王 翠， 朱 杰， 諸葛恒艷， 李 宏

解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院 1.門診部；2.神經(jīng)外科；3.骨科，江蘇 無錫 214044

難愈性創(chuàng)面是指臨床上經(jīng)1個(gè)月及以上時(shí)間正規(guī)治療但仍無愈合傾向，而進(jìn)入病理性炎癥反應(yīng)狀態(tài)的創(chuàng)面[1]，通常由機(jī)械性創(chuàng)傷、燒傷、感染、壓瘡、糖尿病和腫瘤切除引起。難愈性創(chuàng)面作為一種慢性創(chuàng)面，常規(guī)治療包括換藥和清創(chuàng)，但結(jié)果往往難以令人滿意。近年來，負(fù)壓創(chuàng)面治療(negative pressure wound therapy，NPWT)已成為難愈性創(chuàng)面的一種治療選擇[2]。該療法通過將吸引裝置與特殊的創(chuàng)面敷料連接,使創(chuàng)面保持在負(fù)壓狀態(tài)，減少組織水腫和細(xì)菌負(fù)荷，而且，封閉和穩(wěn)定的環(huán)境有利于肉芽組織的生長[3-4]。富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是一種自體血液衍生產(chǎn)品。PRF中的細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子和纖維蛋白通過與成纖維細(xì)胞相互作用、促進(jìn)膠原纖維產(chǎn)生和增加角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移來刺激血管生成。本研究通過建立大鼠難愈性創(chuàng)面動(dòng)物模型，評價(jià)NPWT聯(lián)合PRF治療難愈性創(chuàng)面的療效并探討其可能的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與造模方法 選取32只健康的雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，10～12周齡。參照文獻(xiàn)[5]中的方法，將32只大鼠用0.3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉后，于造模區(qū)(腰椎正中偏上)剪毛，用塑料瓶蓋在造模區(qū)標(biāo)記造模面積，大鼠皮膚消毒后，沿標(biāo)記線剪去皮膚、皮下組織至肌筋膜，止血，消毒紗布敷料覆蓋創(chuàng)面，即刻肌肉注射氫化可的松琥珀酸鈉(8 mg/100 g體質(zhì)量)，連續(xù)注射5 d，每天1次，觀察創(chuàng)面未愈合，以連續(xù)注射5 d后的創(chuàng)面為實(shí)驗(yàn)開始的觀察起始創(chuàng)面，即第0天，模擬免疫抑制方法制成難愈性創(chuàng)面模型。

1.2 PRF制備 為了避免免疫排斥，使用自體血制備PRF。心室穿刺后，從大鼠心臟抽取3.5 ml血液，然后，立即轉(zhuǎn)移到離心管中，以3 000 r/min離心10 min。離心后，中間層的凝塊包含富含生長因子的PRF。

1.3 動(dòng)物分組與處理干預(yù) 將大鼠隨機(jī)分為4組，分別為對照組、NPWT組、PRF組及NPWT+PRF組。對照組在創(chuàng)面注射1.5 ml生理鹽水。NPWT組創(chuàng)面用負(fù)壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)覆蓋并連接到-125 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的吸引器。PRF組僅用PRF覆蓋創(chuàng)面。NPWT+PRF組用PRF覆蓋創(chuàng)面完畢后，修剪合適大小的VSD覆蓋于其上，無菌半透膜密封，安裝好VSD后，接負(fù)壓吸引器。4組大鼠用3 M膜封閉所有創(chuàng)面，并在第4、7天更換敷料。

1.4 創(chuàng)面觀察 以第0天為觀察起始創(chuàng)面，之后第3、7、14天，分別采集創(chuàng)面的標(biāo)準(zhǔn)化照片。基于標(biāo)準(zhǔn)化照片，使用Image J軟件對創(chuàng)面面積進(jìn)行宏觀量化。

1.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 在第14天，沿創(chuàng)面表面完全切除肉芽組織和皮膚組織。組織在4%多聚甲醛中保存24 h；然后制備石蠟包埋切片。通過Masson染色觀察組織中膠原纖維的變化，光鏡下膠原纖維呈藍(lán)色。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 第14天，沿創(chuàng)面表面完全切除肉芽組織和皮膚組織，PBS漂洗后取小組織塊使用RIPA裂解緩沖液(Beyotime lns，上海，中國)裂解并提取蛋白，提取離心后的上清液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)評估血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)-BB和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β的水平(R&D 公司，美國)。

2 結(jié)果

2.1 各組創(chuàng)面閉合效果比較 14 d內(nèi)4組創(chuàng)面均未出現(xiàn)感染跡象，且創(chuàng)面面積均隨著時(shí)間的推移而收縮。在第3、7、14天，NPWT+PRF組的創(chuàng)面面積均小于對照組、NPWT組及PRF組。而且，NPWT+PRF組的創(chuàng)面在第14天幾乎閉合。見圖1。創(chuàng)面閉合面積的量化結(jié)果顯示，在第0、3、7和14天，NPWT+PRF組創(chuàng)面的閉合速度明顯快于對照組、NPWT組及PRF組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 難愈大鼠模型全層皮膚缺損的代表性圖像(比例尺：10 mm)

圖2 在0、3、7和14天，4組創(chuàng)面閉合速度比較(與對照組比較，①P<0.05)

2.2 各組膠原蛋白形成情況比較 在Masson染色中，NPWT+PRF組、NPWT組、PRF組均觀察到成纖維細(xì)胞，在一定程度上排列有方向性，且NPWT組和NPWT+PRF組的方向性更加一致。此外，與NPWT組、PRF組及對照組比較，NPWT+PRF組膠原纖維蛋白更豐富且更均勻。見圖3。

圖3 Masson染色顯示組織中膠原纖維變化情況[NPWT+PRF組的膠原蛋白(藍(lán)染)比其他3組膠原纖維蛋白豐富且均勻，成纖維細(xì)胞(紅染)在一定程度上排列有方向性]

2.3 各組肉芽組織中生長因子表達(dá)水平比較 ELISA結(jié)果顯示，第14天，NPWT+PRF組肉芽組織中VEGF、PDGF-BB、TGF-β和bFGF水平均顯著高于對照組、NPWT組、PRF組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PRF組中VEGF、PDGF-BB、TGF-β和bFGF的水平均顯著高于對照組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而NPWT組只有TGF-β、bFGF水平顯著高于對照組，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 第14天各組肉芽組織中生長因子表達(dá)水平比較(a.PDGF-BB；b.VEGF；c.bFGF；d.TGF-β)

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NPWT+PRF的聯(lián)合治療方案加速了肉芽的生長和創(chuàng)面的收縮，從而大大縮短了創(chuàng)面的愈合時(shí)間。創(chuàng)面愈合傳統(tǒng)上分為3個(gè)階段，即炎癥、增殖和重塑。上皮化、血管生成、肉芽組織形成和膠原蛋白沉積構(gòu)成了創(chuàng)面愈合增殖階段的主要步驟[6]。創(chuàng)面愈合的經(jīng)典特征是肉芽組織的短暫發(fā)育，其支持相鄰上皮細(xì)胞的快速增殖、遷移和分化。創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織生長過緩或膠原蛋白沉積過少，均會導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲[7]。位于皮膚邊緣的上皮細(xì)胞開始增殖并發(fā)出突起來重新建立保護(hù)屏障，以防止體液流失和細(xì)菌進(jìn)一步入侵，稱為“再上皮化”過程[6]。

PRF類似于富血小板血漿(platelet-rich plas ma，PRP)，雖然，PRF無法達(dá)到與PRP相同的細(xì)胞因子水平，但PRF在制備過程中的緩慢聚合似乎生成了一個(gè)與天然纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)非常相似的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)[11]。這種結(jié)構(gòu)可以促成更有效的細(xì)胞遷移和增殖，而且其制備方法簡單，無需凝血酶等添加劑，也有利于其臨床應(yīng)用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第14天，PRF組和NPWT+PRF組肉芽組織中仍然可以檢測到4種生長因子的水平高于對照組(P<0.05)。PRF形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可保護(hù)生長因子免受蛋白水解[12]。PRF能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放多種生長因子[11-12]，如VEGF、PDGF-BB、TGF-β1和bFGF，這些生長因子對于創(chuàng)面愈合至關(guān)重要，因?yàn)槠渖飳W(xué)特性能刺激肉芽生長[13]。VEGF和PDGF-BB是血管生成因子，bFGF和TGF-β是促纖維化因子，二者均能促進(jìn)肉芽生長。生長因子TGF-β和PDGF在肉芽組織的形成中具有重要作用，可以上調(diào)膠原蛋白的產(chǎn)生，而且，PDGF還可以上調(diào)成纖維細(xì)胞中糖胺聚糖和纖連蛋白的合成[14]。PRF可為細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化提供結(jié)構(gòu)化的纖連蛋白[15]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與NPWT+PRF組比較，PRF組缺乏定向機(jī)械牽引，不能使膠原蛋白分布更均勻。創(chuàng)面修復(fù)基于炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。細(xì)胞集體遷移比單細(xì)胞遷移更有效，細(xì)胞間相互作用為細(xì)胞集體遷移提供了重要的生物學(xué)基礎(chǔ)[15]。

帶有多孔泡沫敷料的NPWT將真空均勻分布到創(chuàng)面，主要通過機(jī)械力促進(jìn)創(chuàng)面收縮，并能去除創(chuàng)面周圍液體，以及保持創(chuàng)面環(huán)境的穩(wěn)定，一定程度上增加了血管生長因子和促纖維化因子，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)血管生成，肉芽組織形成，細(xì)胞增殖、分化和遷移等過程[16-17]。有研究報(bào)道，NPWT機(jī)械力造成的創(chuàng)面收縮，能使成纖維細(xì)胞響應(yīng)趨化信號從周圍組織遷移到創(chuàng)面，這對組織修復(fù)的增殖階段很重要[16],顯露于NPWT的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的增殖和遷移率[17]。這些細(xì)胞增殖在整個(gè)創(chuàng)面床上施加強(qiáng)大的收縮力，從而將創(chuàng)面邊緣拉在一起[16]。在Masson染色上，NPWT+PRF組、NPWT組、PRF組均觀察到成纖維細(xì)胞，排列有一定的方向性，且NPWT組和NPWT+PRF組的方向性更加一致，說明這種方向性排列是由NPWT施加的應(yīng)變力均勻分布在創(chuàng)面表面，進(jìn)而使膠原蛋白沉積更加均勻。ELISA結(jié)果顯示，與對照組比較，NPWT能部分上調(diào)促纖維化因子bFGF和TGF-β的表達(dá)，而血管生成因子VEGF和PDGF-BB的表達(dá)上調(diào)不明顯。因此，NPWT促進(jìn)創(chuàng)面愈合可以用創(chuàng)面收縮增加來解釋，并且在一定程度上增加了細(xì)胞因子的釋放。

綜上所述，NPWT與PRF聯(lián)合使用可有效修復(fù)創(chuàng)面，加速創(chuàng)面愈合。NPWT可通過宏觀變形收縮創(chuàng)面，而PRF可刺激肉芽生長。NPWT與PRF聯(lián)合使用還刺激了PRF相關(guān)的血管生成和促纖維化生長因子的釋放，促使膠原蛋白均勻沉積。