李文秀,賀軍軍,張華林,翁俊亮,李進(jìn)良,羅 萍

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站/廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)中心，廣東 湛江 524091; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091)

【研究意義】巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)為大戟科(Euphobiaceae)橡膠樹屬(Hevea)多年生喬木，染色體2n=2x=36，原產(chǎn)于亞馬遜森林[1]，在我國主要分布于海南、云南和廣東等省份。天然橡膠是主要的工業(yè)原料之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、交通和國防等方面，是無污染可再生的重要自然資源[2]。根據(jù)國際橡膠研究組織提出的意見，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，全球?qū)ο鹉z的需求將會持續(xù)增加[3]。橡膠樹雜交育種是最常規(guī)的育種方法，也是選育優(yōu)良橡膠樹品種的一個(gè)基本策略[4]。在橡膠育種實(shí)踐中，優(yōu)良品種的選擇一般須通過有性雜交。橡膠樹雜交育種是指選擇各種特異親本進(jìn)行雜交，在子代中選擇優(yōu)良單株，利用芽接擴(kuò)繁優(yōu)良無性系進(jìn)行推廣，是橡膠樹優(yōu)良品系創(chuàng)育的一個(gè)基本策略[5]。實(shí)踐證明，通過雜交育種，育種家們選育出了一批優(yōu)良品種，如熱研7-33-97[6]、熱墾525[7]、PR107[8]、RRIM600[9]、GT1和PB86[10]等品種。提前發(fā)現(xiàn)雜交子代的優(yōu)劣能反映出親本雜交的有效性，縮短育種進(jìn)程，及時(shí)更正育種策略。目前，經(jīng)有性雜交選育出的抗寒性強(qiáng)產(chǎn)量中等湛試327-13、湛試327-4等[11]優(yōu)良品系，都來自同一對親本，這反映出了親本選配合理，能將部分優(yōu)良性狀傳遞給后代，縮短了品種選育的成本與時(shí)間。將傳統(tǒng)表型方法與標(biāo)記選擇相結(jié)合，可以更準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)雜交后代的鑒定。形態(tài)鑒定雖然直接方便，但數(shù)量有限，易受環(huán)境影響。研究表明，具有相似形態(tài)的相似個(gè)體可能包含較大的遺傳變異，這些變異可以通過分子標(biāo)記來識別[12]。SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[13]，已被廣泛應(yīng)用于橡膠樹種質(zhì)資源的研究，如構(gòu)建橡膠樹遺傳圖譜[14]、種質(zhì)多態(tài)性分析[13]、品種鑒定[15]、遺傳多樣性分析[16]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在其他作物上，表型特征和分子標(biāo)記用于雜交后代雜種優(yōu)勢評價(jià)和遺傳多樣性分析已較為普遍。如Monica等[17]利用SRAP標(biāo)記研究了花生殖細(xì)胞及其F1代的遺傳變異及親緣關(guān)系。Gao等[18]利用12個(gè)表型和11個(gè)SRAP標(biāo)記對45個(gè)牡丹品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。此外，橡膠樹表型多樣性分析也有相關(guān)的研究報(bào)道[19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于橡膠親本基因雜合度高，F(xiàn)1雜種往往存在較大差異。且到目前為止，橡膠樹F1雜種的遺傳特征和優(yōu)劣特性研究依然比較有限?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究分別以PR107和93-114為父本和母本，通過剖析親本以及雜交后代群體的重要性狀和遺傳關(guān)系，從而鑒定出雜交子代的變異程度及優(yōu)劣情況，旨在為橡膠樹雜交育種和親本選配提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供樣材料來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站收集保存的93-114(母本)和PR107(父本)35份雜交后代群體資源，葉片形態(tài)如圖1所示，于2016年建立親本和后代群體的初級系比試驗(yàn)區(qū)，試驗(yàn)區(qū)分為3個(gè)小區(qū)，每小區(qū)按照株行距為3 m×3 m隨機(jī)種植親本和后代群體，每份資源相鄰種植3株，共3次重復(fù)。

圖1 雜交子代葉片形態(tài)

SSR標(biāo)記：104對SSR引物，24對來自Souza[20]，4對來自Saha[21]，5對來自謝黎黎[22]，71對來自Gouva[23]，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，每對引物都進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表型性狀的調(diào)查 型性狀主要調(diào)查橡膠樹莖干、產(chǎn)量和葉片等相關(guān)性狀，包括26個(gè)描述性狀和6個(gè)測量性狀。按照黃華孫編寫的《橡膠樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[24]對26個(gè)描述性狀進(jìn)行調(diào)查，具體調(diào)查性狀和分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。大葉柄長度，小葉柄長度，小葉枕膨大長度，主測脈角度4個(gè)性狀利用直尺和角度尺進(jìn)行測量，每份資源測量3株，每株取5個(gè)重復(fù)。樹圍從2017年開始進(jìn)行測量，每年12月用卷尺測量距離地面1 m處周長，用厘米進(jìn)行表示。割膠參考Souza[25]的方法，在2020年9月和12月，使用S/2 d/3方法，在離地面50 cm的地方進(jìn)行開割，每次割5刀，收集乳膠進(jìn)行烘干稱重，以克進(jìn)行計(jì)量，每株產(chǎn)量計(jì)算方法以1刀進(jìn)行計(jì)算，取3個(gè)小區(qū)的平均值得出。

表1 橡膠樹F1性狀描述分級

續(xù)表1 Continued table 1

1.2.2 基因組DNA提取 參考Murray等[26]的方法對橡膠樹基因組葉片DNA進(jìn)行提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度與濃度，原液保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物篩選 用4份(PR107，93-114，A4和A8)表型差異較大的材料對合成的104對引物進(jìn)行篩選，選出擴(kuò)增效果好、條帶清晰穩(wěn)定的多態(tài)性引物15對，引物序列如表2所示。

表2 橡膠樹SSR引物名稱及序列

1.2.4 SSR-PCR體系 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在TAKARA TP-600 PCR儀上進(jìn)行。采用10 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包含DNA模板1 μL，ddH2O 4 μL，4 μL mix，上游引物和下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件參考Liu等[27]的做法：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，復(fù)性30 s(溫度以引物最適退火溫度而定)，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.5 PAGE凝膠電泳及檢測 采用6%聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電壓180 V，電流80 A，時(shí)間60～90 min。銀染方法參考Creste等[28]的方法。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 在Excel 2016中計(jì)算各性狀的變異系數(shù)和多樣性系數(shù)[29]；在Excel中計(jì)算每份材料年平均生長量，并使用ORIGIN v7.0繪制圖表。采用SPSS 21.0軟件計(jì)算最大值、最小值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)算中親值和雜種優(yōu)勢如下公式所示：

MPs= (P1+P2)/2

對擴(kuò)增穩(wěn)定清晰的條帶采用“0-1”記錄其位置，在相同的遷移位置上的條帶標(biāo)記為“1”，無帶標(biāo)記為“0”，建立0、1的SSR標(biāo)記矩陣圖。

先用DataFormater軟件[30]進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，利用 NTSYS-pc V2.10 軟件按UPGMA方法進(jìn)行聚類分析；利用PopGen3.2計(jì)算群體的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)、Shannon’s信息指數(shù)(I)；使用Powermaker Version3.25軟件計(jì)算PIC值和基因型數(shù)；利用MEGA(V7.0)和ITOL在線工具graphic (https://itol.embl.de/)進(jìn)行遺傳距離分析和繪制樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀的多樣性分析

橡膠樹93-114×PR107組合雜交子代F1群體主要表型性狀的變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)見表3，32個(gè)表型性狀的平均變異系數(shù)為32.59%，變異系數(shù)最大的表型性狀是葉枕溝(60.90%)，最小的是小葉柄溝(0)。變異系數(shù)超過50%的有葉枕溝和大葉柄形狀，說明這2個(gè)性狀變異較豐富。而小葉柄溝(0)、小葉枕膨大(22.88%)、葉片質(zhì)地(19.40%)、葉片顏色(18.14%)、三小葉間距(13.30%)、大葉柄長度(14.32%)和主側(cè)脈角度(3.66%)變異系數(shù)均低于25%，表明以上性狀遺傳特性較穩(wěn)定；其中小葉柄溝和主側(cè)脈角度變異系數(shù)接近于0，說明這2個(gè)性狀在雜交子代中基本沒有差異。

表3 雜交后代F1群體的變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)

續(xù)表3 Continued table 3

32個(gè)表型性狀多樣性指數(shù)分布在3.22～3.53，平均值為3.46，表明雜交子代表型性狀分布較為均勻。多樣性指數(shù)受種數(shù)和均勻度的影響，在種數(shù)相同的情況下，Shannon指數(shù)越大，均勻性越好。其中，小葉柄溝(3.56)多樣性指數(shù)最大，其分布較為均勻；而葉枕溝(3.26)的多樣性指數(shù)最小，分布最不均勻。總體上，32個(gè)性狀的多樣性指數(shù)較大，且差異較小，表明表型性狀在供試材料中分布較為均勻。

2.2 產(chǎn)量和樹圍雜種優(yōu)勢分析

雜交后代和親本的樹圍和產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表4)顯示，雜交后代的平均樹圍較親本有所增加，而平均產(chǎn)量較親本有所減少。雜交后代的平均樹圍和年樹圍增長量均大于中親值，雜種優(yōu)勢分別為101.2%和117.2%，雜種優(yōu)勢較強(qiáng)，這與小麥的雜種育種較為相似，雜交種雜種優(yōu)勢通常會高于中親值[31]。而平均產(chǎn)量較中親值卻稍有下降，雜種優(yōu)勢為95.38%，處于中親本優(yōu)勢。但值得注意的是，有40%雜交后代的產(chǎn)量高于雙親，說明在F1雜種中仍然可以選擇高產(chǎn)單株。

表4 雜種優(yōu)勢

2.3 雜交后代樹圍和產(chǎn)量比較分析

在35個(gè)雜交后代中，產(chǎn)量最高的是材料A38，最低的是A9。從圖2可以看出，12月份的產(chǎn)量數(shù)據(jù)中，材料A38、A22、A12和A25單株產(chǎn)量均在20 g以上，其中A38產(chǎn)量最高，單株產(chǎn)量超過25 g，產(chǎn)量最低的是A9。9月份的產(chǎn)量數(shù)據(jù)中，A29、A25、A24、A26、A38單株產(chǎn)量均超過5 g，其中A29單株產(chǎn)量最高，產(chǎn)量最低的也是A9。綜合來看，A38的平均產(chǎn)量最高，A9的平均產(chǎn)量最低。

圖2 雜交子代早期試割產(chǎn)量

從圖3中可以看出，A22每年都是樹圍最大的材料，最大樹圍材料與最小樹圍材料的差異在逐年增大。2017—2020年4年期間，材料A22的樹圍最大(39.3 cm)，而A8、A23、A21和A23分別是每年樹圍最小的材料，極差分別為4.6、8.9、9.6和10.8 cm，可以看出，極差每年都在增大，最小樹圍材料每年都在輪換，說明個(gè)別材料前期生長慢，但后期生長會逐漸加快。此外，2017—2020年，雜交后代樹圍年生長量為5.6～10.4 cm，平均年生長量為6.7～8.8 cm(表5)，年均周長增量逐年降低，說明苗期生長速度快于后期。

表5 雜交子代樹圍的年生長量

圖3 2017—2020年雜交子代樹圍生長

2.4 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用表型差異較大的4個(gè)材料對104對引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選了15對多態(tài)性引物，利用15對引物對親本和雜交后代進(jìn)行多態(tài)性檢查，結(jié)果(表6)表明，每對引物位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～4個(gè)，平均為3個(gè)，有效等位基因數(shù)在1.4706～3.6953，所用引物位點(diǎn)Shannon’s指數(shù)、觀測雜合度(Ho)、預(yù)期雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)分別在0.5004～1.3459、0.1714～1.0000、0.3246～0.7400和0.2710～0.6827，其中ACT59(0.2710)位點(diǎn)的多態(tài)性最低，ACT61(0.6827)位點(diǎn)的多態(tài)性最豐富。

表6 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

2.5 SSR聚類分析

聚類分析結(jié)果(圖4)表明，35個(gè)雜交后代可分為3類，遺傳相似系數(shù)在0.54～0.89(結(jié)果未列出)，雜交產(chǎn)生的遺傳變異較多，個(gè)體間遺傳變異較明顯。其中12個(gè)雜交后代 (A35、A1、A17、A16、A27、A20、A6、A31、A19、A2、A42和A40)和父本66 (PR107)分為第一組(I)；另外20個(gè)雜交后代(A4、A13、A9、A43、A36、A30、A29、A24、A38、A23、A28、A39、A33、A10、A25、A45、A21、A12、A37、A22)組成第二組(II)；母本45(93-114)和材料A8、A11和A32形成第三組(III)。此外，由于標(biāo)記數(shù)量有限，在進(jìn)化樹中分辨率不夠高，無法區(qū)分某些雜交后代，如材料A12和A22。

圖4 雜交子代SSR聚類分析

3 討 論

對于基因型高度雜合作物，獲得新類型材料和選育有價(jià)值新品種的一個(gè)有效辦法就是開展雜交育種[32]。開展雜交育種的前提是選擇性狀優(yōu)良互補(bǔ)、遺傳差異較大和一般配合力強(qiáng)的親本，然后通過研究雜交后代的遺傳和變異規(guī)律，了解性狀組合情況及遺傳傾向[33]，最終選出理想的品系或品種。

本研究對35份PR107和93-114組合F1雜交后代的32個(gè)主要表型性狀的變異類型和形態(tài)多樣性進(jìn)行分析，雜交后代平均變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)分別為32.59%和3.46，具有豐富的形態(tài)多樣性。這說明了雜交親本基因型高度雜合，對于選出具有雜種優(yōu)勢的材料具有重要的意義。葉枕溝(60.90%)和大葉柄形狀(50.75%)2個(gè)性狀變異較大，結(jié)果與張曉飛等[34]對119份橡膠樹栽培種的21個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行比較分析的結(jié)果較為類似；與之不同的是遺傳多樣性指數(shù)平均值，張曉飛得出的結(jié)果是0.83，而本研究是3.46，其中的差異有待后續(xù)研究。另外，在本研究中，變異系數(shù)很低的情況下遺傳多樣性系數(shù)一樣也很高。變異系數(shù)和多樣性指數(shù)都是反映材料多樣性的重要指標(biāo)，變異系數(shù)反映的是變異類型的離散程度，遺傳多樣性系數(shù)反映的是性狀分組數(shù)目和組內(nèi)性狀分布的均勻程度[35]，兩者不存在相關(guān)關(guān)系。

利用該組合和雜交后代群體有可能篩選出高產(chǎn)子代和速生子代。樹圍和年增量的雜種優(yōu)勢指數(shù)均大于100%，但產(chǎn)量雜種優(yōu)勢小于100%，表明在樹圍和產(chǎn)量上均存在雜種優(yōu)勢，但產(chǎn)量在該雜交后代群體中稍弱。比較2020年9月和12月的產(chǎn)量結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量曲線趨勢基本一致，說明產(chǎn)量結(jié)果可靠，可重復(fù)性好。唯一的偏差是材料A12，其結(jié)果的準(zhǔn)確性有待日后再次驗(yàn)證。

產(chǎn)量和樹圍綜合分析結(jié)果表明，材料A38和A22在雜交后代綜合表現(xiàn)較好。通過比較樹圍和產(chǎn)量數(shù)據(jù)，雜交后代中，A22、A43和A38的樹圍較好，樹圍生長顯著快于親本；A38、A22和A25是雜交后代中產(chǎn)量最高的3個(gè)材料。因此，綜合來看，材料A38和A22是較好的種質(zhì)。

通過對雜交后代的遺傳多樣性分析，了解親本選配和雜交后代遺傳背景情況，對育種工作具有重要的指導(dǎo)意義。PR107是初生代無性系[5]，具有的優(yōu)良特征描述，以PR107為親本，先后選育出的品種有熱研7-33-97、云研77、大豐95等[36]；品種93-114是華南熱帶作物科學(xué)研究院粵西試驗(yàn)站于1967年從無性系天任31-45和合口3-11雜交子代中選育的次生代無性系，抗寒力強(qiáng)，抗風(fēng)能力好[37]。本研究應(yīng)用分子標(biāo)記對35份PR107和93-114雜交后代進(jìn)行了遺傳多樣性分析，雜交后代中大多數(shù)位點(diǎn)與父本PR107的基因型位點(diǎn)相似，說明PR107和93-114組合雜交F1代更偏向于父本遺傳。遺傳多樣性分析結(jié)果可將雜交后代分為3類，材料類型較為豐富，反映出雜交親本的選配合理。本研究從表型性狀和分子標(biāo)記兩個(gè)方面分析了親本和雜交子代群體的遺傳特性和遺傳分化，為親本組合的甄選和雜交后代的差異分析等工作提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

93-114×PR107雜種F1表型性狀的變異系數(shù)和多樣性指數(shù)分別為32.59%和3.49%。雜種優(yōu)勢分析表明，雜種一代的樹圍雜交優(yōu)勢比產(chǎn)量強(qiáng)。綜合產(chǎn)量和周長分析結(jié)果表明，A38和A22在雜交種中表現(xiàn)較好。利用UPGMA對雜交種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，雜交種可分為3個(gè)類群。