比高成熟度種子晚40 d左右。

層積至100 d時，高、中、低三類成熟度種子胚長分別為3.53、2.66和1.69 mm，胚率分別為67.41%、55.27%和42.75%，相比上一取樣時期胚長增幅分別為5.06%、10.37%和18.18%，胚率增幅分別為4.12%、9.49%和17.54%。此時低成熟度種子胚長和胚率增幅仍極顯著高于其他兩類成熟度種子。

層積至120 d 時，高、中、低三類成熟度種子胚長分別為3.68、2.88 和1.82 mm，胚率分別為69.83%、59.60%和45.94%，相比上一取樣時期胚長增幅分別為4.25%、8.27%和7.69%，胚率增幅分別為3.59%、7.83%和7.46%。此時，中、低兩類成熟度種子胚長和胚率增幅均顯著高于高成熟度種子，而二者之間差異不顯著。

2.3 層積過程中不同成熟度種子發(fā)芽率動態(tài)變化

由圖5可看出，三類成熟度種子層積至50 d時陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)芽現(xiàn)象，但不同成熟度種子在層積過程中種子發(fā)芽率均存在較大差別。

圖5 層積過程不同成熟度種子萌發(fā)率動態(tài)變化Fig.5 Dynamic change of seed germination rate at different maturity during stratification

層積至50 d 時，高、中和低三類成熟度種子發(fā)芽率分別為16.96%、8.33%和3.89%。高成熟度種子發(fā)芽率約為中和低成熟度種子發(fā)芽率2.04 和4.36倍。高成熟度種子發(fā)芽率極顯著高于中和低兩類成熟度種子，中成熟種子發(fā)芽率極顯著高于低成熟度種子，說明種子成熟度對種子發(fā)芽初期影響較大。

層積至60 d 時，高成熟度種子發(fā)芽率為23.65%，較上一層積時期增幅為39.45%。中成熟度種子發(fā)芽率為14.32%，較上一層積時期增幅為71.91%，增幅達(dá)到最大值。低成熟度種子發(fā)芽率為5.74%，較上一層積時期增幅為47.56%。高成熟度種子發(fā)芽率極顯著高于中和低成熟度種子，而發(fā)芽率增幅則表現(xiàn)為中成熟度種子極顯著高于高、低兩類成熟度種子。

層積至70 d 時，高成熟度種子發(fā)芽率為30.48%，發(fā)芽率增幅降低至28.88%。中成熟度種子發(fā)芽率為18.33%，增幅降低為28.00%。低成熟度種子發(fā)芽率為9.98%，增幅達(dá)到最大值，為73.87%。此時低成熟度種子發(fā)芽率增幅極顯著高于高和中兩類成熟度種子，而高和中兩類成熟度種子差異不顯著。

層積至80 d 時，高成熟度種子發(fā)芽率為35.42%，增幅為16.21%。中成熟度種子發(fā)芽率為23.13%，增幅為26.19%。低成熟度種子發(fā)芽率為14.41%，增幅為44.39%。此時低成熟度種子發(fā)芽率增幅仍極顯著高于高和中兩類成熟度種子，而中成熟度種子顯著高于高成熟度種子。

層積至90 d 時，高成熟度種子發(fā)芽率為38.08%，增幅降低為7.51%。中成熟度種子發(fā)芽率為26.40%，增幅為14.14%。低成熟度種子發(fā)芽率為17.35%，增幅為20.40%。低成熟度種子發(fā)芽率增幅極顯著高于高成熟度種子，顯著高于中成熟度種子。

層積至100 d 時，高成熟度種子發(fā)芽率為40.50%，增幅降至6.36%。中成熟度種子發(fā)芽率為29.95%，增幅為13.45%。低成熟度種子發(fā)芽率為20.58%，增幅為18.62%。低成熟度種子發(fā)芽率增幅極顯著高于高成熟度種子，顯著高于中成熟度種子。

層積至110 d 時，高成熟度種子發(fā)芽率為42.42%，增幅降低為4.74%。中成熟度種子發(fā)芽率為33.23%，增幅持續(xù)降低，為10.95%。低成熟度種子發(fā)芽率為24.24%，增幅變化小，為17.82%。低成熟度種子發(fā)芽率增幅仍極顯著高于高成熟度種子，顯著高于中成熟度種子。

層積至120 d 時，高成熟度種子發(fā)芽率為43.70%，增幅降至3.02%。中成熟度種子發(fā)芽率為34.90%，增幅為5.03%。低成熟度種子發(fā)芽率為28.41%，增幅為17.20%，此時低成熟度種子增幅極顯著高于高和中兩類成熟度種子，而高和中兩類成熟度種子增幅差異不顯著。

層積期間高、中和低三類成熟度種子發(fā)芽率為28%～44%，表現(xiàn)為高成熟度種子＞中成熟度種子＞低成熟度種子。說明選擇高成熟度種子可提高發(fā)芽率、育苗效率和質(zhì)量。各處理發(fā)芽率低與老山芹是野生山野菜植物有關(guān)，這是其固有生物學(xué)特性。

3 討 論

由于人工選擇和長期馴化結(jié)果，栽培植物（如各種農(nóng)作物）基因型、成熟期和種子成熟度相對一致，種子休眠性弱或休眠期短，因此種子成熟度差異對生產(chǎn)影響較小，栽培時可不考慮這一因素。野生植物未經(jīng)人工選擇和馴化過程，以物種為單位種植，種內(nèi)基因型多樣，成熟期不一致，種子成熟度差異較大。為適應(yīng)和抵御不良環(huán)境條件，野生植物種子多具有休眠特性，播種后需較長時間才發(fā)芽，存在出芽率低、出苗不齊和育苗周期長等問題，給野生植物大規(guī)模人工栽培帶來困難。選擇成熟度相對一致高成熟度種子可縮短種子后熟過程，有利于提高種子處理效果和發(fā)芽率，使出苗整齊一致，便于管理。

植物后熟作用主要體現(xiàn)在種子后熟及果實(shí)后熟兩方面。后熟作用是指成熟種子或果實(shí)離開母體后，仍需經(jīng)一系列生理生化變化后才完成生理成熟并具備發(fā)芽能力的生理過程[11]。種子后熟作用可分為形態(tài)后熟、生理后熟和形態(tài)生理后熟三種類型，其中老山芹種子屬于形態(tài)生理后熟類型。研究發(fā)現(xiàn)，成熟度較高（發(fā)育期120～130 d）時，可抑制“紅陽”獼猴桃果實(shí)生理后熟代謝過程、延長果實(shí)貨架期，保障果實(shí)品質(zhì)[12]。本研究中，高成熟度老山芹種子胚發(fā)育速率高于中、低成熟度種子，后熟過程顯著加快，表明種子成熟度差異可通過影響老山芹種胚發(fā)育速率進(jìn)而調(diào)控后熟過程完成。

種子萌發(fā)是指種子吸脹后一系列有序的形態(tài)發(fā)生和生理過程[13]，種子萌發(fā)受多種因素協(xié)同調(diào)控，其中種子成熟度差異對其影響較為關(guān)鍵。種子成熟度差異原因較多，植株不同部位種子其成熟度也不同。對川澤瀉（Alisma plantago- aquaticaLinn.）研究表明，主花莖第三輪及中上部位種子成熟度高于其他部位，且種子發(fā)芽率隨種子成熟度增加呈雙峰狀變化，即開花后第20 天達(dá)到最大值（37.5%），而在第35 天達(dá)到次級高峰（31.3%）[14]。品種不同其種子成熟度也存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）綠熟及黃熟種子發(fā)芽率顯著高于褐熟及黑熟種子[15]。成熟度差異與種子活力有密切關(guān)系。益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）果實(shí)開花后110 d時種子活力最大，此時種子成熟度達(dá)到最高、種子發(fā)芽率達(dá)到最大值，為最佳采收時期[16]。成熟度差異與種子硬實(shí)性有關(guān)。硬實(shí)苦參（Sophora flavescensAit．）種子其成熟度相對較高，繼而種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢也表現(xiàn)出顯著優(yōu)越性[17]。成熟度差異與種子儲存時間有關(guān)。研究不同成熟期穿心蓮[Andrographis paniculata(Burm. f.) Nees]種子休眠和發(fā)芽規(guī)律發(fā)現(xiàn)，儲存9 個月高成熟度（灰棕色種皮）種子達(dá)到50%發(fā)芽率可比低成熟度（灰紫色種皮）種子提早兩天[18]。成熟度差異與種子采收時期有關(guān)。于大花杓蘭（Cypripedium macran?thumSw.）授粉后60 和75 d 收集種子為早熟種子，此時種子成熟度中等，若播種在培養(yǎng)基上其發(fā)芽率及原球莖形成率均顯著高于未成熟（45 d，成熟度低）和成熟（90 d，成熟度高）種子[19]。研究枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.]不同種種子發(fā)芽率及苗高發(fā)現(xiàn)，完熟期采收的品種“大房”種子其發(fā)芽率顯著高于轉(zhuǎn)色期種子，而品種“軟條白沙”種子發(fā)芽后苗高（43.3%）顯著高于轉(zhuǎn)色期果實(shí)[20]。種子成熟度差異還與坐果時間有關(guān)。紫薇（Lagerstro?emia indicaL.）坐果后56 d 其種子（中成熟度）發(fā)芽率最高可達(dá)到93.86%，其次是坐果后63 d種子（高成熟度）發(fā)芽率為86.39%，坐果后49 d 種子（低成熟度）發(fā)芽率最低為80.71%[21]。本研究中，以種子質(zhì)量作為種子成熟度分類標(biāo)準(zhǔn)，將老山芹種子分為高成熟度（平均質(zhì)量12.5 mg）、中成熟度（平均質(zhì)量9.2 mg）和低成熟度（平均質(zhì)量6.1 mg）3組，通過對層積過程中種胚形態(tài)發(fā)育指標(biāo)測定、對比發(fā)現(xiàn)，成熟度差異與種子質(zhì)量密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，高成熟度種子其發(fā)芽率也較高。漆樹[Toxicodendron vernicifluum(Stokes) F. A. Barkl.]地面收集及完全成熟的種子在發(fā)芽率、發(fā)芽勢及種子活力指數(shù)等方面均顯著優(yōu)越于半成熟度和未成熟的種子[22]。同樣，高成熟度（紅果）構(gòu)樹[Brous?sonetia papyifera(Linn.)]果實(shí)種子發(fā)芽率最高，而低成熟度（微紅果）果實(shí)種子發(fā)芽率較低，未成熟（青果）種子未出現(xiàn)發(fā)芽現(xiàn)象[23]。本研究中，隨層積時間增加，不同成熟度種子發(fā)芽率不斷升高，其中高成熟度種子發(fā)芽率（42.42%）顯著高于其他兩個成熟度種子，結(jié)果表明老山芹種子成熟度越高其發(fā)芽率越高。

本研究結(jié)果表明播種和層積處理時選擇高成熟度種子有利于提高層積效果和出芽率，這為提高野生植物育苗技術(shù)提供新思路和新措施。今后仍需對不同成熟度老山芹種子生理后熟過程作進(jìn)一步探究，包括測定糖類、可溶性蛋白等貯藏物質(zhì)含量及調(diào)控物質(zhì)代謝關(guān)鍵酶活性等，以深入研究種子成熟度差異對老山芹種子后熟過程的影響機(jī)制。

4 結(jié) 論

a.層積過程中不同成熟度老山芹種子胚發(fā)育進(jìn)程有區(qū)別，成熟度越高，胚發(fā)育進(jìn)程越快。高成熟度種子每經(jīng)歷一個胚發(fā)育時期所需層積天數(shù)為20 d，而中和低成熟度種子為24 d。

b. 高、中和低三類成熟度種子種長、種寬、胚乳長及胚乳寬等形態(tài)指標(biāo)在層積40 d 前增加，40 d后基本無變化。胚長、胚率及發(fā)芽率均表現(xiàn)為高成熟度＞中成熟度＞低成熟度。

c.本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，高成熟度種子發(fā)芽率可達(dá)42.42%，高于中和低成熟度種子。