滕衛(wèi)麗，付 雪，劉 冀，張翔超，史飛飛，王 博，董瑩瑩，趙 雪，韓英鵬，李文濱

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，大豆生物學(xué)教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030)

大豆作為糧飼兼用作物，具有豐富油脂和蛋白。但面對國內(nèi)巨大消費市場，國產(chǎn)大豆產(chǎn)量不足，需依賴進口彌補空缺。大豆產(chǎn)量受多種環(huán)境因素影響，其中鹽脅迫是影響大豆產(chǎn)量重要的非生物脅迫之一。鹽脅迫影響種子萌發(fā)和植株生長，降低大豆產(chǎn)量和品質(zhì)[1-3]。隨著土壤鹽漬化問題加重，提升作物耐鹽性，是緩解作物減產(chǎn)的有效途徑，也是未來開拓耕種面積，保障大豆供需平衡的基本條件[4]，因此培育耐鹽大豆品種迫在眉睫。

植物耐鹽性是由多個基因共同作用的復(fù)雜性狀，目前學(xué)界已在大豆耐鹽分子育種方面開展研究，并檢測到多個耐鹽QTL。Lee等用S-100和To?kyo雜交衍生的F2:5群體作QTL定位，在大豆3號染色體上鑒定出1 個主效QTL 位點，位于Sat_091 和Satt237 之間[5]，與Hamwieh 和Ha 等定位到的大豆耐鹽QTL 位點相同，但并未將耐鹽基因從中分離出來[6-8]。直至Guan等利用Tiefeng 8和85-140構(gòu)建的F5:6群體進行精細定位，縮小QTL 區(qū)間，發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)僅有1個基因（Glyma03g32900）[9]。

耐鹽相關(guān)QTL 位點在其他染色體上分布情況相關(guān)報道較多。Chen 等通過室內(nèi)和田間試驗，共同定位到1個位于18號染色體上Sat_164和Sat_358之間QTL位點[10]。姜靜涵利用NY36-87和Peking構(gòu)建F2:3群體，通過苗期耐鹽性鑒定，將耐鹽QTL 定位在18 號染色體，SSR 標記18-7 和18-8 之間約240 kb區(qū)間上[11]。Kan等利用由184個F7:11代家系組成的RIL群體作QTL定位，在8號染色體上定位到1 個QTL 位點Sat_162，此前獲得候選基因Gly?ma08g12400.1 位置相近[12-13]。Tuyen 等利用耐鹽品種Fiskeby Ⅲ和中度鹽敏感品種Williams 82 雜交獲得含有132 個單株的F2群體，在13 號染色體上定位到1 個新QTL，位于Gm13_37204738 ～ Gm13_38988256[14]。劉謝香利用中黃39和NY27-38雜交構(gòu)建包含142 個家系的RIL 群體，開展苗期耐鹽性QTL 定位，位點qS-6 和qS-14 分別位于標記06-0935～06-1000和14-1377～14-1421之間[15]。Zhang等利用以Kefeng 1和Nannong 1138-2雜交構(gòu)建F7:11RIL群體QTL定位結(jié)果，通過211個栽培大豆組成的種質(zhì)資源群體得到的GWAS 結(jié)果相結(jié)合，確定GmCDF1（Glyma.08g102000）為重要候選基因[16]。

以上耐鹽研究主要針對大豆苗期，對于芽期研究較少。在大豆生長過程中，需首先確保大豆在鹽漬土中正常發(fā)芽，再考慮是否正常生長甚至提高產(chǎn)量[17]。同時結(jié)果表明大豆各時期耐鹽性之間無直接關(guān)聯(lián)，因此應(yīng)加強大豆芽期階段耐鹽研究[18]。

本研究利用母本東農(nóng)46 和父本L-100 構(gòu)建的F2:12（2019年）和F2:13（2020年）世代含有127 個家系的重組自交系群體為試驗材料，評價其芽期耐鹽相對吸脹率、相對發(fā)芽指數(shù)和相對發(fā)芽率并作QTL定位分析，探索大豆芽期耐鹽分子機制，為土壤鹽漬化條件下大豆出苗、全苗、壯苗提供有力保障，同時也為培育大豆耐鹽品種，加快分子輔助育種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究利用東農(nóng)46（♀）和L-100（♂）構(gòu)建的F2:12（2019年）和F2:13（2020年）世代含有127 個家系的重組自交系群體為材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

每個家系設(shè)置對照組：蒸餾水（0 mmol·L-1，C）處理，處理組：NaCl（150 mmo·L-1，S）處理，每組3次重復(fù)。芽期耐鹽鑒定參考李亞凱方法[19]。

1.2.2 芽期耐鹽性狀鑒定

芽期耐鹽性狀鑒定指標計算公式如下[19]：

式中，M1-種子干重；M2-暗培養(yǎng)24 h后種子重量；Gt-發(fā)芽試驗第n天發(fā)芽數(shù)；Dt-發(fā)芽試驗第n天；CK為對照組材料吸脹率、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)；E為處理組材料吸脹率、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。

1.2.3 構(gòu)建大豆遺傳連鎖圖譜

本研究所用遺傳連鎖圖譜由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所大豆分子設(shè)計及全基因組編輯實驗室構(gòu)建[20]。共得到4 004 個標記，圖譜覆蓋20 條染色體，全長3 672.52 cM，其中11 號染色體最長，為286.25 cM；12號染色體最短，為126.29 cM；10號染色體標記數(shù)最多為295個，17號染色體標記數(shù)最少為124個；最大圖距為27.73 cM，最小圖距為0.60 cM。

1.2.4 表型數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel（2021）處理F2:12（2019年）和F2:13（2020年）世代127 個家系芽期耐鹽性狀表型數(shù)據(jù)。利用SPSS 25和R軟件作統(tǒng)計分析。

1.2.5 QTL分析

利用QTL IciMapping 4.1.0.0 軟件對大豆RIL 群體F2:12和F2:13世代3 個相對鹽害指數(shù)作QTL 定位分析。加性效應(yīng)分析方法為ICIM-ADD，上位性效應(yīng)分析方法為ICIM-EPI，設(shè)定LOD 閾值分別為＞2.5和＞5。QTL 命名標準為：q+相對吸脹率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽率英文縮寫（STIR、STGI 和STGR）+相對應(yīng)染色體序號+相應(yīng)染色體上出現(xiàn)QTL順序[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽性狀表型分析

2.1.1 耐鹽性狀表型分布特點

對F2:12和F2:13世代籽粒作芽期耐鹽發(fā)芽試驗并分析相關(guān)表型數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，處理組平均值均小于對照組平均值，且各性狀處理組與對照組間存在顯著差異（見表1）。在親本和RIL 群體中，芽期耐鹽性狀表型數(shù)據(jù)如表2所示。在F2:12世代中，3個相對鹽害指數(shù)：相對吸脹率（STIR）、相對發(fā)芽指數(shù)（STGI）和相對發(fā)芽率（STGR）平均值分別為0.08、0.24 和0.08，變化范圍分別為-0.77～1.00、-1.92～1.00 和-2.25～1.00。而在F2:13世代中，3 個相對鹽害指數(shù)平均值分別為0.06、0.51和0.26，變化范圍分別為-0.32～0.38、-0.60～1.00和-0.90～1.00。

表1 RIL群體耐鹽性狀表型數(shù)據(jù)處理和年份間方差分析Table 1 Phenotypic data processing and analysis of variance between years for salt tolerance traits in RIL populations

表2 親本及RIL群體耐鹽性狀表型數(shù)據(jù)分析Table 2 Phenotypic data analysis of salt tolerance traits in parents and RIL population

母本東農(nóng)46 相對吸脹率、相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽指數(shù)均小于父本L-100，相對鹽害指數(shù)越小，越耐鹽，因此母本耐鹽性高于父本，二者存在明顯差異。在兩個世代中，相對吸脹率、相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽指數(shù)變化幅度均超出親本，所以在3個耐鹽性狀中均存在超親家系。除F2:12世代相對吸脹率峰度偏高外，其他世代及性狀均在合理范圍內(nèi)，偏度絕對值除F2:12世代相對發(fā)芽率外，在其他世代及性狀中均小于1。

大豆RIL 群體芽期耐鹽性狀相對鹽害指數(shù)頻率分布直方圖見圖1～3，結(jié)果表明，3 個相對鹽害指數(shù)數(shù)據(jù)在F2:12和F2:13世代中均呈正態(tài)或偏正態(tài)分布，具有數(shù)量性狀遺傳特點，因此適合QTL分析。

圖1 RIL群體相對吸脹率頻率分布直方圖Fig.1 Frequency distribution of relative swelling rate of RIL population

圖2 RIL群體相對發(fā)芽指數(shù)頻率分布直方圖Fig.2 Frequency distribution of relative germination index of RIL population

圖3 RIL群體相對發(fā)芽率頻率分布直方圖Fig.3 Frequency distribution of relative germination rate of RIL population

2.1.2 耐鹽性狀表型相關(guān)性分析

本研究分析F2:12和F2:13世代芽期耐鹽性狀（吸脹率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率）及其3 個相對鹽害指數(shù)表型相關(guān)性（見圖4和5）。在F2:12和F2:13世代極顯著正相關(guān)關(guān)系中，對照組吸脹率與處理組吸脹率間相關(guān)性均最高，相關(guān)系數(shù)分別為0.92 和0.96；在F2:12和F2:13世代極顯著負相關(guān)關(guān)系中，處理組發(fā)芽率與相對發(fā)芽率間相關(guān)性均最高，相關(guān)系數(shù)分別為0.55和0.73。

圖4 F2:12世代RIL群體耐鹽性狀表型相關(guān)分析Fig.4 Phenotypic correlation analysis of salt tolerance traits from F2:12 of RIL population

圖5 F2:13世代RIL群體耐鹽性狀表型相關(guān)分析Fig.5 Phenotypic correlation analysis of salt tolerance traits from F2:13 of RIL population

2.2 耐鹽性狀QTL定位

2.2.1 耐鹽性狀加性QTL定位

利用ICIM-ADD 方法對F2:12世代耐鹽性狀相對吸脹率、相對發(fā)芽指數(shù)及相對發(fā)芽率作加性QTL定位，在3 個性狀中均檢測到相應(yīng)QTL（見表3）。定位到2個控制相對吸脹率QTL位點qSTIR-1-1和qSTIR-16-1，位于1 和16 號染色體上，貢獻率分別為11.55%和13.96%，加性效應(yīng)分別為-30.97 和-14.83，表現(xiàn)為負調(diào)控作用，控制相對吸脹率等位基因均來自父本L-100。定位到1 個控制相對發(fā)芽指數(shù)的QTL 位點qSTGI-2-1，位于2 號染色體上，貢獻率為10.11%，加性效應(yīng)為20.02，表現(xiàn)為正調(diào)控作用，控制相對發(fā)芽指數(shù)等位基因來自母本東農(nóng)46。定位到3 個控制相對發(fā)芽率QTL 位點qST?GR-16-1、qSTGR-16-2 和qSTGR-18-1，分別位于16、16和18號染色體上，貢獻率為9.90%、7.63%和7.09%，加性效應(yīng)為-27.29，-34.85 和-19.29，表現(xiàn)為負調(diào)控作用，控制相對發(fā)芽率等位基因均來自父本L-100。

利用ICIM-ADD 方法對F2:13世代耐鹽性狀3 個相對鹽害指標作加性QTL定位，定位到5個控制相對吸脹率QTL位點和1個控制相對發(fā)芽率QTL位點（見表3）。控制相對吸脹率QTL 位點qSTIR-4-1、qSTIR-7-1、qSTIR-9-1、qSTIR-10-1 和qSTIR-19-1 分別位于4、7、9、10 和19 號染色體上，貢獻率分別為4.88%、6.28%、15.91%、8.01%和10.95%，其中qSTIR-4-1、qSTIR-7-1、qSTIR-10-1 和qSTIR-19-1 加性效應(yīng)分別為3.00、3.34、3.78 和4.36，表現(xiàn)為正調(diào)控作用，qSTIR-9-1 加性效應(yīng)為-5.53，表現(xiàn)為負調(diào)控作用，說明東農(nóng)46攜帶的qSTIR-4-1、qSTIR-7-1、qSTIR-10-1和qSTIR-19-1等位基因及L-100攜帶的qSTIR-9-1等位基因可控制相對吸脹率?？刂葡鄬Πl(fā)芽率的QTL 位點qSTGR-20-1 位于20 號染色體上，貢獻率為12.23%，加性效應(yīng)為17.37，表現(xiàn)為正調(diào)控作用，控制相對發(fā)芽率的等位基因來自母本東農(nóng)46。

表3 F2:12和F2:13世代RIL群體耐鹽性狀加性QTLTable 3 Additive QTL for salt tolerance traits in the F2:12and F2:13 generations of RIL population

2.2.2 耐鹽性狀上位性QTL定位

利用ICIM-EPI方法對F2:12世代耐鹽性狀3個相對鹽害指數(shù)作上位性QTL定位（見圖6）。檢測到96對控制相對吸脹率QTL 位點，貢獻率為0.55%～1.65%；6 對控制相對發(fā)芽指數(shù)QTL 位點，貢獻率為7.83%～11.77%；2 對控制相對發(fā)芽率QTL 位點，貢獻率為5.01%～5.18%。在這些QTL 位點中，相對吸脹率和相對發(fā)芽指數(shù)QTL 效應(yīng)值正負不同，其中62 對QTL 位點效應(yīng)值為正值，即上位效應(yīng)為親本型大于重組型，40 對QTL 位點效應(yīng)值為負值，即上位效應(yīng)為重組型大于親本型；相對發(fā)芽率QTL 效應(yīng)值皆為負值，即上位效應(yīng)為重組型大于親本型。加性qSTIR-16-1 位點與5 個位點存在互作效應(yīng)，這5 對上位性互作QTL 為：16-16、16-17、16-18、16-19 和16-20，說明該位點通過直接和與其他位點互作兩種方式調(diào)控相對吸脹率。

利用ICIM-EPI方法對F2:13世代耐鹽性狀3個相對鹽害指數(shù)作上位性QTL 定位（見圖6）。檢測到3對控制相對發(fā)芽指數(shù)QTL位點，貢獻率為16.71%～20.32%；檢測到1對控制相對發(fā)芽率QTL位點，貢獻率為26.59%。在4對QTL位點中，QTL效應(yīng)值均為負值，即上位效應(yīng)為重組型大于親本型。

圖6 F2:12和F2:13世代RIL群體耐鹽性狀上位性QTLFig.6 QTL for supernumerary salt tolerance traits in F2:12 and F2:13generation of RIL populations

3 討論與結(jié)論

芽期對大豆耐鹽非常重要[21]，主要通過吸脹和發(fā)芽兩個過程萌發(fā)出苗，可通過其中3個相關(guān)指標（吸脹率、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)）鑒定大豆芽期耐鹽性。在低鹽條件下，大豆種子萌發(fā)延緩，在高鹽條件下，發(fā)芽率下降，且活力下降程度比萌發(fā)程度大，說明鹽對種子活力的危害大于萌發(fā)率[22]。本研究所選親本東農(nóng)46 和L-100 在相對吸脹率、相對發(fā)芽指數(shù)和相對發(fā)芽率上均存在顯著差異，為利用其雜交衍生的RIL 群體挖掘大豆芽期耐鹽QTL，開展分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

本研究利用IciMapping 4.1.0.0 軟件，對F2:12和F2:13世代RIL 群體芽期3 個相對鹽害指數(shù)作QTL 分析，共檢測到12 個加性QTL，貢獻率為4.88%～15.91%，其中貢獻率最高QTL 位點分別為qSTIR-9-1（15.91%）、qSTGI-2-1（10.21%）和qSTGR-20-1（12.23%）。在F2:12世代中定位到的相對吸脹率QTL（qSTIR-16-1）和相對發(fā)芽率QTL（qSTGR-16-1）部分區(qū)間重合，說明存在一因多效作用，即在Block5374到Block5380區(qū)間同時控制相對吸脹率和相對發(fā)芽率。在F2:12世代中定位到的2 個相對發(fā)芽率QTL（qSTGR-16-1 和qSTGR-16-2）在Block5425到Block5429 區(qū)間重合，其中qSTGR-16-1 在16 號染色體Block5328 到Block5439 區(qū)間，包含李亞凱定位到控制相對發(fā)芽指數(shù)和相對發(fā)芽率的SNP 位點AX-93856062[19]。在F2:13定位到的相對吸脹率QTL（qSTIR-7-1）位點在Block2253 到Block2254 區(qū)間內(nèi)，陳華濤等研究發(fā)現(xiàn)大豆耐鹽基因GmHKT6；2（Glyma.07G130100）位于該區(qū)間內(nèi)[23]，同時該位點還包含于Chen等定位到QTL位點qtrM.1的Satt702-Satt728 區(qū)間內(nèi)[24]。由此可知，以上2 個QTL 位點（qSTGR-16-1 和qSTIR-7-1）可靠性較高，為進一步進行耐鹽基因精細定位奠定基礎(chǔ)。本研究還發(fā)現(xiàn)10個新QTL位點，其中貢獻率最高位點為qSTIR-9-1（15.91%），這些新位點對大豆芽期耐鹽遺傳研究方面具有重要參考價值。

本研究共檢測到108對與大豆芽期耐鹽相關(guān)上位性互作QTL，貢獻率為0.55%～26.59%，其中2對上位性QTL，即調(diào)控相對發(fā)芽指數(shù)性狀的7-16和調(diào)控相對發(fā)芽率性狀的4-8，貢獻率較高，分別為20.32%和26.59%，且加性qSTIR-16-1位點也出現(xiàn)在上位性互作對中，同時與5個位點存在互作效應(yīng)，說明在大豆芽期耐鹽復(fù)雜基因網(wǎng)中QTL 之間加性×加性上位性互作也發(fā)揮重要作用。因此可將基因表達及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為解析大豆芽期耐鹽遺傳機制突破口，研究這5 對互作QTL 之間遺傳機制，挖掘大豆芽期耐鹽相關(guān)基因。