覃超群，黃 斌，陽 芳，王昌明，肖 影，莫艷菊，廖 藝，高 楓

(桂林市人民醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科，廣西 桂林 541002)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是一種以進(jìn)行性和損害肺功能為特征的慢性疾病，是因肺臟中纖維生成和纖維溶解之間出現(xiàn)失衡，導(dǎo)致基質(zhì)蛋白在組織內(nèi)積累而引起的[1]。肺泡上皮細(xì)胞大量轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，然后再形成肌成纖維細(xì)胞是肺纖維化形成的一個(gè)重要過程[2]。其中特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)，是一種致死性進(jìn)行性纖維化間質(zhì)性肺炎，常引起呼吸困難和肺功能下降[3]。其預(yù)后比許多癌癥更為嚴(yán)重，5年生存率為20%至40%，中位生存時(shí)間僅為2至5年[4]，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。因此尋找PF的發(fā)病機(jī)制及治療手段備受關(guān)注。

真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinases,eEF2K)是一種具有Ca2+/CaM依賴性且高度保守的蛋白激酶，幾乎在所有哺乳動物中均廣泛表達(dá)，屬于特殊的絲氨酸(Thr)/蘇氨酸(Ser)/酪氨酸(Tyr)小家族蛋白α-激酶[5]。糖原合成酶激酶3β(glycogen syntheses kinases 3β,GSK3β)是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路下游一個(gè)重要的效應(yīng)分子，是一種Thr/Ser蛋白激酶，在各種細(xì)胞中均有表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺動脈高壓的大鼠模型中，活化的eEF2K可以增加肺動脈血管重塑，肺動脈纖維灶形成增多[6]。GSK3β也參與PF的發(fā)展，Gurrieri等[7]在小鼠的PF模型中發(fā)現(xiàn)，GSK3β在PF小鼠的肺組織中高表達(dá)，抑制GSK3β后可抑制肺組織炎癥的產(chǎn)生及纖維化的發(fā)生。但尚未見GSK3β是否通過調(diào)節(jié)eEF2K上的磷酸化位點(diǎn)對PF進(jìn)程影響的相關(guān)研究報(bào)道。因此本課題探討GSK3β-eEF2K信號通路是否可以通過磷酸化而調(diào)控PF進(jìn)程，從而揭示eEF2K在PF發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為PF的診斷及治療提供新的思路及靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，體重(23±2)g，飼養(yǎng)階段小鼠情況良好，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2020-030，使用許可證號：SYXK(川)2019-189。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

注射用鹽酸博萊霉素購自日本化藥株式會社(每支15 mg、生產(chǎn)批號：74042)；TDZD-8購自MCE(上海)公司；羥脯氨酸(Hyp)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；膠原蛋白Ⅰ(Col Ⅰ)、膠原蛋白Ⅲ(Col Ⅲ)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、GSK3β、p-GSK3β、eEF2K、p-eEF2K(Ser70)、p-eEF2K(Ser392)、p-eEF2K(Ser470)、基質(zhì)金屬前體蛋白酶-2(pro-MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、β-actin和羊抗兔二抗均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 儀器

酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、顯微鏡(日本Olympus公司)、多功能凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)、蛋白質(zhì)電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 構(gòu)建小鼠肺纖維化模型及給藥

小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(10 ml/kg)進(jìn)行麻醉，取仰臥位進(jìn)行固定，使用75%乙醇消毒頸部皮膚后于頸中部做一長約為1 cm的切口，鈍性分離皮下組織，暴露氣管，動物按2 mg/kg(每只100 μl)的劑量于氣管內(nèi)緩慢注射博萊霉素，另取5只小鼠作為空白對照組注射等量生理鹽水，注射后立即直立勻速旋轉(zhuǎn)小鼠，使藥物在肺內(nèi)均勻分布，縫合頸部皮膚，蘇醒后正常飲食飲水。造模14 d后，按體重隨機(jī)分為模型組、陰性抑制組與抑制組，每組5只，抑制組每3 d一次給予腹腔注射4 mg/kg TDZD-8溶液(用10%DMSO助溶，溶于生理鹽水)，陰性抑制組在注射博萊霉素后，每3 d一次給予腹腔注射生理鹽水(含等體積10%DMSO)，空白對照組與模型組腹腔注射等體積生理鹽水，給藥15 d后處死各組小鼠，采集指標(biāo)進(jìn)行后續(xù)測定。

1.5 小鼠肺臟中羥脯氨酸的測定

將肺臟組織按羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行水解處理，使用酶標(biāo)儀測定肺臟中羥脯氨酸(Hyp)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/mg)。

1.6 肺臟病理學(xué)檢測

將采集的肺臟在4%多聚甲醛中固定24 h以上，將固定好的各組標(biāo)本脫水處理后用石蠟進(jìn)行包埋切片，然后使用蘇木精與伊紅染色液進(jìn)行染色，使用光學(xué)顯微鏡在400倍放大下進(jìn)行病理學(xué)觀察分析，根據(jù)Szapiel標(biāo)準(zhǔn)[8]對肺組織進(jìn)行病理評分：0分，無病變；1分，輕度炎性細(xì)胞浸潤和纖維化，范圍小于20%；2分，中度肺炎和纖維化，肺泡間隔增厚20%～50%；3分，重度肺炎和纖維化，病變范圍大于50%。

1.7 免疫組織化學(xué)

將采集的肺臟在4%多聚甲醛中固定24 h以上，將固定好的各組標(biāo)本脫水處理后用石蠟進(jìn)行包埋切片，使用免疫組化法進(jìn)行染色，檢測肺臟組織中MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ、α-SMA的含量，每張切片選取4個(gè)視野，用圖像分析軟件計(jì)算平均光密度。

1.8 Western blot

將采集的肺臟組織使用生理鹽水清洗干凈后在冰上水解并進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量計(jì)算，然后以每個(gè)樣本20 μg蛋白量加入泳道進(jìn)行凝膠電泳，完成電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，置于稀釋好的GSK3β(1∶500)、eEF2K(1∶500)、p-eEF2K(Ser70)(1∶500)、p-eEF2K(Ser392)(1∶500)、p-eEF2K(Ser470)(1∶500)、pro-MMP-2(1∶500)、MMP-2(1∶500)、β-肌動蛋白(β-actin)(1∶1 000)一抗中4℃進(jìn)行過夜孵育，孵育完成后使用TBST漂洗3次后置于二抗(1∶3 000)中在室溫下孵育2 h，最后使用ECL試劑盒發(fā)光顯影后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察分析，以β-actin作為內(nèi)參，采用灰度值(Int)反映蛋白表達(dá)水平，采用Image Lab 3.0軟件分析各條帶的灰度值，將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度值之比表示蛋白表達(dá)的相對水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GSK3β抑制劑TDZD-8對小鼠肺纖維化的影響

病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，空白對照組肺臟層胸膜結(jié)構(gòu)較為正常，壁薄，無結(jié)締組織增生、增厚；各級支氣管結(jié)構(gòu)完整清晰，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯變性壞死或脫落；Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)較為正常，未見明顯變性、壞死，間質(zhì)未見明顯炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生；模型組肺臟各級支氣管結(jié)構(gòu)較為正常，肺泡間質(zhì)內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤，主要包括核圓形深染的淋巴細(xì)胞，局部區(qū)域纖維增生，見多量核呈卵圓形的成纖維細(xì)胞和長梭形纖維細(xì)胞增生，聚集呈結(jié)節(jié)狀；陰性抑制組：肺臟各級支氣管結(jié)構(gòu)較為正常，支氣管纖毛上皮排列整齊，未見明顯細(xì)胞脫落；肺泡上皮細(xì)胞較為正常，肺泡間質(zhì)內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤，主要包括淋巴細(xì)胞，局部區(qū)域纖維增生，見纖維細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)增生，聚集呈結(jié)節(jié)狀；抑制組：肺臟各級支氣管結(jié)構(gòu)較為正常，支氣管纖毛上皮排列整齊，未見明顯細(xì)胞脫落；肺泡上皮細(xì)胞較為正常，肺泡間質(zhì)內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤，主要以淋巴細(xì)胞為主，少量區(qū)域纖維增生，見成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞增生(圖1)。

與空白對照組相比，模型組與陰性抑制組肺臟纖維化評分與羥脯氨酸含量顯著性升高(P<0.01)；與模型組相比，抑制組的病理評分與羥脯氨酸含量顯著性降低(P<0.01，表1)。免疫組化結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組與陰性抑制組肺臟中MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ、α-SMA的表達(dá)水平顯著性升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制組肺臟MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ、α-SMA表達(dá)量顯著性下降(P<0.05，表1，2，圖2)。WB結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組與陰性抑制組肺臟中MMP-2與pro-MMP-2蛋白表達(dá)含量均顯著性升高(P<0.01)；與模型組相比，抑制組肺臟中MMP-2與pro-MMP-2蛋白表達(dá)含量均顯著性降低(P<0.01，圖3)，說明GSK3β激活能促進(jìn)肺纖維化形成。

Tab. 1 The levels of pulmonary fibrosis indexes in 4 groups n=5)

Tab. 2 The levels of pulmonary fibrosis indexes in 4 groups n=5)

2.2 GSK3β抑制劑TDZD-8對小鼠肺臟組織中eEF2K、磷酸化位點(diǎn)及MMP-2表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組與陰性抑制組肺臟中GSK3β、p-GSK3β、p-eEF2K(Ser70、Ser392、Ser470)的表達(dá)水平均顯著升高，eEF2K的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，抑制組肺臟中GSK3β、p-GSK3β、p-eEF2K(Ser70、Ser392、Ser470)的表達(dá)水平均顯著降低，eEF2K的水平顯著升高(P<0.01)，說明GSK3β能通過Ser70、Ser392、Ser470三個(gè)磷酸化位點(diǎn)激活eEF2K(表3，圖4)。

Fig. 1 Pathological changes of lung tissues of mice (HE ×400)

Fig. 2 Detection the expressions of MMP-2,Col Ⅰ,Col Ⅲ,and α-SMA in lung tissues of mice by immunohistochemistry(×400)

Fig. 3 Western blot method was used to detect the expressions of pro-MMP-2 and MMP-2 in lung tissues of mice

Fig. 4 Western blot method was used to detect the expressions of eEF2K,phosphorylation sites and MMP-2 in lung tissues of mice

3 討論

肺纖維化是一種致命疾病，其組織病理學(xué)特征包括肺組織細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積、肺組織出現(xiàn)片狀慢性間質(zhì)性炎癥、肺纖維母細(xì)胞增殖和肺泡變形，使Hyp水平異常升高并促進(jìn)膠原蛋白積累，最終發(fā)生進(jìn)行性纖維化導(dǎo)致肺功能喪失[9]。目前已知，肺纖維化產(chǎn)生的原因是大約30%的肺泡上皮細(xì)胞肺轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，而在IPF中，細(xì)胞外基質(zhì)也可能是促進(jìn)成纖維細(xì)胞灶和纖維化形成的原因之一[10]。Hyp是人類蛋白組中最豐富的翻譯后修飾氨基酸，其主要成分為膠原蛋白[11]。有數(shù)據(jù)證實(shí)，肺臟中Hyp含量可作為定量纖維化的可靠標(biāo)準(zhǔn)，有助于評估肺纖維化的程度[12，13]。Hyp是穩(wěn)定膠原蛋白的基礎(chǔ)，如Col I、Col Ⅲ等，很多疾病都與Hyp代謝異常相關(guān)，其中包括胃病和肺病[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺臟組織纖維增生較多，肺泡或細(xì)支氣管壁增厚且出現(xiàn)嚴(yán)重纖維化樣，組織內(nèi)Hyp，Col I、Col Ⅲ、α-SMA含量明顯增多，與盧林明等[15]研究結(jié)果基本一致。使用TDZD-8后，肺臟組織纖維化程度減弱，Hyp，Col I、Col Ⅲ、α-SMA含量降低，說明肺臟纖維化得到緩解，也證明TDZD-8對于治療肺纖維化有一定應(yīng)用前景，但是否通過GSK3β/eEF2K信號通路起作用尚不十分清楚。

Tab. 3 The expression levels of eEF2K,phosphorylation sites and MMP-2 in lung tissues of mice n=5)

MMPs是一類具有破壞細(xì)胞外基質(zhì)能力的鋅依賴性內(nèi)肽酶[16]。大多數(shù)MMPs以pro-MMPs或酶原的形式分泌，在細(xì)胞外環(huán)境中被激活，惡性促進(jìn)細(xì)胞增殖?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是一種IV型膠原蛋白酶[17]，當(dāng)肺上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)性轉(zhuǎn)化時(shí)，MMP-2表達(dá)異常升高，然后過度累計(jì)肺組織中膠原纖維，重塑肺結(jié)構(gòu)，降低肺功能[18]。而eEF2K過度激活會導(dǎo)致MMP-2表達(dá)增加，有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺纖維化進(jìn)程的作用[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測肺組織中MMP-2與pro-MMP-2的蛋白表達(dá)量來反映纖維化的程度。結(jié)果顯示，模型組中MMP-2與pro-MMP-2的蛋白表達(dá)量均明顯升高，而抑制GSK3β表達(dá)后，MMP-2與pro-MMP-2的表達(dá)量均呈明顯降低，說明抑制GSK3β表達(dá)能抑制肺纖維化進(jìn)程。

EEF2K是蛋白激酶家族的一個(gè)成員，是一種具有鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性酶，通過磷酸化其唯一的底物eEF2(Thr56)來調(diào)節(jié)蛋白合成，在乳腺癌、胰腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞等多形性細(xì)胞中均過表達(dá)[20，21]。EEF2K可被多種條件激活，如缺氧、生長因子失衡、營養(yǎng)或能源枯竭及細(xì)胞自噬[22]，這種反饋性激活對平衡但高度磷酸化有利于惡性細(xì)胞進(jìn)行快速增殖[23]，也能加速纖維化疾病進(jìn)程，因?yàn)閑EF2K過度磷酸化會導(dǎo)致正常肺纖維化細(xì)胞發(fā)生異常增殖與分化，影響細(xì)胞正常自噬與凋亡功能，進(jìn)一步加速肺組織纖維化的形成[21]。在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，eEF2K磷酸化激活是由Ser70、Ser392、Ser470三個(gè)位點(diǎn)控制的[24]。GSK3β作為PI3K/Akt通路的下游蛋白，與細(xì)胞生長分化關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)，在腎小管上皮細(xì)胞纖維化組織中，GSK3β的表達(dá)異常增多，說明GSK3β蛋白是纖維化疾病的一個(gè)干預(yù)靶點(diǎn)，而GSK3β抑制劑可以用于纖維化疾病[25]。由于GSK3β能與Ser特異性結(jié)合，同時(shí)也是鈣通路調(diào)節(jié)因子，eEF2K作為一種鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶，會特異性結(jié)合鈣離子磷酸化激活[26]。因此推測GSK3β能通過Ser70、Ser392、Ser470這3個(gè)位點(diǎn)磷酸化激活eEF2K，促進(jìn)肺纖維化的形成。結(jié)果顯示，模型組中eEF2K(Ser70)、(Ser392)、(Ser470)三個(gè)位點(diǎn)及GSK3β的磷酸化水平均有不同程度的升高，其中eEF2K(Ser70)磷酸化水平最高，說明GSK3β主要通過Ser70這個(gè)位點(diǎn)激活eEF2K。使用TDZD-8后磷酸化蛋白表達(dá)趨勢發(fā)生改變，3個(gè)位點(diǎn)的磷酸化程度均降低，說明GSK3β可以通過激活Ser70、Ser392、Ser470這3個(gè)位點(diǎn)對eEF2K進(jìn)行調(diào)控，是影響肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵。

綜上所述，本研究探討GSK3β通過eEF2K磷酸化位點(diǎn)影響肺纖維化進(jìn)程的可能性，結(jié)果表明GSK3β能通過Ser70、Ser392、Ser470這3個(gè)磷酸化位點(diǎn)激活eEF2K，促進(jìn)肺纖維化形成，eEF2K在PF發(fā)生發(fā)展過程中起到重復(fù)作用，為PF的診斷及治療提供新的思路及靶點(diǎn)。