李 輝，龔 輝，唐映紅，程新奇

（1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2，湖南省棉花科學(xué)研究所，湖南 常德 415000）

近年來，隨著中國經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，居民生活水平不斷提高，高血壓、糖尿病等很多慢性疾病的患者人數(shù)日益增多，這些慢性疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了人們的身體健康。研究表明富含抗性淀粉的食物對(duì)這些疾病具有很好的預(yù)防效果[1-2]。抗性淀粉（Resistant Starch,簡稱RS）是指在健康人體的小腸中不能被消化吸收，但在大腸中能夠被益生菌發(fā)酵分解的淀粉[3-4]。食用抗性淀粉可以增加飽腹感、降低動(dòng)物血清總膽固醇濃度、降低餐后血糖水平、對(duì)于非胰島素依賴型糖尿病和心血管疾病等具有輔助治療作用[5-6]。同時(shí)，抗性淀粉還具有減少腸機(jī)能失調(diào)及結(jié)腸癌發(fā)病率、提供能量以及防止脂肪堆積等重要生理功能[7-8]。稻米成分主要包含支鏈淀粉、直連淀粉和抗性淀粉，多數(shù)水稻品種的抗性淀粉含量在1%左右，只有少數(shù)接近3%[9]。因此，選育富含抗性淀粉的水稻品種對(duì)保持人類健康具有重要意義。

稻米淀粉的形成是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，需要一系列酶的共同催化，催化淀粉合成的酶主要包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP glucose pyrophosphorylase，AGP）、淀粉合成酶（Starch synthase，SS）、淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）和淀粉脫支酶（Starch debranching enzyme，DBE）。葡萄糖焦磷酸化酶是催化淀粉合成的第一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控步驟。淀粉合成酶的功能是將葡萄糖殘基加到引物的非還原端延長葡聚糖的線性糖鏈。淀粉合成酶有顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（GBSS，包括GBSSI 和GBSSII）和可溶性淀粉合成酶（SSS）。GBSS 主要生物學(xué)功能是延長葡聚糖鏈，形成高聚合度的直鏈淀粉[10]。GBSSI 由Wx基因編碼，Wx基因突變體胚乳總淀粉含量變化不明顯，但是直鏈淀粉含量顯著減少甚至完全缺失[11-13]。SSS 有4 種同工酶，負(fù)責(zé)支鏈淀粉的生物合成，催化較低葡萄糖基聚合度的短直鏈淀粉。

淀粉分支酶（SBE）催化α-1-4 糖苷鍵的斷裂，同時(shí)將斷裂的低聚糖鏈與α-1-6 糖苷鍵形成新的分支。SBE 由SBE1、SBEII 組成。SBEI 主要產(chǎn)生DP大于16 的長鏈淀粉，而SBEII 主要產(chǎn)生DP 小于12的短鏈淀粉。在單子葉植物中SBEII 存在兩種異構(gòu)體SBEIIa 和SBEIIb。SBEIIa 在植物的所有組織中都有表達(dá)，而SBEIIb 在胚乳中特異性表達(dá)。降低與支鏈淀粉合成相關(guān)基因SBEIIb 的表達(dá)可以增加玉米、小麥胚乳中直鏈淀粉的含量[14-15]。劉素君等研究表明直鏈淀粉的含量與抗性淀粉的含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[16-18]。通過RNA 干擾技術(shù)抑制水稻中淀粉分支酶SBE1 和SBEII 基因的表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因水稻直鏈淀粉的含量從27.2%提高到64.8%，同時(shí)抗性淀粉的含量從0 提高到了14.6%[19]。通過基因編輯的方法抑制OsSBEIIb基因在水稻灌漿期的表達(dá)量，降低支鏈淀粉的含量，使得直鏈淀粉的含量從19.6%提高到27.4%，促使抗性淀粉的含量從0.2%提高到17.2%[10]?？梢姡镜矸鄯种窸sSBEIIb基因的表達(dá)與水稻抗性淀粉的含量密切相關(guān)。

研究以湘早秈稻2 號(hào)為試驗(yàn)材料，克隆了OsSBEIIb基因的編碼序列，并分析了其時(shí)空表達(dá)特征以及OsSBEIIb基因在不同水稻品種中的變異情況，以期為抗性淀粉水稻育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料的種植

試驗(yàn)共35 個(gè)水稻品種（見表1），由湖南省水稻研究所種質(zhì)資源研究室提供。挑選籽粒飽滿，大小均勻的種子，于2020 年3 月下旬播種于湖南文理學(xué)院生物園，當(dāng)秧苗長到3 葉一心時(shí)移栽到肥力中等的水稻田。移栽后按正常的大田管理措施進(jìn)行管理，及時(shí)清除雜草并進(jìn)行病蟲害的防治。在水稻灌漿時(shí)期分別選取正在灌漿的稻穗，液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

表1 試驗(yàn)所用水稻品種

1.2 水稻OsSBEIIb 基因cDNA 的克隆和測序

以湘早秈2 號(hào)灌漿期的水稻胚乳為試驗(yàn)材料，利用RNA 提取試劑盒DP452 提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 作為基因克隆的模板。根據(jù)NCBI 網(wǎng)站公布的OsSBEIIb基因序列（LOC4329532），利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)OsSBEIIb基因編碼序列克隆引物（表2）。PCR 反應(yīng)體系：ApexHF HS DNA Polymerase CL（1 U/μL）1 μL，2×ApexHF CL Buffer 25 μL；cDNA 模板2 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；最后用超純水補(bǔ)足50 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1 min；98℃ 10s；55℃ 16s；68℃ 1 min，共32 個(gè)循環(huán)。取10 μLPCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后將PCR 產(chǎn)物切膠、回收，連接T 載體并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.3 水稻OsSBEIIb 基因的生物信息學(xué)分析

利用在線工具（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析OsSBEIIb基因的編碼序列；利用在線 程 序（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html） 對(duì)OsSBEIIb 蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；利用在線工具NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫預(yù)測OsSBEIIb 蛋白質(zhì)的保守功能域；利用NCBI-BLASTP 序列比對(duì)功能對(duì)OsSBEIIb 的氨基酸序列進(jìn)行在線序列比對(duì)；DNAMAN 軟件用于氨基酸序列一致性的比對(duì)；MEGA6.0 軟件用于該基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.4 水稻OsSBEIIb 基因的時(shí)空表達(dá)特征分析

在大田水稻長到始穗期時(shí)開始取樣根、莖、葉、稻穗，此時(shí)的稻穗還沒有開始灌漿，然后每隔一周取稻穗，并將穎殼和稻粒剝開分離，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 并作為qRT-PCR 反應(yīng)的模板，qRTPCR 反應(yīng)的引物見表2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系：QPCR mix 10 μL，模板2 μL，上下游引物各0.8μL，用超純水補(bǔ)足20 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min，95 ℃，15 s；60℃，30 s；共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表2 引物名稱及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsSBEIIb 基因的克隆及測序分析

以湘早秈2 號(hào)胚乳總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1 所示。從電泳圖可以看出，有一條清晰的單一條帶，對(duì)其切膠回收并送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行sanger 測序，測序結(jié)果表明基因編碼序列全長2 478 bp，符合電泳結(jié)果。

圖1 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 水稻OsSBEIIb 基因的生物信息學(xué)分析

OsSBEIIb基因的編碼序列全長2 478 bp，編碼一個(gè)含有825 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（圖2），該蛋白的理論分子量為92.85 kD，等電點(diǎn)為5.69。在線工具NCBICDD 數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，OsSBEIIb蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域位于69～825 bp 之間，屬于1,4-α-淀粉分支酶。

圖2 水稻OsSBEIIb 基因的核苷酸和編碼的氨基酸序列

在線工具NCBI-BLASTP 對(duì)OsSBEIIb的氨基酸序列進(jìn)行在線序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與粳稻（Oryza sativa JaponicaGroup）、玉 米（Zea mays）、谷 子（Setaria italica）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、高粱（Sorghum bicolor）、黍（Panicum miliaceum）、野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）氨基酸序列的相似性分別為99.88%、85.73%、82.54%、81.53%、81.52%、80.96%、80.36%。這些植物的SBEIIb 氨基酸序列多序列比對(duì)（圖3）分析發(fā)現(xiàn)，湘早秈2 號(hào)OsSBEIIb 的氨基酸序列與其他植物SBEIIb 的氨基酸序列一致性為85.96%，表明湘早秈2 號(hào)水稻OsSBEIIb 的氨基酸序列總體上是保守的，能夠形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，行使相似的生物學(xué)功能。

圖3 OsSBEIIb 氨基酸序列多序列比對(duì)

利用MEGA6.0 軟件構(gòu)建OsSBEIIb基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）發(fā)現(xiàn)秈早稻2 號(hào)與粳稻的親緣關(guān)系最近，與野生二粒小麥的關(guān)系最遠(yuǎn)。這主要原因是秈早稻2 號(hào)與粳稻同屬于禾本科稻屬植物。

圖4 水稻OsSBEIIb 與其他植物SBEIIb 的系統(tǒng)進(jìn)化樹

不同顏色氨基酸殘基代表不同的一致性。藍(lán)色：氨基酸一致性為100%; 粉紅色、青色、黃色分別表示氨基酸的一致性為75%以上、50%以上及33%以上;無顏色標(biāo)識(shí)的氨基酸一致性不足33%。

2.3 水稻OsSBEIIb 基因的時(shí)空表達(dá)特征分析

2.3.1 水稻OsSBEIIb基因在不同器官的表達(dá)特征分別提取水稻根、莖、葉、稻殼和胚乳的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 并作為RT-PCR 的模板。由圖5 可知，OsSBEIIb基因在根、莖、葉、稻殼和米粒中都有表達(dá)，但是其在米粒中的表達(dá)量遠(yuǎn)大于其在根、莖、葉和稻殼中的表達(dá)量，且差異極顯著（P＜0.01）。

圖5 OsSBEIIb 基因在水稻不同器官的表達(dá)

2.3.2OsSBEIIb基因在不同生育期稻殼的表達(dá)特征分別提取不同時(shí)期稻殼總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA并作為RT-PCR 的模板。由圖6 可知，OsSBEIIb基因隨著水稻的逐漸成熟，OsSBEIIb基因在稻殼的表達(dá)量呈現(xiàn)出了先升高在降低的趨勢，但沒有顯著差異。這種變化趨勢的出現(xiàn)可能是剝離的稻殼中有殘留的稻米組織，從而引起了該基因表達(dá)量的變化。

圖6 OsSBEIIb 基因在不同時(shí)期稻殼的表達(dá)

2.3.3OsSBEIIb基因在水稻不同生育期胚乳的表達(dá)特征 分別提取不同時(shí)期稻米的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA 并作為RT-PCR 的模板。由圖7 可知，隨著稻米的逐漸成熟OsSBEIIb基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，第一周表達(dá)量最低，第三周表達(dá)量最高，且兩者差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。因?yàn)榈谝恢芩具€沒有灌漿，胚乳沒有形成，所以O(shè)sSBEIIb基因的表達(dá)量最低。第三周取樣的稻米，此時(shí)水稻灌漿最為活躍，因此OsSBEIIb基因的表達(dá)量最高。

圖7 OsSBEIIb 基因在不同時(shí)期稻米的表達(dá)

2.4 OsSBEIIb 基因編碼區(qū)序列分析

利用引物對(duì)35 份水稻品種進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到了一條編碼序列為2 478 bp 的cDNA 序列，PCR 產(chǎn)物純化后送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行sanger 測序。與 “日本晴”O(jiān)sSBEIIb基因的編碼區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)，在測得的35 個(gè)水稻品種OsSBEIIb基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了15 個(gè)SNP 變異位點(diǎn)（圖8）分別位于117、280、345、586、809、1 029、1 235、1 253、1 326、1 562、1 933、2 132、2 274、2 339、2 340、2 438。這些變異位點(diǎn)都位于OsSBEIIb基因的功能區(qū)域。

圖8 OsSBEIIb 編碼區(qū)SNP 變異位點(diǎn)序列

根據(jù)15 個(gè)SNP 變異位點(diǎn)，可將35 份水稻品種分為9 個(gè)單倍型（表3）。由表3 可知，所有單倍型中與“日本晴”差異最小的單倍型是H9、H6，相差1個(gè)堿基；與日本晴”差異最大的單倍型是H7，相差7個(gè)堿基。頻率最高的單倍型是H6 有13 個(gè)品種。

表3 OsSBEIIb 基因編碼區(qū)序列變異位點(diǎn)與單倍型

3 討 論

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，淀粉是水稻的主要營養(yǎng)成分，而淀粉又分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。淀粉的合成需要一系列酶的共同參與，不同酶之間相互聯(lián)系又相互作用。該研究通過PCR 擴(kuò)增獲得了湘早秈2 號(hào)水稻淀粉分支酶（OsSBEIIb）基因cDNA 編碼區(qū)序列，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析了該基因的時(shí)空表達(dá)特征。該基因表達(dá)具有空間特異性，在根、莖、葉、稻殼的表達(dá)量很低，主要在灌漿期稻米的胚乳中表達(dá)，在灌漿第3 周表達(dá)量最高?？梢姡琌sSBEIIb的表達(dá)與水稻支鏈淀粉的形成密切相關(guān)。如果通過RNA 干擾技術(shù)或者基因編輯技術(shù)抑制該基因在灌漿期的表達(dá)，那么水稻支鏈淀粉的含量可能會(huì)大幅下降，而直連淀粉的含量將會(huì)大幅增加，這樣水稻抗性淀粉的含量會(huì)得到一定的提升。

通過PCR 擴(kuò)增，sanger 測序獲得了35 個(gè)水稻品種OsSBEIIb基因的編碼區(qū)序列。通過序列多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，該基因在不同水稻品種中存在著SNP 位點(diǎn)變異，且變異位點(diǎn)都位于該基因的功能編碼區(qū)，表明該基因在不同水稻品種中存在著豐富的多態(tài)性信息。這些豐富的變異位點(diǎn)為抗性淀粉水稻品種的選育提供了豐富的基因資源，為高抗性淀粉水稻品種的選育提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。