黨瑞瑩，常軍帥,梁 晏，屈勇剛，李彥芳，程璐璐，劉若彤，楊盛源,王紫陽，張小玉，趙 玉，周海琴，謝枋得

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003；2.動物疾病防控兵團重點實驗室，石河子 832003)

奶牛乳腺炎是阻礙奶牛業(yè)發(fā)展最常見的疾病之一，據(jù)統(tǒng)計，全球約有30%的奶牛患有此病[1]。該病由病原微生物引發(fā)的比例高達85%[2]，其中以細菌占比最高。金黃色葡萄球菌是一種能侵染奶牛乳腺并引發(fā)奶牛乳腺炎的細菌，在由細菌作為主要病原微生物的病例中占據(jù)一定比例[3]，其傳統(tǒng)的治療藥物是抗生素，但由于抗生素的長期使用，致病菌株逐漸對抗生素產(chǎn)生耐藥性，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和抗萬古霉素金黃色葡萄球菌(vancomycinresistantS.aureus，VRSA)等耐藥菌株越來越多，給該病治療帶來極大困難[4-6]。因此，尋找可代替抗生素治療的制劑更為重要。

噬菌體作為細菌的天然殺手，以一種非傳統(tǒng)的抗菌劑形式而備受關(guān)注。Capparelli等[7]用感染金黃色葡萄球菌的小鼠作為動物模型進行噬菌體治療試驗，其治愈率高達97%。李隴平[8]采用噬菌體乳頭藥浴試驗對患乳腺炎的奶牛進行治療，結(jié)果表明治療組奶牛乳區(qū)發(fā)病率降低了1.97%。本研究以實驗室分離出的奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌82為宿主菌，按照裂解性噬菌體的分離方法，分離純化裂解性噬菌體，并對其物理和生物化學(xué)特性、抑菌能力等進行初步研究，以期篩選出噬菌譜寬、效價高、裂解能力強的金黃色葡萄球菌噬菌體候選株，用于制備噬菌體“雞尾酒”制劑防治奶牛乳腺炎。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品來源

試驗所用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、糞腸球菌均由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室分離鑒定，主要分離于患乳腺炎奶牛的乳汁樣品。采集石河子某奶牛場的污水、擠奶廳的棄奶和糞便并將其混合,作為分離噬菌體的來源。

1.2 主要試劑及儀器

BHI培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉、PEG8000、2%磷鎢酸負染液均購自北京索萊寶科技有限公司；病毒基因 DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNaseⅠ、RNase A和Mung Bean Nuclease 均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；SM緩沖液購自上海源葉生物科技有限公司。

MultifugeXLR臺式冷凍離心機購自賽默飛世爾科技有限公司；IS-RDV1立式恒溫振蕩器購自精騏有限公司；智能電熱恒溫水浴鍋購自北京永光明醫(yī)療儀器廠；HT7700透射電子顯微鏡購自日立(中國)有限公司。

1.3 噬菌體富集

將在奶牛場采集的污水、奶廳的棄奶和糞便樣品混合，用玻璃攪拌器攪拌均勻，用折疊4層的紗布過濾，將濾好的液體加到適量的BHI液體培養(yǎng)基中。將金黃色葡萄球菌82的菌液培養(yǎng)至對數(shù)期，取200 μL滴加到上述BHI液體培養(yǎng)基。37 ℃恒溫搖床180 r/min培養(yǎng)6 h，將樣品置于4 ℃離心機中12 000 r/min離心10 min，收集上清，用0.22 μm濾器過濾除菌，濾液即為噬菌體懸液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 噬菌體分離與純化

參考張玉宇等[9]，采用點滴法及雙層瓊脂平板法分離純化噬菌體。用滅菌棉簽蘸取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌82菌液均勻涂布于BHI瓊脂平板表面，吸取2.5 μL噬菌體懸液滴在上述BHI瓊脂平板中央，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，待出現(xiàn)肉眼可見的溶菌空斑時，用無菌槍頭挑取單個透亮的噬菌斑，用雙層瓊脂平板法進行噬菌體的純化，直至觀察到形態(tài)一致和大小均一的噬菌斑。

1.5 噬菌體濃縮與電鏡觀察

參考文獻韓傳銀[10]，采用PEG8000對噬菌體進行濃縮。吸取100 μL濃縮后的噬菌體液滴加到銅網(wǎng)上，吸附5 min，用濾紙吸收殘余液體，置銅網(wǎng)于2%磷鎢酸染液中染色3 min，取出銅網(wǎng)，待自然干燥，通過透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.6 噬菌體基因組分析

采用柱提法提取噬菌體基因組，取3份10 μL的噬菌體基因組，分別加入DNaseⅠ、RNase A和Mung Bean Nuclease酶各1 μL，37 ℃處理1 h處理后的樣品加入適量Loading Buffer，用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其核酸類型。

1.7 噬菌體生物學(xué)特性分析

1.7.1 噬菌體效價測定 用BHI液體培養(yǎng)基將已純化的噬菌體液進行10倍倍比稀釋。不同稀釋度的噬菌體液各取100 μL，再各加100 μL宿主菌液(1×108CFU/mL)，輕搖混勻后靜置吸附10 min，運用雙層瓊脂平板法進行培養(yǎng)。 選噬菌斑數(shù)量在30～300的平板(直徑為 90 mm)進行計數(shù)。試驗重復(fù)3次，噬菌體效價依據(jù)以下公式進行計算：

噬菌體效價(PFU/mL)=平板上的密度適當(dāng)?shù)氖删邤?shù)平均值×稀釋倍數(shù)×10

1.7.2 噬菌體裂解譜測定 取培養(yǎng)至對數(shù)期的63株金黃色葡萄球菌、5株大腸桿菌、4株鏈球菌、4株糞腸球菌的菌液均勻涂布于BHI固體平板上，取109PFU/mL的噬菌體液 5 μL 點樣于涂滿菌液的 BHI平板上，平板晾干后37 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察裂解效果。

1.7.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的測定 參考Heo等[11]方法略有改進，將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，按照不同MOI(0.0001、0.001、0.001、0.01、0.1、1、10和100)加入相應(yīng)的噬菌體液并混勻，靜置吸附10 min，再加入適量BHI液體培養(yǎng)基，使總體積至5 mL。在37 ℃、180 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)4 h，采用雙層瓊脂平板法測定不同MOI的噬菌體效價。 試驗反復(fù)進行3次，取平均值。

1.7.4 一步生長曲線的測定 將處于對數(shù)期的宿主菌與噬菌體按照測定好的最適MOI加入試管中，再加入適量的液體BHI,靜置10 min后于37 ℃、180 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，分別在不同時間(5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、110、130、150、170、190、210、230 min)取5 mL培養(yǎng)液，將混合培養(yǎng)液離心，測定各時段的噬菌體效價，試驗反復(fù)進行3次，計算平均值繪制噬菌體的一步生長曲線圖。

1.7.5 熱穩(wěn)定性測定 取等體積的109PFU/mL的噬菌體液加到無菌離心管內(nèi)，依次進行不同溫度(40、50、60、70和80 ℃)的恒溫水浴，各組分別在20、40和60 min時取樣，再放入4 ℃冰箱中平衡溫度，測定噬菌體效價。該試驗反復(fù)進行3次，計算平均值繪制熱穩(wěn)定性曲線。

1.7.6 pH穩(wěn)定性測定 吸取100 μL噬菌體置于1.5 mL EP管里，再加入900 μL已調(diào)節(jié)pH為2.0～13.0的BHI培養(yǎng)基中10倍稀釋。將其混勻后，37 ℃恒溫孵育，分別在1、2和3 h取樣，以雙層瓊脂平板法測定不同組的噬菌體效價。試驗反復(fù)進行3次，計算平均值繪制pH穩(wěn)定性柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的純化及電鏡觀察

用雙層瓊脂平板法獲得1株噬菌體，對其進行反復(fù)純化，得到純化后的噬菌體，噬菌斑邊緣整齊，均一透亮，直徑為1～2 mm(圖1)。

在電鏡下，獲得的噬菌體頭部呈二十面體，大小約120 nm×83 nm，有一條帶伸縮尾鞘的長尾，尾部的尾絲和尾針明顯，長約126 nm，符合有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科的形態(tài)特征(圖2)。根據(jù)《病毒分類—國際病毒分類委員會第9次報告》[12]中對噬菌體分類與命名，將其命名為 vB_SMC_P82(簡稱P82)。

2.2 噬菌體P82的核酸類型

噬菌體P82的核酸經(jīng)DNase Ⅰ、RNase A、Mung Bean Nuclease分別處理后，通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定,由圖3可知，DNase Ⅰ可消除噬菌體P82的核酸,而RNase A、Mung Bean Nuclease不能將其消化,可判定其核酸類型為雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)。

2.3 噬菌體P82的生物學(xué)特性

2.3.1 噬菌體P82效價 通過雙層平板瓊脂法測定可知，該噬菌體效價為1.58×109PFU/mL。

2.3.2 噬菌體P82裂解譜 由表1可知，噬菌體P82對63株奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌中的23株有裂解作用，裂解率為36.51%；其中對MRSA類菌株的裂解率為45.95%(17/37)；對VRSA類菌株的裂解率為23.08%(6/26)。說明該噬菌體有較寬的裂解譜。噬菌體P82對5株大腸桿菌、4株鏈球菌、4株糞腸球菌均未發(fā)現(xiàn)有裂解現(xiàn)象。

2.3.3 噬菌體P82最佳MOI 由圖4可知，當(dāng)MOI為100時，噬菌體P82效價最低，當(dāng)MOI為0.001時，噬菌體P82效價最高，約為2.3×1010PFU/mL。因此，該噬菌體的最佳MOI為 0.001。

圖1 噬菌斑形態(tài)Fig.1 Plaques morphology

圖2 噬菌體透射電鏡觀察(60 000×)Fig.2 TEM observation of the phage (60 000×)

M,DL15000 DNA Marker;1,噬菌體P82核酸;2～4,噬菌體P82核酸分別經(jīng) DNase Ⅰ、RNase A和Mung Bean Nuclease處理M,DL15000 DNA Marker;1,Nucleic acid of phage P42;2-4,Nucleic acid of P82 treated with DNase Ⅰ,RNase A and Mung Bean Nuclease，respectively圖3 噬菌體P82核酸類型鑒定Fig.3 Identification of nucleic acid type of phage P82

表1 噬菌體P82的裂菌譜

續(xù)表

圖4 噬菌體P82最佳MOI的測定Fig.4 Determination of optimal MOI for phage P82

2.3.4 噬菌體P82一步生長曲線 由圖5可知，噬菌體P82感染宿主菌后的25 min內(nèi)效價無明顯變化，判定其潛伏期約為25 min。在25～70 min內(nèi)，噬菌體效價一直保持升高態(tài)勢，隨后趨于穩(wěn)定，可判定該噬菌體P82的爆發(fā)期約為45 min，裂解量約為74 PFU/cell。

2.3.5 噬菌體P82熱穩(wěn)定性 由圖6可知，在 40～50 ℃作用 1 h 后，噬菌體P82的效價幾乎無變化，活性基本不受影響；噬菌體P82效價拐點約在60 ℃，此時出現(xiàn)下降趨勢；噬菌體P82在80 ℃作用40 min后完全喪失活性。

2.3.6 不同pH對噬菌體P82活性的影響 不同pH對噬菌體活性的影響結(jié)果顯示，在pH 2.0和13.0時噬菌體P82完全喪失活性； 在pH 4.0～12.0范圍內(nèi)，噬菌體P82效價與初始效價無顯著性差異(圖7)?？膳卸ㄊ删wP82具有較廣的pH適應(yīng)范圍。

圖5 噬菌體P82一步生長曲線Fig.5 One-step growth curve of phage P82

圖6 噬菌體P82熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of phage P82

圖7 不同 pH 對噬菌體P82活性的影響Fig.7 Influence of different pH on activity of phage P82

3 討 論

MRSA 和 VRSA 菌株等金黃色葡萄球菌耐藥變異株的增多使金黃色葡萄球菌引發(fā)的奶牛乳腺炎的治療難度增加。目前噬菌體被視為一種新型的生物抗菌劑。國內(nèi)外許多學(xué)者已在金黃色葡萄球菌噬菌體的生物學(xué)特性、全基因組、食品抗菌、疾病治療等方面進行了相關(guān)研究[13-15]。

本研究以患乳腺炎的奶牛乳汁中分離的金黃色葡萄球菌為宿主，分離到1株烈解性噬菌體P82，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)噬菌體P82屬于有尾噬菌體目中的肌尾噬菌體科，與范錦戴等[16]、張志宏等[17]、涂尊方等[18]和鞠磊等[19]分離的噬菌體屬于同一個科。噬菌體P82在宿主菌上的最佳 MOI 為 0.001，效價可達到1010PFU/mL。與范錦戴等[16]和張志宏等[17]分離的金黃色葡萄球菌噬菌體相比，噬菌體P82的裂解能力更強，在相同時間和條件下，可更快收獲高效價的噬菌體P82懸液，這為將來大量制備噬菌體奠定了基礎(chǔ)。宿主譜測定結(jié)果表明，噬菌體P82對奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌裂解率為36.51%(23/63)，且對MRSA類菌株裂解率較高(45.95%)，比涂尊方等[18]分離出的金黃色葡萄球菌噬菌體的裂解譜更廣。本試驗對噬菌體P82進行了理化特性和生物學(xué)特性的初步分析，結(jié)果表明，該噬菌體在60 ℃以下，pH 4.0～12.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。噬菌體P82的高溫耐受能力明顯強于Li等[20]和Kraushaar等[21]發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌噬菌體，對pH的耐受能力強于陳岡等[22]報道的金黃色葡萄球菌噬菌體(pH 5.0～9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定)。噬菌體P82具有良好的溫度和酸堿度耐受能力，后期可將其用于動物體表和環(huán)境的消毒。噬菌體P82在感染宿主菌前存在約25 min的潛伏期，45 min的爆發(fā)期，裂解量約為74 PFU/cell。 與范錦戴等[16]分離的金黃色葡萄球菌噬菌體的裂解量(約80 PFU/cell)無顯著差異，高于蔡天舒等[23]所發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌噬菌體的裂解量(32.2 PFU/cell)。上述結(jié)果表明，噬菌體P82可快速感染金黃色葡萄球菌，將其裂解，從而起到良好的殺菌作用。

噬菌體治療奶牛乳腺炎生產(chǎn)成本低、副作用少、應(yīng)用廣泛，同時還可采用噬菌體“雞尾酒”療法來規(guī)避單一噬菌體的宿主譜窄的問題。Koen等[15]建立小鼠乳腺炎模型時采用噬菌體雞尾酒進行治療，可安全有效地降低乳腺內(nèi)病原菌的數(shù)量。本試驗所篩選的噬菌體P82具有較廣的裂解譜、較高的裂解能力和較好的穩(wěn)定性，為后期研發(fā)噬菌體微生態(tài)制劑或作為環(huán)境消毒劑等工作奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗分離純化出1株奶牛乳腺炎源金黃色葡萄球菌噬菌體P82，當(dāng)MOI為0.001時，其效價可達1010PFU/mL，對63株金黃色葡萄球菌裂解率為36.51%，該噬菌體對宿主菌的裂解量約為74 PFU/cell，且對溫度和酸堿度耐受范圍較廣，后期可作為防治奶牛乳房炎的噬菌體候選株。