張鵬

摘 要：探討了5種標(biāo)準(zhǔn)滅菌方法對(duì)3種硅表面涂層的影響：聚乙二醇（PEG）、聚甲基丙烯酸磺基甜菜堿（pSBMA）和聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿（pMPC）。對(duì)高壓釜、干熱、過氧化氫（H2O2）等離子體、環(huán)氧乙烷氣體（EtO）和電子束（E-beam）處理的涂層進(jìn)行分析，以確定聚合物在滅菌過程中可能發(fā)生的降解。滅菌后，接觸角有顯著變化，H2O2引起的最大變化Δ-PEG、pSBMA和pMPC分別采用高壓釜和干熱處理。在PEG硅上使用高壓釜和EtO，在pSBMA硅上使用電子束，在pMPC硅上使用EtO處理，發(fā)現(xiàn)涂層厚度變化小于5%。H2O2處理使所有涂層的厚度至少減少30%。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顯示，在所有滅菌方法后，pMPC硅的蛋白質(zhì)吸附量顯著增加。PEG硅上的電子束和pSBMA硅上的干熱處理在每個(gè)涂層子集中表現(xiàn)出最大的蛋白質(zhì)吸附?？偟膩碚f，數(shù)據(jù)表明高壓釜和EtO處理非常適合PEG硅，而E-beam最適合pSBMA硅。EtO處理對(duì)pMPC硅的影響最小。H2O2處理對(duì)3種涂層都有負(fù)面影響。可用于確定哪些表面修飾和滅菌過程可用于體內(nèi)設(shè)備。

關(guān)鍵詞：硅;殺菌;超薄兩性離子聚合物;聚乙二醇;無污染表面涂層

中圖分類號(hào)：U270.38+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-5922（2022）05-0108-05

Sterilization effect of ultra-thin polymer coating for silicon-based implantable medical devices

Abstract： This study explores the effect of 5 standard sterilization methods on 3 surface coatings applied to silicon： polyethylene glycol （PEG），poly（sulfobetaine methacrylate） （pSBMA），and poly（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine） （pMPC）. Autoclave，dry heat，hydrogen peroxide （H2O2） plasma，ethylene oxide gas （EtO），and electron beam （E-beam） treated coatings were analyzed to determine possible polymer degradation with sterilization. Post-sterilization，there were significant alterations in contact angle，maximum change resulting from H2O2 （Δ-14°），autoclave （Δ+15°），and dry heat （Δ+23°） treatments for PEG，pSBMA and pMPC，respectively. Less than 5% coating thickness change was found with autoclave and EtO on PEG-silicon，E-beam on pSBMA-silicon and EtO treatment on pMPC-silicon. H2O2 treatment resulted in at least 30% decrease in thickness for all coatings. Enzyme-linked immunosorbent assays （ELISA） showed significant protein adsorption increase for pMPC-silicon following all sterilization methods. E-beam on PEG-silicon and dry-heat treatment on pSBMA-silicon exhibited maximum protein adsorption in each coating subset. Overall，the data suggests autoclave and EtO treatments are well-suited for PEG-silicon，while E-beam is best suited for pSBMA-silicon. pMPC-silicon was least impacted by EtO treatment. H2O2 treatment had a negative effect on all three coatings， which could be used to determine the surface modifications and sterilization processes to utilize for devices in vivo.

Key words： silicon;sterilization;ultrathin zwitterionic polymer;polyethylene glycol;non polluting surface coating

硅基器件因其精確定義的微納尺度特征而越來越受到植入式醫(yī)療應(yīng)用的青睞，這些特征可以以低單位成本生產(chǎn)，并與微電子集成。其中一些設(shè)備包括用于神經(jīng)假體的微電極、用于控制藥物輸送的系統(tǒng)、用于細(xì)胞移植的免疫隔離室和用于腎臟替代治療的濾膜。此類應(yīng)用使硅直接接觸體液，包括血液[1-2]。根據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心（CDC），任何遇到無菌生物液體的醫(yī)療設(shè)備都被歸類為“關(guān)鍵項(xiàng)目”，必須進(jìn)行消毒。對(duì)于植入物，指南要求無菌保證水平（SAL）為10-6這相當(dāng)于百萬分之一的孢子在滅菌過程中存活的概率。這一水平可以通過許多物理和化學(xué)過程實(shí)現(xiàn)：高溫暴露、化學(xué)和化學(xué)等離子體暴露以及輻射。雖然這些處理可以根除微生物和孢子，但其嚴(yán)酷的特性可能導(dǎo)致醫(yī)療器械組件的交聯(lián)、鍵斷裂和/或氧化，可能對(duì)功能化表面造成不可接受的損壞[3-4]。

雖然硅本身可能不受常規(guī)滅菌技術(shù)（如高壓滅菌器和γ輻射）的影響，但滅菌對(duì)應(yīng)用于硅的薄膜聚合物表面涂層的影響尚未得到很好的表征。其他研究表明，滅菌對(duì)水凝膠、交聯(lián)聚合物和表面改性的影響為幾個(gè)數(shù)量級(jí)[5-6]。然而，據(jù)我們所知，滅菌對(duì)PEG、pSBMA和pMPC的刷狀聚合物結(jié)構(gòu)的影響尚未見報(bào)道。因此，本研究的目的是研究常用滅菌方式對(duì)涂有PEG、pSBMA和pMPC的硅的影響。使用CDC認(rèn)可的5種技術(shù)對(duì)涂層基材進(jìn)行滅菌：高壓滅菌器、干熱、過氧化氫（H2O2）等離子體、環(huán)氧乙烷（EtO）氣體和電子束（電子束）輻照。我們利用各種表面表征工具來檢查滅菌的物理和化學(xué)效應(yīng)。用X射線光電子能譜（XPS）測(cè)定了表面的化學(xué)成分。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)量滅菌前后蛋白質(zhì)抗性的變化[7]。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

從Ultrasil公司獲得雙面拋光、400 μm厚的p型硅片，并將其切成1 cm2的芯片。用硫酸（96%）與過氧化氫（30%）比例為3∶1的溶液清洗20 min。然后將芯片暴露于氫氟酸中5 min，以去除暴露于大氣氧氣中的硅表面自發(fā)形成的二氧化硅，接著激活水面，再將洗液清洗干凈，然后用氮?dú)飧稍锕杵?/p>

1.2 表面改性

1.2.1 PEG表面改性

如前所述，用PEG對(duì)硅表面進(jìn)行改性。簡(jiǎn)單地說，基板在110 ℃的加熱板上干燥1 h。2-[甲氧基（聚乙烯氧基）丙基]三甲氧基硅烷（PEG硅烷）通過將基底浸入285 μL PEG硅烷溶液中，在70 ℃溫度下浸泡2 h，共價(jià)鍵合到硅上。然后用甲苯每隔10 min沖洗基底3次，分別用乙醇和水去除多余的聚乙二醇。

1.2.2 兩性離子表面改性

兩性離子表面改性如前所述進(jìn)行。表面引發(fā)劑2-溴-2-甲基-N-3[（三甲氧基硅基）丙基]-丙酰胺（BrTMOS）。將底物置于雙環(huán)己基中的1%（v/v）BrTMOS溶液中2 h。然后分別用氯仿、乙醇和水沖洗表面，以去除多余的BRTMO。

2-（甲基丙烯酰氧基）乙基]二甲基-（3-磺丙基）氫氧化銨（SBMA）和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿（MPC）。468 mg（3 mmol）2，2’-聯(lián)吡啶脫氣溶液（≥98%）和單個(gè)單體SBMA∶1.06 g（3.8 mmol）和MPC∶506 mg（1.9 mmol） 和22.3 mg（0.1 mmol）溴化銅（99%）在5∶5 mL甲醇。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將該混合物添加到含有4種底物和143 mg（1 mmol）溴化銅（99.999%）的反應(yīng)室中，并對(duì)pSBMA和pMPC分別進(jìn)行15 min和7 min的聚合。然后用氯仿、乙醇、磷酸鹽緩沖鹽和水沖洗底物，并用氮?dú)饬鞲稍铩?/p>

1.2.3 滅菌過程

評(píng)估了5種滅菌過程。使用STERIS Amsco Century SV-120 Scientific Prevacum滅菌器進(jìn)行高壓滅菌器滅菌，在121 ℃下將基質(zhì)暴露在高壓蒸汽中30 min。對(duì)于干熱滅菌，將基質(zhì)置于160 ℃烘箱中2 h。使用STERRAD?100S滅菌系統(tǒng)進(jìn)行H2O2等離子體處理（標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)）。由D2EO進(jìn)行EtO氣體處理，在13.2 kPa和55 ℃下暴露2 h。最后，由STERIS在21.0～21.9 kGy的應(yīng)用劑量范圍內(nèi)進(jìn)行電子束滅菌。

1.2.4 表面特性

光電子能譜：使用表面科學(xué)儀器S探針光譜儀和單色Al KαX射線束進(jìn)行XPS。使用150 eV的通過能產(chǎn)生測(cè)量和高分辨率光譜。將樣品加壓至小于5×10-9torr，并使用0°起飛角，對(duì)應(yīng)于約10 nm的取樣深度。對(duì)于每個(gè)樣品，在3個(gè)點(diǎn)大小約為800 μm的位置測(cè)量XPS。

橢偏儀：使用LSE Stokes橢偏儀和6328?HeNe激光以70°的入射角測(cè)量表面涂層厚度。將測(cè)量的反射和透射數(shù)據(jù)輸入菲涅耳方程，在已知折射率的情況下，迭代求解透明膜的厚度。對(duì)于兩性離子和PEG表面涂層，使用1.45的折射率?？臻g均勻性的特點(diǎn)是在每個(gè)樣本集的3個(gè)單獨(dú)芯片上測(cè)量3個(gè)位置。總共對(duì)9次測(cè)量進(jìn)行了平均，并報(bào)告了平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

酶聯(lián)免疫吸附：通過在37 ℃下將底物在1 mg/mL的人血清白蛋白（HSA）的D-PBS溶液中培養(yǎng)90 min來評(píng)估對(duì)蛋白質(zhì)吸附的抵抗力。在HSA培養(yǎng)后，所有底物用0.5 mL的D-PBS沖洗5次，用濃度為1 mg/mL牛血清白蛋白持續(xù)1.5 h。用0.5 mL的D-PBS將基質(zhì)沖洗5次，并轉(zhuǎn)移到新鮮的腔室中。然后將樣品與10 μg/mL抗人血清白蛋白抗體結(jié)合辣根過氧化物酶孵育1.5 h。再次沖洗（用0.5 mL D-PBS沖洗5次）后，再次沖洗基質(zhì)并轉(zhuǎn)移到新鮮的腔室。0.5 mg/mL鄰苯二胺和0.03%過氧化氫在0.05 M檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液（pH5.0）中的溶液。使用鋁箔在37 ℃下避光20 min，然后通過添加0.5 mL 1M硫酸停止該反應(yīng)。在490 nm處測(cè)量溶液的光吸收率。每種樣品類型一式3份進(jìn)行測(cè)試，并減去背景（未添加HSA的對(duì)照）。將所有HSA蛋白吸附數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為組織培養(yǎng)聚苯乙烯（TCPS），作為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 X射線光電子能譜（XPS）

接觸角數(shù)據(jù)如圖1所示。

圖2（a）～（d）顯示了每種表面改性的各種滅菌方法后的相應(yīng)光譜。固著水滴在10 s內(nèi)保持穩(wěn)定，未涂覆的硅襯底具有32°的接觸角。通過PEG表面改性，接觸角增加到43°。兩性離子涂層顯示pSBMA和pMPC的接觸角分別降低到15°和25°。正如接觸角測(cè)量所反映的，所有3種表面改性都是親水的。然而，通過滅菌處理觀察到親水性的顯著變化，尤其是對(duì)于未涂覆和pMPC涂覆的基材。高壓釜對(duì)pSBMA硅的接觸角影響最大，增加了15°。過氧化物處理對(duì)PEG硅的影響最大，降低了14°。

在所有情況下，單晶硅襯底和天然二氧化硅分別存在Si（2p）（100 eV）和O（1s）（528 eV）峰值。未改性的硅也顯示出約8%的不定碳的存在，H2O2等離子體處理的基板除外，其中碳含量約為16%。在H2O2等離子體處理后，未改性的硅顯示出較高的氧含量以及氮、鈉和氟的存在。由于這些污染元素在其他基質(zhì)上不明顯存在，它們的存在可能是由于樣品處理不當(dāng)造成的。除過氧化氫處理的樣品外，在滅菌和未滅菌的硅襯底之間，晶體硅和二氧化硅含量的變化小于5%。

與未改性的硅相比，pSBMA耦合硅的Si（2p）濃度急劇下降大于40%，C（1s）含量增加大于37%。此外，還存在特征元素N（1）（～400 eV）和S（2S）（～228 eV）以及Br 3d（～69 eV），表明pSBMA表面改性成功。滅菌后，與未滅菌pSBMA基板的20%硅含量相比，這些樣品的硅濃度略有下降，從11%～17%不等。

2.2 橢偏儀

使用橢偏儀測(cè)定各種表面涂層的厚度，如圖3所示。

PEG、pSBMA和pMPC涂層的起始厚度分別為0.9、7.1和2.7 nm。當(dāng)用過氧化氫等離子體滅菌時(shí)，觀察到所有涂層的統(tǒng)計(jì)顯著差異，經(jīng)過幾次滅菌處理后涂層厚度的大幅減少。通過干熱、過氧化氫和電子束輻照處理，PEG硅的厚度減少30%以上，而通過干熱和過氧化氫處理，pSBMA和pMPC的厚度變化超過20%。此外，高壓釜中的蒸汽處理對(duì)pSBMA也有很大影響，厚度減少了29%。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附

圖4所示的HSA蛋白質(zhì)吸附數(shù)據(jù)表明，未經(jīng)滅菌的pSBMA和經(jīng)pMPC涂覆的硅片均顯示出優(yōu)異的非污染性能，與未涂覆的硅片相比，蛋白質(zhì)吸附分別降低了90%和95%。相比之下，PEG涂層芯片僅比未涂層硅降低10%。

3 結(jié)語

隨著新型聚合物和功能表面在醫(yī)療器械中越來越普遍，必須評(píng)估滅菌可能對(duì)其產(chǎn)生的影響。

對(duì)植入式醫(yī)療設(shè)備上的聚合物表面改性進(jìn)行滅菌尤其苛刻。因此，我們提供了各種滅菌工藝對(duì)硅上薄膜聚合物刷影響的數(shù)據(jù)。研究表明，H2O2等離子體處理對(duì)所有3種聚合物涂層都有不利影響。相比之下，高壓釜和EtO處理似乎適用于PEG、pSBMA的電子束滅菌以及pMPC涂層的EtO處理。這些結(jié)果將有助于任何使用超薄兩性離子或PEG涂層的硅醫(yī)療設(shè)備的應(yīng)用。這些影響是獨(dú)特的表面涂層的化學(xué)和物理性質(zhì)。因此，本工作為確定滅菌對(duì)任何表面改性的影響提供了指南。

【參考文獻(xiàn)】

[1] KHAN Y，OSTFELD A E，LOCHNER C M， et al.Monitoringof vital signs with flexible and wearable medical devices[J].Advanced materials，2016，28（22）：4 373-4 395.

[2] MUTHUSUBRAMANIAM L ， LOWE R， FISSELL W H， et al.Hemocompatibility of silicon-based substrates for biomedicalimplant applications[J].Annals of Biomedical Engineering：The Journal of the Biomedical Engineering Society，2011，39（4）：1 296-1 305.

[3] GHELICH P，NOLTA N F，HAN M.Unprotected sidewallsof implantable silicon-based neural probes and conformal?coating as a solution[J].npj Materials Degradation， 2021，?5（1）：1-8.

[4] TIEU T，ALBA M，ELNATHAN R， et al.Advances in porous?silicon-based nanomaterials for diagnostic and therapeutic? applications[J].Advanced therapeutics，2019，2（1）：180 009 5.

[5] MAITY S， BARMAN K R ，Bhattacharjee S. Silicon-basedtechnology：Circularly polarized microstrip patch antennaat ISM band with miniature structure using fractal geometryfor biomedical application[J].Microwave and Optical TechnologyLetters，2018，60（1）：93-101.

[6] CHEN Y， KIM Y S，TILLMAN B W， et al.Advances in materials?for recent low-profile implantable bioelectronics[J].Materials，2018，11（4）：522.

[7] CHEN K， REN J Y， CHEN C Y， et al.Safety and effectivenessevaluation of flexible electronic materials for next generationwearable and implantable medical devices[J].Nano Today，2020，35：100 939.

收稿日期：2021-11-15;修回日期：2022-04-28

作者簡(jiǎn)介：張 鵬（1983-），碩士，工程師，主要從事醫(yī)用耗材節(jié)能管理工作。