張玲 ，徐鑫睿 ，王林 ，2，3，4，潘繼紅 ，2，3，4

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)院暨山東省醫(yī)藥生物技術(shù)中心生物化學(xué)教研室，山東濟(jì)南；2 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎科；3 國(guó)家衛(wèi)健委生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4 山東省罕見(jiàn)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)教研室

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性、炎性、破壞性、全身性的自身免疫性疾病，以滑膜增生和白細(xì)胞滲出導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞為主要特征［1-2］。據(jù)估計(jì)，該疾病的全球流行率為1%~2%［3］，是全球第42 位致殘病因［4-5］，近年 RA 的發(fā)病率和患病率一直在增加［6］。RA患者關(guān)節(jié)會(huì)分泌過(guò)多的炎癥分子，如細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)軟骨和骨骼的破壞。因此，可以通過(guò)抑制炎性因子（如 IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β、TNF-α、CCL2 等）的表達(dá)，緩解關(guān)節(jié)炎癥狀。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞（RASFs）具有“tumor-like”特性，細(xì)胞侵襲和遷移能力增加，并且具有抵抗凋亡的能力。目前主要是使用抗風(fēng)濕病藥物（DMARDs）幫助RA患者減輕疼痛［7］。DMARDS可以改善RA患者臨床癥狀，減少關(guān)節(jié)損傷［8］，但在治療過(guò)程中常常會(huì)伴隨大量不良作用［9］。

近年，小分子蛋白激酶抑制劑被廣泛應(yīng)用，能夠靶向作用于蛋白，降低蛋白活性或者阻礙生化反應(yīng)，且不良作用小。脾酪氨酸激酶（Syk）參與多種生物學(xué)功能，包括適應(yīng)性和先天免疫受體信號(hào)傳遞、細(xì)胞黏附、病原體識(shí)別、組織損傷信號(hào)傳遞、炎癥體激活、骨代謝和血管發(fā)育［10］。Syk 磷酸化各種下游信號(hào)分子并增強(qiáng)炎癥信號(hào)，因此，Syk 可能成為自身免疫性或炎癥性疾病治療干預(yù)的一個(gè)靶點(diǎn)［11］。研究［12-15］表明，Syk 能夠調(diào)節(jié)受TNF-α 或銅綠假單胞菌刺激的支氣管上皮和單核細(xì)胞產(chǎn)生促炎分子的能力，在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用［16-17］。R406 是Syk 的一種小分子抑制劑。PINE 等［18］發(fā)現(xiàn)，R406 可通過(guò)抑制Syk 有效改善Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）模型鼠癥狀，主要表現(xiàn)為抑制炎性因子（Gro/KC、IL-6、IL-18、L1β、MCP-1）表達(dá)。2021年6—9月，本研究通過(guò)用R406處理RASFs后，觀察其是否可以有效抑制RASFs 中炎性因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲和遷移能力，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡能力。同時(shí)，建立CIA 模型小鼠，觀察R406 對(duì)小鼠血清中炎性因子（IL-6、IL-8、IL-1α、COMP）水平的影響，為R406 治療RA 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、小鼠、試劑及儀器 RASFs 細(xì)胞：收集RA 患者膝關(guān)節(jié)置換術(shù)時(shí)的滑膜組織（n = 14；男5例、女9 例，年齡35~ 75 歲、平均55 歲）?；颊呔?987 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。獲得每位患者的書面知情同意書及委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2019-02）。將滑膜組織浸泡，用Ⅱ型和Ⅲ型膠原酶在37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)中消化6~8 h。細(xì)胞在含有15%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM 完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，傳代至3~7代使用。小鼠：18只雄性DBA 1/J小鼠，8周齡，20~25 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。小鼠按SPF級(jí)別環(huán)境飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物房，符合山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)及管理?xiàng)l例。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流程嚴(yán)格按照山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條例進(jìn)行。試劑及儀器 ：DMEM 培 養(yǎng) 基（gibico），胎 牛 血 清（gibco，10270106），青霉素鏈霉素雙抗（gibco，15140122），PBS（gibco，10010023），EDTA-胰酶（索萊寶），Ⅱ型膠原酶（索萊寶，C8150），Ⅲ型膠原酶（索萊寶，C8490），二甲基亞砜（索萊寶，D8371），IL-1β（Abbkine，PRP1019），TRIzol（諾唯贊，R40101），RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊，R223），SYBR Mixture（康維公司，CW0957H），4% 組織細(xì)胞固定液（索萊寶，P1110），結(jié)晶紫/龍膽紫混合染色液（索萊寶，G1075），小 室（BD），Corning? Matrigel? Matrix（Corning，356234），V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（索萊寶，CA1020），ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物），引物（華大基因），R406（selleck 生物公司），顯微鏡（日本尼康，Eclipse E100），酶標(biāo)儀（SpectraMax，iD3），水浴鍋（RUICHENG，Minibox-C），低溫高速離心機(jī)（Backman，20R），Micro-CT（PerkinElmer，Quantum GX），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，Scientific iCAN），超凈臺(tái)（Thermo，0109313），熒光定量檢測(cè)儀（Roche，Light Cycler480），流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACSVerse）。

1.2 RASFs 中 IL-6、IL-8、CCL2 mRNA 的檢測(cè) 采用QRT-PCR 方法。將RASFs分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。其中實(shí)驗(yàn)組又分為不同劑量組，不同劑量組分別以 1、10、50、100 ng/mL R406 進(jìn)行干預(yù)，并用IL-1β（10 ng/mL）進(jìn)行刺激。陰性對(duì)照組只加入DMSO，陽(yáng)性對(duì)照組加入DMSO 和IL-1β，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。按照試劑使用說(shuō)明書，采用TRIzol 試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 將 RNA 進(jìn) 行 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。QRT-PCR 使用 LightCycler 480 按照以下方案進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)。GAPDH 引物序列：F-5′TGATGACATCAAGAAGGTGG3′，R-5′TTACTCCTTGGAGGCCATGT3′；IL-6 引物 序 列 ：F-5′CCACCGGGAACGAAAGAGAA3′，R-5′GAGAAGGCAACTGGACCGAA3′；IL-8 引物序列：F-5′CAGTTTTGCCAAGGAGTGCTAA3′，R-5′AACTTCTCCACAACCCTCTGC3′；CCL2 引物序列：F-5′AGAGGCTGAGACTAACCCAGA3′，R-5′TTTCATGCTGGAGGCGAGAG3′。 實(shí) 驗(yàn) 重 復(fù) 3 次 ，采 用 2-ΔΔCt計(jì) 算 目的基因表達(dá)水平。

1.3 RASFs 上清液中 IL-6、IL-8、CCL2 蛋白的檢測(cè) 采用ELISA 法。將RASFs 分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞中加入50 ng/mL R406 和 IL-1β（10 ng/ml）干預(yù)，陰性對(duì)照組加入DMSO，陽(yáng)性對(duì)照組加入DMSO 和IL-1β。培養(yǎng)24 h 后，收集上清，用ELISA 試劑盒檢測(cè)IL-6、IL-8和CCL2蛋白。

1.4 RASFs 侵襲、遷移、凋亡數(shù)測(cè)算 實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞處理方法同1.3。RASFs 侵襲數(shù)測(cè)算：將基質(zhì)膠用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM 培養(yǎng)基按照1∶7的比例進(jìn)行稀釋后，在“Trans Well”上室中加入100 μL（每個(gè)室），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。RASFs按照上述的方法處理后以10 000 個(gè)細(xì)胞密度接種于“Trans Well”上室（2%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基），含有15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基添加到下室的表面。孵育18 h 后，將侵襲到下表面的細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)，每種處理?xiàng)l件包括3個(gè)重復(fù)視圖，以計(jì)算侵襲細(xì)胞的平均數(shù)量。RASFs遷移數(shù)測(cè)算：實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞處理方法同1.3，用無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)基換液并進(jìn)行劃痕，分別記錄培養(yǎng)0、3、6、12、24 h遷移的細(xì)胞數(shù)。

采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算凋亡細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞處理方法同1.3。RASFs 按照上述方法處理后，用胰蛋白酶消化，根據(jù)制造商方案用Annexin V-FITC（10 μg/mL）和 PI-PE（10 μg/mL）對(duì)細(xì)胞染色，通過(guò)FACS Calibur machine 進(jìn)行分選檢測(cè)，將Annexin V+PI+細(xì)胞標(biāo)記為凋亡細(xì)胞。

1.5 CIA 小鼠血清中 IL-6、IL-8、IL-1α、COMP 蛋白的檢測(cè) 將18 只小鼠平均分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組誘發(fā)CIA 模型后，對(duì)小鼠進(jìn)行R406 腹腔注射30 d（200 mg/kg，每?jī)商熳⑸? 次），觀察并記錄小鼠爪子炎癥緩解情況。陰性對(duì)照組不誘發(fā)CIA 模型。陽(yáng)性對(duì)照組誘發(fā)CIA 模型后，腹腔注射等量DMSO。CIA 小鼠模型的建立：DBA 1/J 雄性小鼠尾根部注射2 mg/mL 的牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑 1∶1 乳化劑（200 μL）后正常培養(yǎng)，21 d 后小鼠尾根部注射牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑1∶1 乳化劑（200 μL）。每天對(duì)小鼠進(jìn)行一次關(guān)節(jié)炎癥狀監(jiān)測(cè)，待小鼠4 只爪子腫脹完全，提示CIA 模型建立成功。R406 治療30 d 后，從小鼠新鮮血液中提取血清，離心去除微粒后，ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中IL-6、IL-8、IL-1α、COMP蛋白。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 7 軟件包（La Jolla，CA，USA）。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov-Lilliefors 方法，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不 同 濃 度 R406 作 用 的 RASFs 中 IL-6、IL-8、CCL2 mRNA水平及R406作用不同時(shí)間RASFs中IL-6、IL-8、CCL2 mRNA的水平 與陽(yáng)性對(duì)照組相比，R406對(duì)RASFs中炎性因子IL-6、IL-8、CCL2的表達(dá)具有一定的抑制作用，在50 ng/mL 時(shí)抑制效果最為顯著，F(xiàn)值分別為45.75，238.7，35.2，P 均＜0.01。不同濃度R406作用后RASFs中IL-6、IL-8、CCL2水平見(jiàn)表1。

表1 不同濃度R406 作用后RASFs中IL-6、IL-8、CCL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量（-x±s）

50 ng/mL R406 作用24 h 時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 IL-6、IL-8、CCL2 水平降低（F 值分別為200.1、331.9、61.5，P 均＜0.01），50 ng/mL R406 作用不同時(shí)間RASFs中炎性因子水平見(jiàn)表2。

2.2 R406 作 用 后 RASFs 上 清 液 中 IL-6、IL-8、CCL2 蛋白水平變化 實(shí)驗(yàn)組RASFs 上清液中IL-6、IL-8、CCL2分別為（84.700 0 ± 0.968 6）、（250.000 0 ±3.382 0）、（8.300 0 ± 0.034 6）pg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組分別為（147.000 0± 2.854 0）、（341.300 0± 2.394 0）、（16.200 0 ± 0.598 3）pg/mL，陰性對(duì)照組分別為（15.100 0 ± 0.249 1）、（139.700 0 ± 1.060 0）、（2.400 0 ± 0.100 7）pg/mL。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 RASFs 上清液中 IL-6、IL-8、CCL2 蛋白水平降低（t 分別為20.64、22.03、13.31，P 均＜0.01）。2.3 R406 作用后RASFs 侵襲、遷移、凋亡數(shù)比較實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組侵襲數(shù)目分別為（178.3 ± 4.702）、（615.3 ± 6.960）、（179.7 ± 6.888）個(gè)。三組侵襲細(xì)胞數(shù)目比較，F(xiàn)=1613，P＜0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)目減少（t=52.03，P＜0.01）。

表2 50 ng/mL R406作用不同時(shí)間RASFs中IL-6、IL-8、CCL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量（-x±s）

各組不同時(shí)間遷移細(xì)胞數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移能力下降（F 分別為18.53、451.8、13.7，P均＜0.01）。

實(shí)驗(yàn)組 RASFs 凋亡率為 23.44% ± 2.099%，陽(yáng)性對(duì)照組RASFs凋亡率為15.71%±1.27%，陰性對(duì)照組為19.90% ± 1.43%，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率增加（t=3.704，P＜0.05）。

表3 各組不同時(shí)間遷移細(xì)胞數(shù)（-x±s）

2.4 R406作用后CIA模型小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1α、COMP蛋白水平的變化 與陽(yáng)性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1α、COMP蛋白水平降低（t分別為10.52、2.52、6.04、6.44，P均＜0.01），詳見(jiàn)表4。

表4 各組血清中IL-6、IL-8、IL-1α、COMP蛋白水平（pg/mL，-x± s）

3 討論

RA 患者中的成纖維樣細(xì)胞病理特征是分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和促血管生成因子的能力增強(qiáng)。RASFs一方面在體內(nèi)可以產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子，另一方面這些促炎性細(xì)胞因子也會(huì)反作用于細(xì)胞，使其繼續(xù)表達(dá)更多的促炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞因子水平失衡，進(jìn)入一個(gè)無(wú)限惡性循環(huán)過(guò)程。這種作用在體外同樣存在，用IL-1β、TNF-α、IL-6、LPS 等促炎性細(xì)胞因子進(jìn)行刺激，可以誘發(fā)細(xì)胞炎癥。經(jīng)過(guò)課題組前期不斷地篩選，發(fā)現(xiàn)使用IL-β刺激，產(chǎn)生的炎癥效果更為顯著，因此，在本研究中均采用IL-1β進(jìn)行刺激誘發(fā)炎癥。

本研究通過(guò)qRT-PCR 方法檢測(cè)不同劑量（1、10、50、100 ng/mL）R406 作用 24 h 后對(duì) RASFs 中炎性因子的影響，結(jié)果表明，細(xì)胞中炎性因子（IL-6、IL-8、CCL2）的表達(dá)均被抑制，且在50 ng/mL 時(shí)抑制效果最為顯著，選擇最適劑量50 ng/mL R406 作用于RASFs 不同時(shí)間（6、12、24、48 h），發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)均被抑制，且在24 h 時(shí)抑制效果最為顯著。同時(shí)，50 ng/mL R406 作用于RASFs 24 h后，ELISA 檢測(cè)RASFs上清液中炎性因子的分泌，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，上清液中炎性因子的分泌降低。說(shuō)明R406 對(duì)RASFs 中炎性因子的分泌具有抑制作用，其可以作為治療RA的藥物應(yīng)用于臨床。

由于RASFs 具有“tumor-like”的特性，不僅可以分泌大量的炎性細(xì)胞因子，與正?；ぜ?xì)胞相比，其侵襲和遷移能力也增強(qiáng)［19］。為觀察R406 對(duì)RASFs侵襲遷移及凋亡能力的影響，本研究分別通過(guò)TransWell 和細(xì)胞劃痕的方法進(jìn)行探究，結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)50 ng/mL R406 刺激24 h，細(xì)胞侵襲和遷移能力均減弱。在RA 中以成纖維樣滑膜細(xì)胞過(guò)多為特征，這種細(xì)胞過(guò)剩在很大程度上源于RASFs 增殖和凋亡之間的失衡，使其表現(xiàn)出抵抗凋亡的能力。在本研究中，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，50 ng/mL R406 作用24 h 后可以增加RASFs的凋亡能力，其原因可能是由于R406誘導(dǎo)Caspases 9 和3激活，導(dǎo)致大部分細(xì)胞凋亡。

在RA 患者以及佐劑免疫的大鼠滑膜中，炎癥疾病的特點(diǎn)是滑膜增生伴隨著中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的滲透，致炎細(xì)胞因子的增加，以及炎癥細(xì)胞對(duì)骨和軟骨的侵襲。除滑膜增生外，骨質(zhì)破壞是RA 的一個(gè)主要特征，與疼痛和發(fā)病率有關(guān)。在RA 患者體內(nèi)，血清中COMP 水平的升高是軟骨退化的重要標(biāo)志，TNF-α 抑制劑治療可降低COMP 水平。研究顯示，調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子，特別是IL-1和TNF-α可以改善 RA 的臨床預(yù)后。在RA 患者中，IL-1β 水平升高已被表征為RA骨吸收的表現(xiàn)之一。此外，IL-6已被證明與破骨細(xì)胞形成有關(guān)，阻斷這些細(xì)胞因子可減少骨吸收。在動(dòng)物模型中，與表達(dá)TNF-α 的小鼠相比，在TNF-α缺乏的小鼠中過(guò)表達(dá)IL-18會(huì)加劇軟骨蛋白多糖的丟失。IL-1α 阻斷劑可防止CIA 小鼠軟骨和骨的破壞，而TNF-α阻斷劑僅減輕關(guān)節(jié)炎癥。為進(jìn)一步探究R406 對(duì)RA 的緩解作用，建立CIA 模型鼠，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎后對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行給藥治療30 d，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，接受給藥治療的小鼠關(guān)節(jié)組織腫脹明顯消退，紅斑減少；ELISA 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中炎性因子（IL-6、IL-8、IL-1α、COMP）分泌降低，提示R406 在小鼠體內(nèi)可以抑制炎性反應(yīng)。值得注意的是，在本研究中接受R406給藥治療的小鼠血清中COMP 水平降低，表明了骨破壞的減少。說(shuō)明R406 可用于治療RA，具體臨床上能不能推廣，有待大樣本多中心的臨床研究證實(shí)。

綜上所述，R406可以抑制RASFs中炎性因子的表達(dá)，抑制RASFs 侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且對(duì)CIA 模型鼠關(guān)節(jié)炎癥具有一定的抑制作用，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。