布雨鑫， 武瀚林， 宋海旭， 劉 丹

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110004

心血管疾病是全球疾病發(fā)病率和死亡率持續(xù)升高的主要原因[1]，中國心血管疾病發(fā)病率也處于上升階段，至2020年冠心病患病人數(shù)已高達(dá)1 139萬人[2]，其中，心肌梗死(myocardial infarction，MI)是常見的心血管死亡原因，嚴(yán)重威脅人類健康。心肌細(xì)胞凋亡在MI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。MI后，由于缺血缺氧，心肌組織會(huì)出現(xiàn)過度的氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞丟失，特別是心肌細(xì)胞的凋亡，觸發(fā)炎癥反應(yīng)；同時(shí)，心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)心臟纖維化，最終導(dǎo)致心臟重構(gòu)和心力衰竭[3]。因此，充分認(rèn)識(shí)MI后心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子至關(guān)重要。Fos被認(rèn)為是誘導(dǎo)腫瘤生長的重要調(diào)控基因。有研究表明，F(xiàn)os表達(dá)通常早于細(xì)胞凋亡，提示Fos可能在細(xì)胞凋亡等細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮重要作用[4]。Fos家族包括c-Fos、FosB、Fra1及Fra2，有研究表明，c-Fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以作為大腦損傷后神經(jīng)元活動(dòng)的標(biāo)志物，在MI誘導(dǎo)的邊緣區(qū)損傷的神經(jīng)元中，c-Fos表達(dá)也會(huì)明顯增加[5]，但同家族蛋白FosB在MI心肌損傷中是否發(fā)揮作用尚不十分明確。本研究旨在探索MI后梗死邊緣區(qū)及缺氧刺激后心肌細(xì)胞中FosB、凋亡蛋白cleaved caspase3的表達(dá)變化，明確FosB表達(dá)變化與心肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SPF級(jí)8～10周雄性C57BL/6J小鼠12只購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司(中國南京)，體質(zhì)量(20±2)g。小鼠置于SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境7 d，溫度為(20℃±2℃)，濕度為(45%±3%)，遵循晝夜節(jié)律，小鼠可自由攝食和飲水。小鼠心肌細(xì)胞系HL-1購自中國上海通派生物科技有限公司，蛋白裂解液和Trizol購自Thermofisher公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑購自Takara公司，F(xiàn)osB抗體購自Abcam公司，cleaved caspase3抗體和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 研究方法

1.2.1 急性MI模型建立 采用隨機(jī)分組的方法將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)和MI組，每組各6只。MI組采用永久性冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法構(gòu)建小鼠MI模型[6]，主要方法步驟如下：將小鼠放置于氣體麻醉誘導(dǎo)箱內(nèi)，4.0%異氟烷下吸入麻醉，然后將小鼠置于手術(shù)臺(tái)上，固定四肢，經(jīng)鼻吸入1.5%異氟烷維持麻醉狀態(tài)，去除小鼠左胸毛發(fā)，剪開長約1.2 cm皮膚切口，將縫線穿過切口皮膚做縫合前狀態(tài)，用手術(shù)鉗分離肋間肌肉，顯露心臟，用手?jǐn)D壓將小鼠心臟擠出胸腔，尋找左冠狀動(dòng)脈前降支，用手術(shù)針引線結(jié)扎前降支。

1.2.2 小鼠心功能測定 MI術(shù)后3 d，將sham組和MI組小鼠經(jīng)異氟烷麻醉，仰臥固定于超聲臺(tái)，調(diào)節(jié)超聲探頭角度置左室，在M Mode狀態(tài)下從左室乳頭肌水平二維左室短軸切面分別計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.2.3 氯化鈷缺氧誘導(dǎo)HL-1細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型 用DMEM培養(yǎng)基對HL-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。在細(xì)胞融合率達(dá)到70%時(shí)給予氯化鈷(CoCl2，400 μM)刺激24 h，建立細(xì)胞缺氧模型。未給予CoCl2刺激的細(xì)胞作為對照組(CON組)，給予CoCl2刺激的HL-1細(xì)胞作為缺氧組。

1.2.4 Western Blot檢測FosB和cleaved caspase3蛋白表達(dá) 加入適量的蛋白裂解液提取sham組和MI后梗死邊緣區(qū)的心肌組織蛋白，以及CON組和CoCl2刺激后HL-1細(xì)胞的蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，按40 μg蛋白上樣量配成蛋白樣品。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜(FosB、cleaved caspase3、GAPDH一抗按1∶1 000比例稀釋)，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光，采用Image J圖像處理軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測FosB mRNA水平 采用Trizol法提取細(xì)胞和組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測FosB mRNA相對表達(dá)量。引物序列：m-FosB-F TTTTCCCGGAGACTACGACTC，m-FosB-R GTGATTGCGGTGACCGTTG，18S-F TTGACGGAAGGGCACCACCAG，18S-R GCACCACCACCCACGGAATCG。

2 結(jié)果

2.1 sham組、MI組心功能比較 與sham組比較，MI后3 d小鼠的LVEF和LVFS均顯著降低(P<0.05)，表明C57BL/6J小鼠MI模型建立成功。見圖1。

圖1 MI組和sham組小鼠心功能比較

2.2 sham組、MI組FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平比較 與sham組比較，MI組3 d時(shí)梗死邊緣區(qū)FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平均明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 sham組、MI組FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平比較

2.3 CON組、缺氧組FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平比較 與CON組比較，缺氧組HL-1細(xì)胞FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平均明顯升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 CON組、缺氧組FosB mRNA水平及FosB、cleaved caspase3蛋白水平比較

3 討論

有研究表明，MI后大量心肌細(xì)胞丟失(主要形式是心肌細(xì)胞死亡)會(huì)導(dǎo)致不良的心室重構(gòu)，最終誘發(fā)心力衰竭，嚴(yán)重影響MI預(yù)后[7]。心肌細(xì)胞凋亡是MI早期心肌損傷調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞死亡的主要機(jī)制[8]，增加心肌細(xì)胞凋亡會(huì)加劇MI誘導(dǎo)的左室重塑和心功能障礙[9]，抑制心肌細(xì)胞凋亡可減少M(fèi)I后梗死面積并改善MI后心功能[10]。因此，尋找針對心肌細(xì)胞凋亡的預(yù)防和治療靶點(diǎn)對于深入明確MI的發(fā)病機(jī)制以及MI的防治至關(guān)重要。

Fos蛋白家族與Jun組成二聚體，與炎癥、損傷、應(yīng)激等有關(guān)，在JNK/MAPK信號(hào)的下游發(fā)揮作用[11]。有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)osB是Fos蛋白家族成員之一，是N4BP1的直接mRNA靶標(biāo)，對于維持角質(zhì)形成細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的正常功能，以及預(yù)防牛皮癬發(fā)生非常重要[12]。FosB表達(dá)增加與慢性癲癇發(fā)作有關(guān)[13]。有研究報(bào)道，F(xiàn)osB作為慢性神經(jīng)元激活標(biāo)志物，在高血壓后腹內(nèi)側(cè)下丘腦激活切片中表達(dá)明顯增加，F(xiàn)osB表達(dá)升高可加重高血壓后的心臟重塑[14]。Li等[15]對冠狀動(dòng)脈疾病患者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)FosB是差異表達(dá)基因中變化最明顯的的基因之一，冠狀動(dòng)脈疾病患者心包脂肪組織中FosB mRNA明顯升高。Saddic等[16]在豬的心臟急性或慢性缺血模型中提取T2段胸背角組織檢測差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，只有FosB被顯著激活，而c-Fos僅在急性模型中顯著上調(diào)。但FosB在C57BL/6J小鼠MI后梗死邊緣區(qū)心肌組織中的表達(dá)目前尚不清楚。

本研究成功構(gòu)建了C57BL/6J小鼠MI模型，通過Western Blot和qRT-PCR檢測MI后3 d梗死邊緣區(qū)FosB的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，MI組3 d時(shí)梗死邊緣區(qū)FosB mRNA水平及蛋白水平均明顯升高(P<0.05)。細(xì)胞學(xué)采用CoCl2刺激HL-1心肌細(xì)胞來建立心肌細(xì)胞缺氧模型，通過Western Blot和qRT-PCR檢測也發(fā)現(xiàn)，CoCl2刺激后的HL-1心肌細(xì)胞中，F(xiàn)osB mRNA水平及蛋白水平均明顯升高(P<0.05)。上述結(jié)果提示，F(xiàn)osB在MI中可能發(fā)揮重要作用。本研究中，MI后梗死邊緣區(qū)和CoCl2刺激后的HL-1心肌細(xì)胞中凋亡蛋白cleaved caspase3表達(dá)也顯著升高，且與FosB表達(dá)增加具有一定相關(guān)性，這提示，F(xiàn)osB可能通過影響心肌細(xì)胞凋亡參與MI的發(fā)生發(fā)展，抑制FosB表達(dá)可能是治療MI的有效靶點(diǎn)。

綜上所述，F(xiàn)osB在MI后心肌組織和缺氧后心肌細(xì)胞中表達(dá)升高，與MI后心肌細(xì)胞凋亡存在正相關(guān)性。本研究局限性在于，雖然發(fā)現(xiàn)了MI后FosB表達(dá)增加與心肌細(xì)胞凋亡具有一定的相關(guān)性，但對于FosB對MI后心肌細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控作用尚不清楚。在今后的工作中應(yīng)繼續(xù)深入探討FosB在MI后心肌細(xì)胞凋亡中的作用，爭取為研發(fā)MI后心肌損傷修復(fù)的靶點(diǎn)提供新思路。