白巖，徐杰，運(yùn)濤

1 天津市第五中心醫(yī)院普外一科，天津 300450；2 天津市第五中心醫(yī)院普外科

結(jié)直腸癌又名大腸癌，是指大腸上皮來源的癌癥，包括結(jié)腸癌與直腸癌，在我國(guó)以直腸癌最為常見［1］。流行病學(xué)顯示，全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率、病死率均位居全部惡性腫瘤中第5 位，且好發(fā)于中老年群體。結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展過程復(fù)雜多變，其發(fā)病機(jī)制尚未完全探明［2］。研究顯示，多種基因/蛋白質(zhì)參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)行為的調(diào)控［3］。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（CCDC）基因家族中的一些基因被證實(shí)與惡性腫瘤有關(guān)，CCDC12作為CCDC 家族一員，有研究發(fā)現(xiàn)其和結(jié)直腸癌有關(guān)［4］。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框（FOX）家族是調(diào)控腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要家族，其中的FOXO3a 在多種惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)［5］。Twist為堿性螺旋—環(huán)螺旋家族中一員，是調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的重要基因之一［6］。MMP-9 為 FOXO3a 調(diào)控的眾多下游蛋白之一，和腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)［7］。目前，關(guān)于結(jié)直腸癌組織中CCDC12、FOXO3a、Twist 表達(dá)水平的報(bào)道較多，但 CCDC12、FOXO3a、Twist 表達(dá)與 MMP-9 表達(dá)相關(guān)性報(bào)道較少。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 的表達(dá)變化，同時(shí)探討上述四指標(biāo)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系以及四指標(biāo)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017 年 1 月~2020 年 1 月天津市第五中心醫(yī)院收治的老年結(jié)直腸癌患者82例，其中男54 例、女 28 例，年齡 65~85（75.62 ± 8.57）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（20.66 ± 2.64）kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為結(jié)直腸癌患者；②年齡≥65 歲；③臨床資料完整；④術(shù)前未行放療、化療、免疫治療、靶向治療等；⑤患者家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者；②年齡＜65 歲患者；③臨床資料不完整患者；④合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能障礙患者；⑤合并血液系統(tǒng)疾病患者；⑥合并免疫系統(tǒng)疾病患者。

1.2 結(jié)直腸組織中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化SP 法。82 例患者均接受結(jié)直腸癌根治術(shù)，術(shù)后留存切除的新鮮（離體30 min 內(nèi)）結(jié)直腸癌組織（癌灶中心處）及癌旁正常腸黏膜組織（距腫瘤組織8~10 cm 處）標(biāo)本，置入EP管內(nèi)，液氮凍存置于-80 ℃冷存待檢。取組織石蠟包塊，常規(guī)切片（除Twist蛋白為3 μm外，其余3種蛋白均為4 μm）、脫蠟處理、高壓修復(fù)抗原、阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶、滴加羊血清封閉、滴加采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）稀釋至1∶500 兔抗人CCDC12 一抗（英國(guó)Eter-Life）/1∶150 兔抗人 FOXO3a 一抗（德國(guó) Novus）/1∶200 兔抗人 Twist 一抗（美國(guó) Santa Cruz）/1∶150 兔抗人MMP-9 一抗（美國(guó)Cell Signaling Technology），PBS 沖洗，滴加經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，滴加鏈霉素抗生素蛋白—過氧化物酶（SP，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對(duì)照。由兩位資深病理醫(yī)師雙盲法單獨(dú)閱片，×400倍光學(xué)顯微鏡下隨取抽取5個(gè)視野，每個(gè)視野選擇100 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度的乘積判定CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況。陽(yáng)性細(xì)胞占比：無計(jì)0分，1%~25%計(jì)1分，26%~50%計(jì)2 分，＞51%計(jì)3 分，染色強(qiáng)度：無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度的乘積≤3 為陰性（-），＞3 為陽(yáng)性（+）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻次或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Kendall 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織、癌旁組織中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 結(jié)直腸癌組織中 CCDC12、FOXO3a 、Twist、MMP-9 蛋白陽(yáng)性分別為 62、43、52、65 例，陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.61%、52.44%、63.41%、79.27%；癌旁組織中CCDC12、FOXO3a 、Twist、MMP-9 蛋白陽(yáng)性分別為16、77、14、19 例，陽(yáng)性表達(dá)率分別為 19.51%、93.90%、17.07%、23.17%，與癌旁組織比較，結(jié)直腸癌組織中 CCDC12、Twist、MMP-9 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高，F(xiàn)OXO3a 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低（χ2分別為51.733、36.613、51.640、35.906，P均＜0.05）。

2.2 不同臨床病理參數(shù)的結(jié)直腸癌患者癌組織中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤類型的結(jié)直腸癌患者癌組織中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為1.386、1.853、2.629、0.003，1.167、0.602、0.183、2.231，0.721、0.007、1.143、0.005，0.471、3.401、0.012、0.490，P 均＞0.05），不同分化程度、TNM 分期、有無漿膜浸潤(rùn)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者癌組織中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為5.312、7.022、4.891、7.863，9.551、20.513、7.949、11.642，5.720、12.559、11.748、7.745，10.688、8.077、8.979、17.085，P 均＜0.05），不同臨床病理參數(shù)的結(jié)直 腸 癌 患 者 癌 組 織 中 CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況見表1。

2.3 結(jié)直腸癌組織中 CCDC12、FOXO3a、Twist 與MMP-9 蛋白表達(dá)相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中的CCDC12、Twist 蛋白表達(dá)與MMP-9 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.368、0.353，P＜0.01），F(xiàn)OXO3a 蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.205，P＜0.01）。

3 討論

隨著我國(guó)社會(huì)不斷發(fā)展，人們的飲食習(xí)慣發(fā)生巨大改變，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年升高，此病早期無特異性癥狀，且發(fā)展迅速、侵襲轉(zhuǎn)移快，患者確診時(shí)多數(shù)已為進(jìn)展期，預(yù)后較差。因此，對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲機(jī)制進(jìn)行探索對(duì)降低結(jié)直腸癌發(fā)病率極為重要［8］。目前已發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等為多種基因相互作用的結(jié)果，但具體機(jī)制仍未探明。

CCDC 蛋白家族系一類由2 個(gè)或2 個(gè)以上卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的寡聚體或同寡聚體序列蛋白，而構(gòu)成CCDC 蛋白的這些卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)特殊，使得CCDC 蛋白易出現(xiàn)空間構(gòu)象改變，從而具有多種細(xì)胞生物學(xué)特性［9］。目前，已有研究報(bào)道證實(shí)CCDC 家族中的某些成員參與了細(xì)胞分化、周期調(diào)控、凋亡及遺傳信號(hào)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、分子識(shí)別等眾多生物學(xué)過程。CCDC12 為CCDC 蛋白家族一員，近年報(bào)道發(fā)現(xiàn)其和結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)［10］。本研究對(duì)比結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的CCDC12 蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，CCDC12 蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率升高，提示CCDC12 蛋白高表達(dá)可能和結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。此外，在低分化、TNM 分期為Ⅲ~Ⅳ期、腫瘤浸潤(rùn)至漿膜層、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中CCDC12 陽(yáng)性表達(dá)率更高。分析原因?yàn)镃CDC12 蛋白高表達(dá)致使腫瘤細(xì)胞骨架重排，活化腫瘤細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白酶及信號(hào)磷脂酶C，從而使得腫瘤細(xì)胞發(fā)生運(yùn)動(dòng)及遷移［11］。

表1 不同臨床病理參數(shù)的結(jié)直腸癌患者癌組織中CCDC12、FOXO3a、Twist、MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)

FOXO 蛋白為FOX 蛋白家族亞群之一，在哺乳動(dòng) 物 細(xì) 胞 中 主 要 以 FOXO1、FOXO3、FOXO4 及FOXO6蛋白形式存在，F(xiàn)OXO 蛋白在機(jī)體代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等中起關(guān)鍵作用［12］。FOXO3a 作為 FOXO 家族一員，已被證實(shí)為抑癌基因之一，其亞細(xì)胞定位和磷酸化失活和腫瘤發(fā)生有關(guān)。李超等［13］研究表明，F(xiàn)OXO3a 蛋白在乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)降低，且和患者預(yù)后相關(guān)。本研究對(duì)比結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的FOXO3a 蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a 蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，提示FOXO3a 蛋白低表達(dá)可能和結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。同時(shí)，F(xiàn)OXO3a蛋白低表達(dá)和結(jié)直腸癌分化程度、TNM 分期、浸潤(rùn)程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，F(xiàn)OXO3a 蛋白表達(dá)降低，結(jié)直腸癌分化程度降低，TNM 分期增高，浸潤(rùn)程度加深，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明FOXO3a 可抑制結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。究其原因?yàn)镕OXO3a 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞周期停止效應(yīng)減弱，利于腫瘤細(xì)胞增殖；FOXO3a 蛋白表達(dá)降低，機(jī)體修復(fù)DNA 損傷能力降低，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)；FOXO3a 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡減少，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)展［14］。

Twist 為一種廣泛存在于人、鼠、果蠅等體內(nèi)的高度保守轉(zhuǎn)錄因子，主要在來源于胚胎中胚層、胎盤及成人某些中胚層中的未分化組織內(nèi)表達(dá)，是促進(jìn)胚胎發(fā)育關(guān)鍵因子［15］。上皮—間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）是指穩(wěn)定靜止?fàn)顟B(tài)的上皮細(xì)胞細(xì)胞連接與極性的喪失并獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，為發(fā)育過程中細(xì)胞的生理性重編程現(xiàn)象。近年研究表明，EMT 與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)EMT 即視為腫瘤細(xì)胞開始侵襲、轉(zhuǎn)移［16］。Twist為調(diào)控EMT過程的關(guān)鍵因子，被認(rèn)為和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究對(duì)比結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的Twist 蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，Twist 蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，表明Twist蛋白高表達(dá)可能和結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。另外，Twist 蛋白高表達(dá)和結(jié)直腸癌分化程度、TNM 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其機(jī)制分析為Twist蛋白高表達(dá)，可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（ARF）結(jié)合來抑制其表達(dá)，從而調(diào)控P53 凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化，并抑制細(xì)胞凋亡，使TNM 分期升高；Twist 蛋白高表達(dá)，抑制E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）表達(dá)，而E-Cadherin 表達(dá)降低或缺失為EMT發(fā)生關(guān)鍵［17］。

腫瘤細(xì)胞中基質(zhì)降解為腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要條件之一。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。MMP-9 又叫明膠酶B，屬于MMPs 家族一員，被證實(shí)和多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。ZHAO等［18］報(bào)道表明，MMP-9 能降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型等膠原及明膠，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)移。楊菊等［19］研究則指出，MMP-9 可促進(jìn)腫瘤微淋巴血管形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究對(duì)比結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的MMP-9 蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，MMP-9 蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，表明MMP-9 高表達(dá)可能和結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。MMP-9 高表達(dá)和結(jié)直腸癌分化程度、TNM 分期、浸潤(rùn)程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，考慮可能與MMP-9 降解細(xì)胞外基質(zhì)，削弱其組織學(xué)屏障作用及釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子參與血管生成有關(guān)。

進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌組織中的CCDC12、FOXO3a、Twist 表達(dá)與 MMP-9 表達(dá)相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CCDC12、Twist 與 MMP-9 呈正相關(guān)，而 FOXO3a 與MMP-9 呈負(fù)相關(guān)。分析原因?yàn)椋篊CDC12 可能通過調(diào)控CyclinD1 蛋白表達(dá)間接促進(jìn)MMP-9 分泌，其中CyclinD1蛋白為啟動(dòng)細(xì)胞周期的重要蛋白，而MMP-9 參與的腫瘤新生血管形成過程與細(xì)胞異常增殖有關(guān)；FOXO3a 可促進(jìn)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體表達(dá)抑制MMP-9合成，此外FOXO3a表達(dá)降低，會(huì)激活Wnt 信號(hào)通路，從而使MMP-9 表達(dá)升高；Twist所介導(dǎo)的EMT 過程中抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1表達(dá)，從而間接使得MMP-9表達(dá)上升。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中的CCDC12、Twist、MMP-9表達(dá)升高，而FOXO3a表達(dá)降低，其表達(dá)和結(jié)直腸癌分化程度、TNM 分期、浸潤(rùn)程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；CCDC12、FOXO3a、Twist 均間接或直接調(diào)控結(jié)直腸癌組織中的MMP-9 表達(dá)來參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。