劉靖松，付京城，溫丙言，楊彥賓，郭 爽，焦顯芹，陳 瑾，黃若超，王月影，李和平

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046)

仔豬斷奶后通常會導(dǎo)致生長性能下降和嚴(yán)重腹瀉[1]。仔豬腹瀉大多是因感染傳染性胃腸炎病毒、飼養(yǎng)管理不當(dāng)所引起的，這會導(dǎo)致仔豬腸道受損，進(jìn)而使腸道菌群失調(diào)，致使有害的病原微生物大量增殖，破壞了腸黏膜功能。在過去的幾十年里，抗生素被有效地用于治療腹瀉或改善斷奶仔豬的生產(chǎn)性能[2]，但是，過早使用抗生素容易破壞腸黏膜屏障[3-4]。因此，亟需尋找新的抗生素替代品來治療斷奶仔豬腹瀉，提高仔豬的生產(chǎn)力。

血紅素加氧酶(heme oxygenase,HO)是一種細(xì)胞內(nèi)的限速酶，可以促進(jìn)血紅素的降解，并生成CO和膽綠素[5-6]，存在3種亞型：HO-1、HO-2和HO-3。其中，HO-1是一種保護(hù)性因子，可以參與細(xì)胞保護(hù)、凋亡和炎癥的調(diào)節(jié)[7]，在豬、牛、羊等動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在。生理情況下，HO-1在胃腸道低濃度表達(dá)[8]，但在病變和炎癥時(shí)，HO-1的表達(dá)量上調(diào)可以明顯抑制炎癥反應(yīng)并改善腸黏膜屏障的破壞[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1的上調(diào)可以改善SD大鼠放射性腸炎的胃腸道癥狀，明顯降低細(xì)胞凋亡和炎癥因子的表達(dá)[11]。目前有大量的證據(jù)證明HO-1的上調(diào)有助于改善腸道的炎癥情況，修復(fù)腸道損傷[12-14]。

短小芽孢桿菌屬于芽孢桿菌，是革蘭氏陽性菌，作為新型的基因工程菌能夠高效分泌多種細(xì)胞外蛋白[15]，在電擊轉(zhuǎn)化法下可以表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)化率，易于構(gòu)建克隆載體的表達(dá)。近期有研究表明，芽孢桿菌可以在胞外高效表達(dá)外源性的α-淀粉酶[16]、蛋白酶和普魯蘭酶[17]，說明芽孢桿菌對外源蛋白的表達(dá)具有較為突出的優(yōu)勢。

盡管HO-1對腸黏膜屏障表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)作用，但是從動(dòng)物體內(nèi)分離的HO-1成本較高、產(chǎn)量較低，且活性不高，很難直接用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本研究對HO-1能否通過短小芽孢桿菌在體外表達(dá)進(jìn)行探討，為解決斷奶仔豬腹瀉提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 組織樣、菌株與質(zhì)粒

豬脾臟組織和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存；短小芽孢桿菌HB116、穿梭載體pNCMO2、pMD19-T載體均購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DNA聚合酶、SMART MMLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、MiniBEST Plasmid Purification Kit、膠回收試劑盒、MiniBEST DNA Fragment Purification Kit均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、KpnⅠ均購自Thermo Fisher Scientific公司；瓊脂糖購自Genview公司；Anti-6×His Tag鼠源單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG均購自Abcam公司。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中公布的HO-1基因序列(登錄號：NM_001004027.1)，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：F：5′-GCGTCGACATGGAGCACTCACAGCCCAA-3′；R：5′-R:CGGGGTACCTTAGTGATGGTGATGG-TGATGCATGGCATAAAGCCCCATGG-3′。 根據(jù)pNCMO2質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)序列，在豬HO-1基因引物序列中分別插入SalⅠ、KpnⅠ酶切位點(diǎn)及6×His標(biāo)簽。用Trizol法提取豬脾臟組織RNA，利用SMART MMLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增HO-1基因，PCR擴(kuò)增及檢測均參照溫丙言[18]方法進(jìn)行。將鑒定正確的PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化回收。

1.4 克隆載體構(gòu)建及鑒定

按照pMD19-T載體試劑盒說明將HO-1與pMD19-T載體體系混勻，16 ℃連接12～16 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min后，42 ℃ 90 s，結(jié)束后立即放在冰上5 min，在無菌操作臺中加入1 335 μL無抗LB液體培養(yǎng)基，室溫下220 r/min搖床孵育1 h。孵育結(jié)束后，取150 μL菌液涂布在LB固體(Amp+,100 μg/mL)培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。

在無菌操作臺內(nèi)使用無菌槍頭從LB固體培養(yǎng)基中挑選單個(gè)菌落接種于500 μL LB液體培養(yǎng)基(Amp+,100 μg/mL)中，37 ℃、220 r/min震蕩孵育8 h，進(jìn)行菌液PCR鑒定。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察，對擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性克隆樣品菌液提取質(zhì)粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，重組質(zhì)粒命名為pMD19-HO-1。

1.5 重組表達(dá)載體pNCMO2-HO-1構(gòu)建及鑒定

將pNCMO2與pMD19-HO-1載體使用限制性內(nèi)切酶SalⅠ、KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，37 ℃孵育30 min，酶切產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收酶切產(chǎn)物，將T4 DNA連接酶體系與純化的酶切產(chǎn)物混勻，16 ℃下孵育12～16 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。 使用LB固體培養(yǎng)基(Amp+,100 μg/mL)對陽性克隆菌進(jìn)行篩選與鑒定，方法同1.4，重組質(zhì)粒命名為pNCMO2-HO-1。

1.6 短小芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化及重組HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)

將2 mL短小芽孢桿菌菌液接種于250 mL MT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min震蕩孵育至對數(shù)生長期(D600 nm值為0.4～0.8)，冰上孵育30 min后，常溫下6 000 r/min離心10 min收集菌體，使用預(yù)冷的電擊緩沖液吹打洗滌1次，6 000 r/min離心5 min，重復(fù)3次，洗滌結(jié)束后使用100 μL電擊緩沖液懸浮菌體。取300～500 ng純化后的質(zhì)粒加入懸浮的菌液中，使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化。陽性克隆菌的篩選與鑒定同1.4。

將測序正確的重組表達(dá)載體的菌液活化，接種于MT固體培養(yǎng)基(Nm+，10 μg/mL)，37 ℃過夜孵育，挑選單菌落于5 mL MT固體培養(yǎng)基(Nm+,10 μg/mL)中，室溫下120 r/min搖床孵育48～64 h，在1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)前，構(gòu)建陽性對照(pNCMO2-BLA表達(dá)α-淀粉酶約55 ku)和陰性對照(pNCMO2空載體)，在相同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.7 SDS-PAGE電泳及Western blotting分析

對誘導(dǎo)表達(dá)HO-1的菌液5 000 r/min離心5 min，分離上清和菌體，使用相同體積的PBS對菌體重懸；使用超聲波破碎儀將收集的細(xì)菌在PBS中裂解，分離上清和菌體；將SDS上樣緩沖液加入裂解后的液體，在99 ℃沸水中孵育10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。 使用考馬斯亮藍(lán)對SDS-PAGE電泳膠進(jìn)行12～16 h染色，脫色后使用AmershamImager 600超靈敏多功能成像儀觀察蛋白表達(dá)情況。將煮沸孵育后的樣品進(jìn)行Western blotting分析，轉(zhuǎn)膜后對PVDF膜進(jìn)行封閉、洗膜、孵育；使用Amersham Imager 600進(jìn)行曝光并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 HO-1基因的克隆及鑒定

本研究克隆獲得豬HO-1基因CDS區(qū)，長約897 bp(圖1)，與預(yù)期片段大小相符。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所獲序列與GenBank中HO-1基因序列(登錄號為：NM_001004027.1)完全一致，編碼298個(gè)氨基酸。

2.2 pMD19-T-HO-1克隆載體構(gòu)建

將HO-1基因與pMD19-T載體連接，構(gòu)建重組載體pMD19-T-HO-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆經(jīng)菌液PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，在約897 bp處有目的條帶(圖2)，與預(yù)期大小相符。說明試驗(yàn)成功構(gòu)建了pMD19-T-HO-1克隆載體。

M，DL2000 DNA Marker；1，豬HO-1基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2，陰性對照M，DL2000 DNA Marker；1，PCR amplification product of porcine HO-1 gene；2，Negative control圖1 豬HO-1基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 The ectrophoresis of PCR amplification of porcine HO-1 gene

M，DL2000 DNA Marker；1，pMD19-T-HO-1重組載體；2，陰性對照M，DL2000 DNA Marker；1，pMD19-T-HO-1 recombinant vector；2，Negative control圖2 pMD19-T-HO-1重組載體菌液PCR鑒定Fig.2 The bacteria PCR identification of pMD19-T-HO-1 recombinant vector

2.3 pNCMO2-HO-1重組表達(dá)載體構(gòu)建

對表達(dá)載體pNCMO2和重組質(zhì)粒pMD19-T-HO-1進(jìn)行雙酶切后，使用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆經(jīng)菌液PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，在約897 bp處有目的條帶(圖3)，與預(yù)期大小相符；提取陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalⅠ和KpnⅠ雙酶切，在約5 200和897 bp處分別觀察到pNCMO2載體片段和HO-1基因片段(圖4)，均與預(yù)期大小相符。說明 pNCMO2-HO-1重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M，DL2000 DNA Marker；1～6，pNCMO2-HO-1重組載體；7，陰性對照M，DL2000 DNA Marker；1-6，pNCMO2-HO-1 recombinant vectors；7，Negative control圖3 pNCMO2-HO-1重組表達(dá)載體菌液PCR鑒定Fig.3 The bacteria PCR identification of pNCMO2-HO-1 recombinant expression vector

圖4 pNCMO2-HO-1重組表達(dá)載體雙酶切鑒定Fig.4 Double enzyme digestion identification of pNCMO2-HO-1 recombinant expression vector

2.4 短小芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化

將pNCMO2-HO-1重組表達(dá)載體通過電轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入短小芽孢桿菌，菌液PCR鑒定發(fā)現(xiàn)約897 bp大小片段(圖5)，與預(yù)期相符。重組菌經(jīng)SalⅠ和KpnⅠ雙酶切，分別在5 200和897 bp處獲得預(yù)期大小片段(圖6)。提示重組表達(dá)載體pNCMO2-HO-1成功轉(zhuǎn)入短小芽孢桿菌。

2.5 重組融合蛋白分析

將測序正確的質(zhì)粒pNCMO2-HO-1轉(zhuǎn)入短小芽孢桿菌，裂解菌液后經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，pNCMO2-HO-1誘導(dǎo)后上清中在36.5 ku處有明顯的蛋白條帶，而其他對照組在該位置未觀察到蛋白(圖7)，說明HO-1重組蛋白成功表達(dá)。 Western blotting結(jié)果顯示，pNCMO2-HO-1誘導(dǎo)后上清液中能夠分泌出36.5 ku的蛋白(圖8)，大小與預(yù)期相符，pNCMO2-HO-1誘導(dǎo)后全菌蛋白中未檢測到蛋白表達(dá)，說明成功表達(dá)了HO-1重組蛋白。

M，DL2000 DNA Marker；1～6，pNCMO2-HO-1重組菌液；7，陰性對照M，DL2000 DNA Marker；1-6，pNCMO2-HO-1 recombinant bateria；7，Negative control圖5 pNCMO2-HO-1重組菌PCR鑒定Fig.5 PCR identification of pNCMO2-HO-1 recombinant bacteria

M，DL5000 DNA Marker；1、2，pNCMO2-HO-1重組菌液經(jīng)Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切M，DL5000 DNA Marker；1 and 2，pNCMO2-HO-1 recombinant bacteria digestion by restriction enzyme Sal Ⅰ and Kpn Ⅰ圖6 pNCMO2-HO-1重組菌雙酶切鑒定Fig.6 Double enzyme digestion identification of pNCMO2-HO-1 recombinant bacteria

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1,pNCMO2-BLA誘導(dǎo)后上清；2，pNCMO2-BLA誘導(dǎo)后全菌；3，pNCMO2誘導(dǎo)后上清；4：pNCMO2誘導(dǎo)后全菌；5，pNCMO2-HO-1誘導(dǎo)后上清；6，pNCMO2-HO-1誘導(dǎo)后全菌M，Protein Marker;1，The supernatant of pNCMO2-BLA after induction;2，The total bacterium of pNCMO2-BLA after induction;3，The supernatant of pNCMO2 after induction;4，The total bacterium of pNCMO2 after induction;5，The supernatant of pNCMO2-HO-1 after induction;6，The total bacterium of pNCMO2-HO-1 after induction圖7 pNCMO2-HO-1表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果Fig.7 Analysis of pNCMO2-HO-1 expression by SDS-PAGE

1、3，pNCMO2-HO-1誘導(dǎo)后上清蛋白；2、4，pNCMO2-HO-1誘導(dǎo)后全菌蛋白1 and 3，The supernatant protein of pNCMO2-HO-1 after incubation;2 and 4，The total bacterium protein of pNCMO2-HO-1 after induction圖8 pNCMO2-HO-1表達(dá)產(chǎn)物Western blotting結(jié)果Fig.8 Analysis of pNCMO2-HO-1 expression by Western blotting

3 討 論

腸黏膜屏障主要是由機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障及化學(xué)屏障組成，它們可以阻止內(nèi)毒素、細(xì)菌等病原物質(zhì)進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體[19]，是影響斷奶仔豬腹瀉的一個(gè)重要因素。斷奶仔豬因其腸道系統(tǒng)發(fā)育不夠完善容易出現(xiàn)消化不良和腹瀉的現(xiàn)象，加上環(huán)境中病原微生物的入侵及消化道酶系統(tǒng)的不健全，這使其更容易患上腹瀉。仔豬腸黏膜損傷后會使腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致一些抗逆性強(qiáng)的微生物大量繁殖，阻礙仔豬的生長發(fā)育，嚴(yán)重的可以引起死亡。同時(shí)，一些抗生素的濫用導(dǎo)致這種損傷進(jìn)一步加劇。因此，腸黏膜屏障的完整性對于維護(hù)仔豬的健康至關(guān)重要。

HO在進(jìn)化上高度保守，可以參與多種生理和病理過程。作為其同工酶之一的HO-1因其重要的保護(hù)作用受到人們的廣泛研究。在腸道疾病相關(guān)的損害方面，HO-1可以發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)、抗凋亡、抗氧化等重要的保護(hù)作用；在炎癥性腸病的小鼠模型中，可通過外源性補(bǔ)充血紅素上調(diào)HO-1來改變單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤，修復(fù)腸黏膜屏障的損傷[20]；在腸缺血再灌注損傷方面，HO-1的過表達(dá)可以抑制活性氧(ROS)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)，提高損傷小鼠的成活率[21]。 近期研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)量的HO-1可以通過MAPK信號通路增加緊密連接蛋白的表達(dá)及減少凋亡因子Caspase-3的表達(dá)來修復(fù)腸上皮屏障功能障礙[22]。 此外，HO-1能減輕右旋糖酐硫酸鈉所致的腸道炎癥，減少炎癥因子TNF-α的表達(dá)，維持腸黏膜形態(tài)的完整，從而對腸黏膜屏障起到一定的保護(hù)作用[23]?；贖O-1的腸黏膜保護(hù)作用，本研究克隆出豬HO-1基因CDS序列，全長897 bp，編碼298個(gè)氨基酸。 將HO-1基因片段與pMD19-T克隆載體連接，通過陽性克隆菌的篩選與鑒定后，在897 bp處發(fā)現(xiàn)目的條帶，證明成功構(gòu)建了pMD19-T-HO-1載體。

本研究采用短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)外源性蛋白HO-1，相較于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其具有較為突出的優(yōu)勢。芽孢桿菌只有一層細(xì)胞膜，異源性蛋白在其系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)最高可以達(dá)到20 g/L以上，因此芽孢桿菌系統(tǒng)非常適合表達(dá)外源性蛋白[24]。此外，短小芽孢桿菌本身就是益生菌，沒有致病性，且不產(chǎn)生內(nèi)毒素[25]，可以產(chǎn)生多種胞外酶，同時(shí)也可以分泌抑菌物質(zhì)，高效地產(chǎn)生和分泌目標(biāo)蛋白[26]。因此，許多研究都通過芽孢桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因蛋白，如耐糖木聚糖酶[27]、IL-2[28]、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[29]等。本試驗(yàn)使用pNCMO2載體來實(shí)現(xiàn)HO-1在短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的外源性表達(dá)，相較于其他表達(dá)載體，它可以穩(wěn)定穿梭于短小芽孢桿菌和大腸桿菌之間并穩(wěn)定復(fù)制，克服了拷貝數(shù)低的問題。目前，使用pNCMO2載體實(shí)現(xiàn)了三葉因子3(TFF3)[30]、蔗糖異構(gòu)酶[31]、嗜熱脂肪芽孢桿菌WSH13-17所產(chǎn)生的α-淀粉酶[32]在芽孢桿菌系統(tǒng)內(nèi)高效表達(dá)。本研究使用限制性內(nèi)切酶對pMD19-T-HO-1和pNCMO2進(jìn)行雙酶切，在T4 DNA連接酶作用下，成功構(gòu)建了pNCMO2-HO-1重組表達(dá)載體。

本研究采用IPTG誘導(dǎo)pNCMO2表達(dá)HO-1，IPTG作為乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑，可以提高外源性蛋白的表達(dá)量并縮短表達(dá)周期[33]，從而有利于獲得大量的可溶性蛋白HO-1。本試驗(yàn)中HO-1融合蛋白在短小芽孢桿菌中經(jīng)1 mmol/L IPTG、30 ℃誘導(dǎo)一段時(shí)間后，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting分析，在裂解菌液的上清中鑒定到重組蛋白，大小為36.5 ku，表明重組菌誘導(dǎo)出來的蛋白是以可溶性蛋白的形式存在于上清之中，HO-1序列中添加了6個(gè)His標(biāo)簽，并沒有干擾融合蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。因此，利用短小芽孢桿菌可以用于工業(yè)化生產(chǎn)黏膜保護(hù)因子HO-1，為治療仔豬腹瀉奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究克隆出HO-1基因并連接到pNCMO2表達(dá)載體中，使用短小芽孢桿菌HB116作為表達(dá)載體宿主菌，誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blotting鑒定確定有融合目的蛋白表達(dá)，且獲得的融合蛋白具有良好的抗原性和特異性。