田陽陽，王軍偉，胡 陽，曹洋川，楊進飛，朱學偉，楊毓玲，劉迎龍

[1.紅塔煙草（集團）有限責任公司，云南 玉溪 653100；2.云南農業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201；3.玉溪市煙草公司新平縣分公司，云南 玉溪 653100]

中國是世界上煙葉生產第一大國，煙草行業(yè)在經濟生產中具有獨特地位，是國家經濟的支柱產業(yè)[1]。煙草的種植范圍極廣，從北緯55°到南緯40°之間的南北各地區(qū)均有栽培[2]。然而，由煙草疫霉（Phytophthora nicotianaeBreda de Haan）引起的煙草黑脛病是一種毀滅性的土傳病害，自1896 年在印度尼西亞的爪哇首次發(fā)現后在各地廣泛傳播，發(fā)病率高、分布范圍廣，造成嚴重的經濟損失[3-5]。煙草黑脛病菌有無性和有性階段，在侵染植物的過程中，會形成孢子囊、游動孢子、卵孢子和厚垣孢子等多種形態(tài)。研究發(fā)現，種群大小、基因交流、變異、生殖方式和環(huán)境選擇作用等諸多因素均能影響微生物群體遺傳結構的演化[6]。因此，不同菌株在生物學性狀及分子水平上表現出特征性差異，展現出豐富的遺傳多樣性，但同時也使病害越發(fā)嚴重，難以控制[7]。

近年來，云南省煙葉生產發(fā)展迅速，已成為當地農民增收致富的重要途徑。該省玉溪市是紅塔煙草（集團）有限責任公司的核心采購區(qū)域之一，其產量和品質在集團卷煙配方中占有重要位置。然而，隨著種植面積擴大，煙區(qū)地塊難以實現輪作，推廣品種抗病性較差，例如KRK26 和紅花大金元等品種易感染黑脛病。隨著該類感病品種的推廣，黑脛病發(fā)生面積和嚴重程度加大。因此，對煙草黑脛病的防治工作一直是煙草生產的重點。病菌群體的地理分布特征既能反映群體的結構動態(tài)，也能反映病菌群體的演化規(guī)律[8]。為了探究玉溪市煙區(qū)煙草黑脛病菌的遺傳差異及群體演化規(guī)律，研究以玉溪市新平縣與澄江市煙區(qū)為取樣點，通過RAPD 標記技術，從DNA 分子水平探討云南省玉溪市煙草黑脛病菌群體的遺傳多樣性，以期為玉溪市煙草黑脛病綜合防治提供一定的理論依據與研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試的164 個煙草疫霉菌株分離自云南省玉溪市植煙區(qū)土壤及煙草黑脛病標本，在燕麥培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)備用，菌株來源及分布見表1。

表1 煙草疫霉的地理來源及菌株數量

1.1.2 主要試劑和儀器 RAPD 隨機引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；其他試劑如PCR 相關試劑、5 000 DNA Marker、Agarose、CTAB、氯 仿、異戊醇、乙醇、異丙醇等均購自Sigma 公司。主要儀器有：PCR 擴增儀（杭州朗基科學儀器有限公司）、電泳儀（DYY6C，購自北京六一廠）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（Biotop，220V，上海山富科學儀器有限公司）；核酸蛋白定量儀（Nano Drop 2000，美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取 采用CTAB 法提取煙草疫霉DNA[9]，用核酸蛋白定量儀（Nano Drop 2000）測定其OD260與OD280的比值。質量較好的DNA 純度較高，蛋白質含量較少，其OD260/OD280值介于1.8～2.0 之間[10]。將接近于該比值的DNA 樣品置于-20℃冰柜內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 通過查閱相關文獻[11-13]，從已報道的煙草疫霉RAPD 隨機引物和上海捷瑞生物工程有限公司合成的2 000 個寡聚核苷酸隨機引物中篩選出擴增譜帶多且清楚的6 條隨機引物，對供試菌株全基因組DNA 進行PCR 擴增和RAPD 分析。

1.2.3 擴增程序及反應體系 （1）反應體系（20 μL）：10×buffer 2 μL，1 U Taq 酶 0.2 μL，0.2 mmol/L dNTP 混合液 1.6 μL，0.5 μmol/L 的RAPD 引物 1 μL，菌絲DNA 模板0.5 μL，最后加ddH2O 補至20 μL，陰性對照為ddH2O。（2）反應條件：95℃預變性2 min；94℃變性1 min，38℃退火1 min，72℃延伸2 min，40 個循環(huán)；72℃延伸10 min[12]。取10 μL PCR 產物與3 μL 含核酸染料（花青素）的Loading Buffer 混合均勻后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓設置為50 V，持續(xù)2～3 h，結果在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

1.2.4 擴增產物的分析方法 電泳圖譜中的每一條帶均為一個分子標記，根據各分子標記的遷移率及其有無轉化為二進制數據，具體原則為：在重復擴增中穩(wěn)定出現的帶無論強弱均記為1，無穩(wěn)定的帶記為0。相似系數的計算和聚類分析均由NTSYS 軟件完成，并采用UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）構建遺傳系統(tǒng)樹狀圖譜[12]。

1.2.5 遺傳差異分析 根據遺傳系統(tǒng)樹狀圖譜以不同相似水平將供試菌株劃分為不同的遺傳相似組群，按地理來源、海拔高度、煙草品種等相關因素統(tǒng)計各組群的菌株數量，繪制圖表并分析供試菌株的遺傳差異。

2 結果與分析

2.1 RAPD 引物篩選結果及多態(tài)性分析

根據擴增結果，篩選出6 條多態(tài)性較好的引物作為RAPD 擴增引物，詳見表2。根據圖1 可知，6 條隨機引物共擴增出了53 條DNA 條帶，平均每條引物擴增出8.83 條DNA 條帶，所擴增出的DNA 條帶大部分為多態(tài)性譜帶，多態(tài)率為71.70%。不同引物對供試菌株擴增出的DNA 譜帶結果也不相同，條帶總數在6～10 條。以上結果表明，云南省玉溪市煙草黑脛病病菌存在較豐富的遺傳多樣性。

圖1 部分供試菌株的RAPD 擴增圖譜

表2 6 條RAPD 供試引物擴增譜帶數量

2.2 不同煙草疫霉菌株的聚類分析

利用NTSYS 軟件以UPGMA 對164 個菌株全基因組DNA 擴增結果進行聚類分析，在0.95 相似水平上每一支各取一株菌株構建遺傳系統(tǒng)樹狀圖譜，如圖2 所示。根據不同相似水平可劃分為不同的遺傳相似組，例如在0.74 相似水平上可將164 個菌株劃分為4 個組群；在0.84 相似水平上可將其劃分為6 個組群；在0.94 相似水平上可將其劃分為12 個組群。其中，在0.84 相似水平上劃分的6 個組群中，Ⅰ組群的數量最多，為146 株，占89.02%，其他5 組總和僅占10.98%（表3）。

圖2 云南省玉溪市煙草疫霉菌株RAPD 聚類分析結果

2.3 煙草疫霉與地理來源、海拔高度、煙草品種關系的遺傳差異分析

根據0.84 相似水平將供試的164 個菌株劃分為Ⅰ～Ⅵ個組群（表3），按地理來源、海拔高度、煙草品種等相關因素統(tǒng)計不同組群的菌株數量，如圖3 所示，大多數煙草疫霉菌株聚集在Ⅰ組群；少量則分散于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ各組群內。根據地理位置分析，各組群在玉溪市新平縣與澄江市境內大致均勻分布；但從新平縣和澄江市不同海拔高度（1 694～1 970 m）來看，Ⅰ組群內有較多菌株分布于低海拔地區(qū)，其余較高海拔地區(qū)無較明顯差異；對該地區(qū)品種分布與煙草疫霉遺傳差異分析可知，煙草品種KRK26 種植區(qū)有較多數量的Ⅰ組群煙草疫霉出現，而另外2 個主栽品種則相對較少，但云煙87 也多于K326。

表3 供試菌株在0.84 相似水平上的組群分布及數量

圖3 菌株與地理來源、海拔高度、煙草品種關系的遺傳差異

3 結論與討論

3.1 結 論

通過6 條具有多態(tài)性的RAPD 引物，隨機擴增164 個煙草黑脛病菌菌株的DNA，對供試菌株進行種群遺傳差異分析和基因型劃分研究，結果顯示，在0.84 相似水平上，這些菌株可分為6 個組，其中146個菌株聚集在Ⅰ組，占89.02%，其他5 組總和僅占10.98%。這表明新平縣和澄江市的煙草疫霉遺傳上具有高度同源性。分析該地區(qū)煙草疫霉遺傳分化差異發(fā)現，其群體基因型劃分與地理來源沒有直接關系，但與海拔高度、煙草品種分布存在一定關聯(lián)。該結論對玉溪煙區(qū)煙草黑脛病的防控具有重要的指導意義。

3.2 討 論

RAPD 技術自問世以來，因其成本較低，運用范圍廣泛而得到快速發(fā)展。到目前為止已在物種多態(tài)性檢測、品種及親緣關系鑒定、遺傳圖譜等多個方面得到應用。如錢旎[7]和劉芳等[14]用RAPD 與McRAPD標記技術，分析重慶和河南地區(qū)煙草黑脛病菌的生理小種和遺傳多樣性；劉曉俠等[15]通過RAPD 標記和集團分離分析法（BSA）篩選，找到了與煙草抗黑脛病基因Bs1（t）連鎖的RAPD 標記OPB023000 和OPM112500，為該基因的進一步研究利用以及煙草抗病品種的選育積累了基礎；Qamer 等[16]基于RAPD標記技術對東南亞地區(qū)的蜜蜂、美洲蜜蜂群體遺傳差異進行分析，結果表明，它們之間的遺傳變異水平較低，但也有較小程度的遷移存在，這一結論為保護該地區(qū)特有蜂種的生物多樣性提供了指導。

該研究運用RAPD 技術對玉溪煙區(qū)的164 株煙草疫霉進行種群遺傳差異分析，結果表明，玉溪新平縣和澄江市煙區(qū)中的煙草疫霉在遺傳上具有高度同源性，分化差異較小，遺傳變異并不明顯，這與付靜等[17]的研究結果相似。然而，同一地區(qū)也存在少量遺傳差異較明顯的菌株。通過分析這些差異較明顯的菌株與地理來源、品種等因素的關聯(lián)發(fā)現，遺傳差異較大的供試菌株，其群體基因型劃分與地理來源沒有直接的關系，但與海拔高度、煙草品種分布有一定的關聯(lián)，這與前人的一些研究結果相類似[7,11]。

導致少數煙草疫霉分化差異較大的原因目前尚不清楚，但根據該研究結果并聯(lián)系生產實際可知，通過種苗或其他工具使內部病菌頻繁交流可能是導致少數病菌分化差異較大的原因之一。在玉溪煙區(qū)的3 個主栽品種中，種植KRK26 這一品種的區(qū)域內有較多數量的Ⅰ型煙草疫霉，而云煙87 和K326 品種中Ⅰ型煙草疫霉相對較少。這可能與品種之間的抗病性差異相關，該結果也說明不同煙草疫霉與其互作的煙草寄主之間存在一定聯(lián)系，這為農業(yè)生產提供了警示，即煙草品種不能單一化種植。若品種單一，當感病寄主遇到強致病性菌株時往往無法抵御，造成大面積的病害流行，導致大量減產甚至絕收。此外，通過基因型分類與生理小種鑒定相結合的檢測技術快速鑒定植煙區(qū)不同的煙草疫霉生理小種，對后續(xù)的品種布局和種植規(guī)劃具有重要的現實指導意義[14]。而氣象因素與煙草疫霉種群遺傳差異之間是否存在關聯(lián)有待進一步深入研究。