郝凱敏，劉 鎮(zhèn)，王浩玉，祁文秀

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，汾陽(yáng) 032200)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和腦組織中的β淀粉樣多肽(amyloid-beta，Aβ)和Tau蛋白的異常加工，尤其是Aβ1-42是淀粉樣斑塊的主要成分導(dǎo)致細(xì)胞外老年斑的形成和Tau蛋白的病理性高磷酸化所致的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(nerve fiber entanglement，NFT)為主要病理學(xué)特征的慢性神經(jīng)退行性疾病[1,2]。正常機(jī)體內(nèi)，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)被β分泌酶和γ分泌酶裂解成多種不同片段的Aβ多肽，大部分由組織排出到血液進(jìn)而排出到體外[3]。其中，在腦組織中的Aβ1-42，除部分排出到血液外，有些則會(huì)聚集成老年斑，而形成AD樣病理學(xué)變化[4]?？扇苄訟β1-42寡聚體可通過(guò)血腦屏障清除系統(tǒng)和腦脊液循環(huán)系統(tǒng)等多種方式從大腦被清除到血液[5]。研究證明，Aβ1-42在腦組織中的增多，不僅涉及其過(guò)度產(chǎn)生，而且還涉及由大腦向外周循環(huán)清除失敗等多個(gè)環(huán)節(jié)[6]。臨床病例顯示，AD患者血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到干擾，表現(xiàn)為大腦對(duì)外周循環(huán)清除Aβ的能力下降[5]。在AD模型鼠也發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ流出的蛋白-低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 1(low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1)在AD早期即出現(xiàn)較明顯的下調(diào)[7]；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在AD腦中Aβ與LRP受體之間具有負(fù)性相關(guān)性[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，ptk2b基因的表達(dá)產(chǎn)物PTK2B蛋白(protein tyrosine kinase 2 beta)也稱為Pyk2(proline-rich protein kinase 2,Pyk2)，可能是AD的風(fēng)險(xiǎn)因素[9,10]。PTK2B作為Tau毒性的早期標(biāo)記物和體內(nèi)調(diào)節(jié)劑，從而影響AD的發(fā)生[11]。前期研究結(jié)果表明，在Aβ誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙大鼠海馬PTK2B表達(dá)升高，且伴隨有Aβ1-42和Tau蛋白磷酸化的升高[12]。但是，在AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型腦組織中ptk2b基因及其表達(dá)產(chǎn)物PTK2B蛋白與腦組織中，Aβ1-42和Tau蛋白磷酸化含量及轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ流出的LRP-1之間的關(guān)系，隨著年齡的增加呈現(xiàn)什么樣的變化規(guī)律，以及AD模型鼠早期腦組織和血液中Aβ1-42水平變化與LRP-1的關(guān)系，目前都鮮有報(bào)道。

為了探討以上問(wèn)題，本研究利用5月齡、10月齡和15月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，觀察小鼠海馬組織中ptk2b基因及其PTK2B蛋白表達(dá)水平與Aβ1-42、Tau蛋白磷酸化與總Tau蛋白的比值(p-Tau/Tau)和LRP-1的變化隨著年齡增加的變化規(guī)律，以探討ptk2b基因與AD病理學(xué)變化的關(guān)系，從而為臨床早期診斷AD提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

15只雄性APP/PS1 小鼠(22 g～25 g)，由卡文斯百格(蘇州)模式動(dòng)物研究有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0002。15只雄性C57BL/6J 小鼠、15只雌性C57BL/6J 小鼠(22 g～25 g)，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK(晉)2015-0001。動(dòng)物放置于SPF清潔級(jí)動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，每籠2只，溫度(24±2)℃，濕度(50±10)%，光照自然。動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，每日定時(shí)清掃籠舍換氣。將雄性APP/PS1小鼠與雌性C57BL/6J小鼠通過(guò)交配進(jìn)行保種、繁衍后代。

1.2 動(dòng)物分組及鑒定

雄性APP/PS1 小鼠與雌性C57BL/6J小鼠交配所生的子代雄性小鼠，于10周齡時(shí)，采用PCR法進(jìn)行基因型鑒定。小鼠做好標(biāo)記，剪取鼠尾約0.5 cm，采用基因組DNA小劑量抽提試劑盒(離心柱式)(D0063，碧云天生物技術(shù)公司)，進(jìn)行DNA抽提。APP/PS1小鼠APP和PSl基因受啟動(dòng)子朊病毒蛋白(PrP)同時(shí)控制，因此，擴(kuò)增出APP或PS1中任意一基因即可認(rèn)為所獲小鼠同時(shí)轉(zhuǎn)入APP和PS1兩個(gè)基因。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的PS1基因序列為：F 5'-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3'；R 5'-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3'。PCR反應(yīng)體系10 μl(ddH2O 3.9 μl、2×Taq Mastar Mix 5 μl、Temple DNA 1 μl、PS1 Reverse Primer 0.05 μl、PS1 Forward Primer 0.05 μl)，95℃預(yù)變性、5 min，94℃變性、30 s，63℃復(fù)性、35 s，72℃延伸、45 s，72℃延伸、3 min，共35個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳：制備1 %的瓊脂糖凝膠加EB替代物3 μl，將6×Loading Buffer和10 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物混勻加入。110 V電壓電泳25 min后，進(jìn)行光密度掃描，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察分析。

PCR檢測(cè)結(jié)束后，按照鑒定結(jié)果將符合APP/PS1基因型的小鼠按其年齡分為5月齡(APP/PS1-5 month)、10月齡(APP/PS1-10 month)、15月齡(APP/PS1-15 month)等3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，以及同月齡的C57BL/6J(C57-5 month、C57-10 month、C57-15 month)雄性小鼠作為對(duì)照組，共計(jì)6組，每組均8只。

1.3 小鼠認(rèn)知行為學(xué)功能檢測(cè)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置為直徑120 cm、高90 cm的圓形水池(Smart 3.0，Panlab公司，西班牙；淮北正華生物儀器有限公司，中國(guó))，根據(jù)東南西北四個(gè)方向?qū)⑺詫m分為四個(gè)象限，隱蔽站臺(tái)放入第一象限，水位高于站臺(tái)1 cm，水溫保持在(20±2)℃，加入鈦白粉以便與小鼠毛色形成對(duì)比。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 d，將小鼠分別于上午和下午各自由游泳120 s以便熟悉環(huán)境。

根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)方法[13]，分別進(jìn)行以下測(cè)試：(1)定位航行試驗(yàn)：隨機(jī)選取某一象限的中心入水，將小鼠面朝池壁放入水中，以小鼠從入水開(kāi)始直至找到水下隱蔽站臺(tái)所用時(shí)間作為潛伏期，若60 s內(nèi)小鼠沒(méi)有找到站臺(tái)，則將其放置于平臺(tái)上停留10 s，潛伏期為60 s；若小鼠在60 s內(nèi)找到站臺(tái)，在站臺(tái)上停留10 s后停止試驗(yàn)。隨后將小鼠隨機(jī)放入其他象限，直到完成所有象限的檢測(cè)。連續(xù)進(jìn)行5 d，每日2次。通過(guò)記錄小鼠的潛伏期來(lái)檢測(cè)其空間學(xué)習(xí)行為學(xué)能力。(2)空間探索試驗(yàn)：撤去水下站臺(tái)，將小鼠分四次隨機(jī)放入不同的象限，讓小鼠自由游泳60 s，記錄其在原站臺(tái)所在象限停留的時(shí)間以及穿越站臺(tái)的次數(shù)，分別在上、下午各進(jìn)行一次測(cè)試，取其平均值以判斷小鼠的記憶行為學(xué)能力。

1.4 組織處理

水迷宮檢測(cè)結(jié)束后，1 %戊巴比妥鈉，35 mg/kg經(jīng)腹腔麻醉小鼠，用1 ml注射器經(jīng)心臟進(jìn)行采血 0.4 ml，經(jīng)離心后保留血清，以備ELISA檢測(cè)。之后，用生理鹽水灌注心臟，待血液全部排出后，斷頭、剪開(kāi)小鼠頭皮，取出腦組織置于冰上，撥開(kāi)大腦皮層，暴露其底部的海馬組織，快速分離出海馬。將右側(cè)海馬放入-80℃凍存，以備Western blot和qRT-PCR檢測(cè)；將左側(cè)海馬放置于4 %的多聚甲醛固定24 h，按照以往的實(shí)驗(yàn)方法[13]，對(duì)組織進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟和包埋等處理，蠟塊放于4℃保存，以進(jìn)行免疫組織化學(xué)和HE染色。

1.5 ELISA檢測(cè)血清中Aβ1-42含量

取梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品以及10 μl待測(cè)血清和40 μl樣品稀釋液分別加入包被有Aβ1-42抗體的微量酶標(biāo)板(MM-44561M1，酶免，江蘇)內(nèi)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。15 min后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀取光密度(optical density，OD)值，用空白孔調(diào)零，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)方程計(jì)算出血清中Aβ1-42的濃度。

1.6 Western blot檢測(cè)海馬PTK2B和LRP-1、Aβ1-42、p-Tau/Tau含量

取海馬組織，以100∶1∶1比例加入哺乳動(dòng)物蛋白抽提液、PMSF和廣譜磷酸酶抑制劑(均為博士德，武漢)，提取海馬組織中的蛋白。按照說(shuō)明書，用BCA試劑盒(AR0146、博士德，武漢)測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等處理；按照蛋白分子量大小裁剪條帶，加入Aβ1-42小鼠抗大鼠單克隆一抗(1∶1 000，NBP2-13075，Novus Biologicals)、LRP-1兔抗大鼠多克隆抗體(1∶40 000，ab92544，Abcam)、PTK2B兔抗大鼠多克隆抗體(1∶1 000，ab-402，Sigma-Aldrich)、磷酸化Tau蛋白(Ser416)兔抗大鼠單克隆抗體(1∶5 000，15013S，Cell Signaling Technology，Boston，USA)、Tau蛋白兔抗大鼠單克隆抗體(1∶1 000，46687S，Cell Signaling Technology，Boston，USA)或β-actin(1∶5 000，AP0060，Bioworld Technology Inc)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜；加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫下孵育 2 h，洗膜；免疫復(fù)合物和超敏發(fā)光液(博士德，武漢)進(jìn)行混合、反應(yīng)后，進(jìn)行曝光。用Image J 1.46 進(jìn)行積分光密度(integral OD，IOD)測(cè)定，用目的蛋白與β-actin比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)海馬LRP-1-LI和PTK2B-LI水平

將海馬組織蠟塊用切片機(jī)(RM2135，F(xiàn)eica，Germany)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚 4 μm，攤片至載玻片上，經(jīng)烤箱烘干備用。將切片進(jìn)行脫蠟、梯度脫水、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，并進(jìn)行抗原微波修復(fù)，加BSA進(jìn)行封閉等處理后，分別滴加PTK2B兔抗大鼠多克隆抗體(1∶100)或LRP-1兔抗大鼠多克隆抗體(1∶100)于 4℃ 過(guò)夜，PBS洗3 次；加對(duì)應(yīng)的二抗、37℃ 孵育30 min，PBS 洗 3 次；加SABC、37℃ 孵育 30 min，PBS 洗 3 次；用 DAB (博士德，武漢)顯色 13 ～ 15 min，蒸餾水終止反應(yīng)；進(jìn)行脫水、透明和封片等處理。將切片置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，PTK2B(PTK2B-like immunoreactivity，PTK2B-LI)和 LRP-1(LRP-1like immunoreactivity，LRP-1-LI)的免疫陽(yáng)性反應(yīng)物均顯示棕黃色顆粒，主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。每張切片用低倍視野(10 ×)進(jìn)行觀察后，在高倍視野(40 ×)下隨機(jī)選取海馬 CA3 區(qū)的 5 個(gè)視野，用捷達(dá)成像分析系統(tǒng)(JD801，江蘇捷達(dá))和 Image-pro plus 6.0 軟件分析LRP-1-LI和PTK2B-LI的IOD值，計(jì)算其平均值。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)海馬ptk2b mRNA表達(dá)含量

參考PrimerBlast數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI，Bethesda，MD)，針對(duì)靶基因ptk2b設(shè)計(jì)引物和內(nèi)參，引物序列如下：ptk2b：上義序列5′-CACAGTGCAGACAGAGATCCA-3′，下義序列5′-CCCTATTCGCCCACTCAG-3′；內(nèi)參GAPDH：上義序列5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′；下義序列5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

取凍存的海馬組織，用Trizol法，提取海馬中的RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒說(shuō)明書(D7168S，碧云天，上海)，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存。使用QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒(208054，Qiagen，Germany)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。分別經(jīng)預(yù)變性94℃、5 min，變性94℃、30 s，退火延伸60℃、60 s，共40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。溶解曲線65℃～95℃，毎增高0.5℃收集熒光1次。用Bio-Rad CFX Manager(Bio-Rad，USA)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型鑒定

對(duì)所有子鼠進(jìn)行基因鑒定，結(jié)果如圖1顯示，雄性APP/PS1小鼠與雌性C57BL/6J小鼠交配所生的子代小鼠基因型PCR反應(yīng)產(chǎn)物在608 bp處出現(xiàn)PS1的條帶，野生型C57小鼠則無(wú)條帶顯示，表明APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型成功。

Fig. 1 The results of DNA PCR from the mice

2.2 小鼠認(rèn)知行為學(xué)功能

水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，定位航行試驗(yàn)尋找平臺(tái)的平均潛伏期(表1)，各實(shí)驗(yàn)組的APP/PS1小鼠與其同月齡的C57小鼠比較均明顯延長(zhǎng)(第3～5日，P<0.05或P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組各月齡之間比較，APP/PS1小鼠10月齡明顯比5月齡延長(zhǎng)(第4～5日，P均<0.01)，而15月齡則比10月齡延長(zhǎng)(第4～5日，P均<0.01)。各組空間探索試驗(yàn)的穿越平臺(tái)次數(shù)(表2)結(jié)果可見(jiàn)，各實(shí)驗(yàn)組的APP/PS1小鼠與其相同月齡的對(duì)照組C57小鼠比較均明顯減少(P<0.05或P<0.01)，并且隨著APP/PS1小鼠月齡的增加，穿越平臺(tái)的次數(shù)也越少(APP/PS1-10 month比APP/PS1-5 month減少，P<0.05；APP/PS1-15 month比APP/PS1-10 month減少，P<0.01)；穿越平臺(tái)所在象限的時(shí)間(表2)，各實(shí)驗(yàn)組與其對(duì)照組比較也均明顯減少(P均<0.01)，同時(shí)，隨著月齡的增加，APP/PS1小鼠穿越平臺(tái)的時(shí)間也越少(APP/PS1-10 month比APP/PS1-5 month減少，P<0.01；APP/PS1-15 month則比APP/PS1-10 month減少,P<0.05)。在各對(duì)照組之間比較上述指標(biāo)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各組小鼠在空間探索試驗(yàn)中游泳的軌跡圖(圖2)顯示，各實(shí)驗(yàn)組的APP/PS1小鼠其在目標(biāo)象限探索的傾向比較少，且隨著月齡的增加，在目標(biāo)象限探索的傾向也越少。

以上結(jié)果表明，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨著年齡的增長(zhǎng)，其空間認(rèn)知行為學(xué)能力呈現(xiàn)進(jìn)行性降低。

Fig. 2 Results of the Morris water maze of mice in six groups

Tab. 1 The average of escape latency (second) of the mice in six groups in hidden platform trials n=8)

Tab. 2 The crossings of platform and time spent in platform zone of the mice in six groups n=8)

2.3 小鼠血清中Aβ1-42含量

小鼠血清中Aβ1-42含量在各月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與其同月齡的C57小鼠比較均明顯降低(5 month(μg/L):124.97±9.97vs151.20± 11.10,P<0.05；10 month(μg/L):103.26±8.30vs147.47±15.10,P<0.01;15 month(μg/L):79.01±10.23vs153.96±15.37,P<0.01)；同時(shí)，隨著轉(zhuǎn)基因小鼠月齡的增加，血清中Aβ1-42含量則越降低(P<0.05)。對(duì)照組的各月齡C57小鼠之間比較，小鼠血清中Aβ1-42含量均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

可見(jiàn)，隨著年齡的逐漸增高，APP/PS1小鼠血液中的Aβ1-42水平呈現(xiàn)逐漸降低的現(xiàn)象。

2.4 小鼠海馬組織PTK2B和Aβ1-42、p-Tau/Tau以及LRP-1表達(dá)含量

Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖3,表3)表明，在各月齡的APP/PS1小鼠較其同月齡的C57小鼠海馬組織中PTK2B和Aβ1-42含量以及p-Tau/Tau比值均明顯增高(P<0.01) ，LRP-1則均降低(P均<0.01)。同時(shí)，隨著APP/PS1小鼠月齡的增加，PTK2B、Aβ1-42和p-Tau/Tau比值呈現(xiàn)越來(lái)越高的現(xiàn)象(P<0.05，P<0.01)；LRP-1則表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢(shì)(P<0.05)。各對(duì)照組之間比較，除LRP-1在C57小鼠10月齡較5月齡降低(P<0.05)、15月齡較5月齡降低(P<0.01)以外，上述其他指標(biāo)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

Fig. 3 Western blot images of PTK2B,Aβ1-42,p-Tau,Tau and LRP-1 in hippocampus in six groups

Tab. 3 Levels of PTK2B,Aβ1-42,p-Tau/Tau and LRP-1 in hippocampus in six groups detected by Western blot n=6)

2.5 小鼠海馬PTK2B-LI和LRP-1-LI陽(yáng)性細(xì)胞水平

各組小鼠海馬組織中PTK2B(圖4A,表4)和LRP-1(圖4B,表4)免疫陽(yáng)性細(xì)胞的顯微照相和IOD值，在各月齡的APP/PS1小鼠與其同月齡的C57小鼠比較，其海馬組織中PTK2B-LI的IOD值均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而LRP-1-LI的IOD值則明顯降低(P均<0.01)；各實(shí)驗(yàn)組之間比較，隨著月齡的增加，APP/PS1小鼠海馬組織中PTK2B-LI的IOD逐漸升高(P<0.01)，LRP-1-LI的IOD值則逐漸降低(P<0.05，P<0.01)。在各對(duì)照組C57小鼠之間比較，小鼠海馬組織中PTK2B-LI沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)；LRP-1-LI則在10月齡低于5月齡(P<0.05)，15月齡低于5月齡(P<0.01)，而15月齡與10月齡比較，則沒(méi)有差異(P>0.05)。

Fig. 4 Immunohistochemical images of PTK2B-LI and LRP-1-LI in mouse hippocampus CA3 area in six groups

Tab. 4 Immunohistochemistry staining IOD of PTK2B-LI and LRP-1-LI in mouse hippocampus in the six groups n=8)

2.6 小鼠海馬組織ptk2b mRNA表達(dá)水平

各組海馬組織中的ptk2bmRNA表達(dá)結(jié)果顯示，各月齡的APP/PS1小鼠海馬組織ptk2bmRNA明顯較其同月齡的C57小鼠升高(5 month:5.02±0.66vs1.03±0.32;10 month:9.35±1.99vs1.34±0.59;15 month:14.71±1.80vs1.61±1.37,P均<0.01)；隨著月齡的增加，海馬組織ptk2bmRNA水平在10月齡APP/PS1小鼠比5月齡升高(P<0.01)，15月齡APP/PS1小鼠則比10月齡升高(P<0.01)。各對(duì)照組之間比較，小鼠海馬組織中ptk2bmRNA則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

3 討論

AD有著多種的致病因素，是一種多基因、多環(huán)節(jié)、多因素控制的神經(jīng)退行性疾病。前文所述，Tau蛋白的病理性高磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)的纖維纏結(jié)是AD后期病理學(xué)變化的主要特征[1]。在AD病人或轉(zhuǎn)基因Tau小鼠中發(fā)現(xiàn)AD的易感基因ptk2b表達(dá)產(chǎn)物PTK2B與Tau蛋白超磷酸化具有共定位作用[14]。前期研究結(jié)果表明，在Aβ誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙大鼠海馬PTK2B表達(dá)升高，且伴隨有Tau蛋白磷酸化的升高[12]。本研究結(jié)果顯示，在5月齡的APP/PS1小鼠腦組織中PTK2B和ptk2bmRNA即明顯增加了，并且隨著年齡的增加，海馬組織中PTK2B和ptk2bmRNA表達(dá)均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增加，這與海馬組織中p-Tau/Tau比值的遞增變化是一致的，同時(shí)也與轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知行為學(xué)功能進(jìn)行性下降一致?？梢?jiàn)PTK2B與Tau之間具有相互促進(jìn)作用，PTK2B促進(jìn)Tau的毒性可能是AD Tau 病理學(xué)早期重要的毒性調(diào)節(jié)劑[11]。早期模型鼠腦組織中PTK2B表達(dá)的上調(diào)，導(dǎo)致AD小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Tau過(guò)度磷酸化，隨著月齡的增加，PTK2B進(jìn)一步上調(diào)，致使過(guò)度磷酸化的Tau蛋白增多并進(jìn)一步形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而在后期誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡[15]；Tau 蛋白的過(guò)度磷酸化還會(huì)導(dǎo)致其從微管結(jié)構(gòu)上解離出來(lái)，使細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性下降，促進(jìn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)，進(jìn)一步導(dǎo)致AD腦組織的病理變化[16]。因此，結(jié)合前期的研究可推測(cè)，早期APP/PS1小鼠腦組織中PTK2B表達(dá)的升高，可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中病理學(xué)變化和認(rèn)知行為學(xué)功能進(jìn)行性下降的基礎(chǔ)。

AD的另一個(gè)主要病理特征是由大量聚集的Aβ多肽組成的斑塊在大腦中的聚集和積累[17]。據(jù)報(bào)道，減少海馬腦區(qū)Aβ寡聚體的生成，可有效地緩解APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)和記憶等行為學(xué)能力[18]。本研究可見(jiàn)，APP/PS1小鼠海馬組織中Aβ1-42表達(dá)升高，而其血液中Aβ1-42含量則降低；同時(shí)，海馬轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ流出的蛋白LRP-1也明顯降低了。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，在C57小鼠海馬組織中LRP-1也隨著年齡的增加而降低了，這可能是由于腦組織中LRP-1表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而下降所致[7]。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，APP/PS1小鼠海馬中LRP-1的降低則更明顯，并且，在APP/PS1小鼠腦組織中轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ1-42流出的LRP-1轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)呈現(xiàn)出隨著月齡增加進(jìn)行性降低的變化，此變化與小鼠腦組織中Aβ1-42聚集和血液中含量降低的變化趨勢(shì)是一致的。研究發(fā)現(xiàn)，在AD模型鼠腦內(nèi)LRP-1受體與Aβ之間具有負(fù)性相關(guān)性[8]。隨著月齡的增加，AD腦組織中的LRP-1進(jìn)行性下調(diào)，可能使腦組織中過(guò)多的Aβ排出到血液中的含量逐漸減少[5,7]，或因血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能障礙，使排出到外周的逐漸減少，進(jìn)而使過(guò)多的Aβ聚集在腦組織中[19]。腦組織中逐漸增多的Aβ聚集可能會(huì)引起細(xì)胞間隙的形成，破壞細(xì)胞鈣平衡，引起膜電位的變化；Aβ聚集也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，引起突觸和神經(jīng)元丟失，破壞細(xì)胞骨架等多種病理變化。這些病理變化進(jìn)一步導(dǎo)致模型鼠認(rèn)知行為學(xué)功能的進(jìn)行性下降[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，APP/PS1小鼠認(rèn)知行為學(xué)功能進(jìn)行性下降的同時(shí)，海馬組織中的ptk2b基因mRNA和PTK2B蛋白升高，與上文所述海馬組織中LRP-1表達(dá)降低均呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性變化是一致的。但是，在AD模型中ptk2b基因表達(dá)上調(diào)是否會(huì)導(dǎo)致LRP-1的降低，目前尚不十分清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道，缺氧可誘導(dǎo)Pyk2持續(xù)磷酸化，進(jìn)而調(diào)控LRP-1的表達(dá)[21]；非受體酪氨酸激酶Src可通過(guò)調(diào)控LRP活性及信號(hào)通路，從而在疾病中發(fā)揮作用[22]。也有研究應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)，敲除LRP-1可影響缺氧誘導(dǎo)的Pyk2磷酸化水平[23]。因此，PTK2B與 LRP-1的相互作用在AD的發(fā)生中可能具有重要作用。同時(shí)，異常的Pyk2信號(hào)通路能促進(jìn)Aβ誘導(dǎo)的淀粉樣變性和沉積[24]；或者因血-腦屏障功能的病理學(xué)變化，LRP-1水平下調(diào)[25]，導(dǎo)致Aβ1-42清除障礙，均可導(dǎo)致AD的發(fā)生。

綜上所述，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中PTK2B、Aβ1-42、p-Tau的表達(dá)在早期即出現(xiàn)上調(diào)和LRP-1下調(diào)，且與其認(rèn)知功能降低均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性變化。由此推測(cè)，ptk2b基因在AD模型早期表達(dá)上調(diào)可能是AD模型小鼠海馬Tau過(guò)度磷酸化和Aβ聚集等病理學(xué)和認(rèn)知行為學(xué)功能變化的基礎(chǔ)。但是，在AD模型小鼠腦組織中ptk2b基因是否是通過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LRP-1影響Aβ清除機(jī)制進(jìn)而導(dǎo)致Aβ在腦組織和血液中的變化；或者是通過(guò)Tau蛋白磷酸化途徑，從而導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能的進(jìn)行性下降，仍需要進(jìn)一步的研究。同時(shí)，進(jìn)一步的證據(jù)還需要在臨床上對(duì)AD病人進(jìn)行分析和研究，從而為臨床早期診斷AD提供依據(jù)。