王 惠，陳 康，郝雯雯，陳義昌，于瑞蓮，林麗莎，韓燁楓

（南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京210046）

蟬花是一種蟲菌相依的組合體，是麥角菌科類真菌寄生在蟬類若蟲上的子座及若蟲的干燥復(fù)合體，屬于生物病態(tài)現(xiàn)象[1]，因其夏季成熟體頭部有類花枝樣物，故名蟬花。蟬花是一味傳統(tǒng)中藥材，性味甘寒，具散風(fēng)熱、定驚鎮(zhèn)痙作用[2]。

現(xiàn)代大量研究證實(shí)蟬花含有多種活性物質(zhì)，如多糖、核苷類、甾醇類、多球殼菌素、環(huán)肽類等物質(zhì)[3]。這些成分具有抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及治療白血病等作用，也是一種良好的自由基清除劑或自由基反應(yīng)抑制劑[4-7]，分析蟬花的特定生物活性成分及藥理作用對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)是非常必要的。

由于野生蟬花菌種和生長(zhǎng)環(huán)境差異，使得其品質(zhì)參差不齊，主要的活性成分不明。國(guó)家有明文規(guī)定，開發(fā)新藥和食品等工業(yè)化產(chǎn)品時(shí)不得使用野生品種，使得人工蟬花的研究日益重要。與野生蟬花相比，人工培養(yǎng)的蟬花因全程無(wú)菌栽培，其中重金屬含量和種類遠(yuǎn)低于野生蟬花，且孢子粉產(chǎn)量遠(yuǎn)高于野生蟬花，是一種應(yīng)用前景廣闊的藥食新資源[8-9]，見(jiàn)圖1。然而，目前針對(duì)蟬花的研究大多是藥理作用的傳統(tǒng)驗(yàn)證研究[10-11]，或僅僅研究蟬花的化學(xué)成分[12-13]，將化學(xué)成分用色譜技術(shù)進(jìn)行表征的“譜”與合適藥理指標(biāo)的“效”結(jié)合的還很少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人工蟬花具有良好的治療腸炎與腸道黏膜修復(fù)活性，因此，通過(guò)所在實(shí)驗(yàn)室制備的不同培養(yǎng)批次人工蟬花建立超高效液相指紋圖譜，結(jié)合與抑制腸道炎癥和黏膜修復(fù)活性有關(guān)的抑菌抗氧化藥效指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，篩選活性成分，為蟬花藥材的活性成分研究及開發(fā)提供參考。

圖1 野生和人工蟬花的比較Fig.1 Comparison of the leaves of wild and artificial Isaria cicadae Miquel(Ic M)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同批次蟬花：作者所在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并鑒定為正品，信息見(jiàn)表1；蟬棒束孢菌：江蘇句容野生蟬花經(jīng)菌種純化分離得到；金黃色葡萄球菌：江蘇省無(wú)錫質(zhì)檢院饋贈(zèng)；尿苷（批號(hào)：E2540025）、尿嘧啶（批號(hào)為：D4710010）、鳥苷（批號(hào)：H0170025）：購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；腺苷 （批號(hào)：KMO529CA14）、蟲草素（批號(hào)：RJ0730BA14）：購(gòu)自上海源葉有限公司，所有對(duì)照品純度均＞98%；DPPH：購(gòu)自南京建成有限公司；甲醇、乙腈為色譜級(jí)：購(gòu)自TEDIA公司。

表1 人工蟬花來(lái)源信息表Table 1 Information table of artificially cultivated Ic M

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate3000型四元梯度分析兼半制備液相：美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；BSA224S型電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；Q-500B型高速多功能粉碎機(jī)：上海冰都電器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵：南京文科儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PST-JY-10型純水機(jī)：普力菲爾公司；KQ-500B型超聲波清洗機(jī)：昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DNM-9602G型酶標(biāo)儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 UPLC指紋圖譜的建立

1.3.1 色譜條件 Megres C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相水（A）-甲醇（D），梯度洗脫：0~5 min，5%D；5~20 min，5%~15%D；20~30 min，15%~30%D；30~40 min，30%~95%D；40~50 min，95%D；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30℃；流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量10.0μL。按照上述色譜條件進(jìn)樣，各出峰峰型良好，峰與峰之間分離度也良好。

1.3.2 人工蟬花制備 按照實(shí)驗(yàn)室前期處理方法，將9批次不同時(shí)間制備的人工蟬花收集后，放入烘箱中于60℃烘干。干燥后樣品轉(zhuǎn)入旋風(fēng)分離器中，分別收取孢子粉和孢子梗、培養(yǎng)基質(zhì)[14]備用。用時(shí)進(jìn)行粉碎處理，過(guò)80目篩。

1.3.3 溶液制備

1）對(duì)照品溶液制備 精密稱取尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷、蟲草素對(duì)照品適量，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，過(guò)0.22μm微孔濾膜備用。分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇定容至5 mL，并逐級(jí)稀釋，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，于4℃供分析用。

2）供試品溶液制備 取各批次蟬花孢子粉和孢子梗細(xì)粉各1 g，置50 mL離心管中，加入10%甲醇25 mL，超聲處理1 h，趁熱過(guò)濾取上清液，過(guò)0.22μm濾膜，即得供試品溶液。

1.3.4 方法學(xué)考察 重復(fù)性考察、精密性考察及穩(wěn)定性考察，樣品各峰保留時(shí)間及峰面積的RSD＜3.0%，說(shuō)明該法重復(fù)性、精密性及穩(wěn)定性良好，可用于建立人工蟬花的指紋圖譜。

1.3.5 指紋圖譜的建立 制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣，孢子梗部位以S1樣品為參照，孢子粉部位以S10用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004版）進(jìn)行共有峰的匹配。

1.3.6 質(zhì)量濃度測(cè)定 制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣，記錄不同質(zhì)量濃度對(duì)照品的峰面積，利用相關(guān)線性方程分別計(jì)算供試品溶液5種目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度。

1.4 藥效試驗(yàn)

作者所在實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)[15]，蟬花對(duì)5-氟尿嘧啶造成的小鼠結(jié)腸黏膜損傷有一定的修復(fù)作用，而黏膜損傷和自由基含量過(guò)多有一定關(guān)聯(lián)，大多數(shù)化膿性球菌都屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，其感染以外傷、接觸、糞口感染為主，能產(chǎn)生外毒素使人致病。因此我們選擇有代表性的金黃色葡萄球菌在pH 8的生理?xiàng)l件下以及DPPH自由基清除抗氧化試驗(yàn)來(lái)聯(lián)合探索蟬花與藥效間的關(guān)聯(lián)。

1.4.1 抑菌實(shí)驗(yàn)

1）樣品液制備 在前人研究基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)[16]，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，得出蟬花質(zhì)量濃度≥0.1 g/mL時(shí)抑菌效果良好，故將供試品溶液進(jìn)行濃縮，使其質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 g/mL，再分別取1 mL用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的碳酸鈉調(diào)至pH 8，以pH 8的碳酸鈉溶液為空白對(duì)照，在超凈工作臺(tái)上經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，即為抑菌樣品液。

2）培養(yǎng)基及指示菌懸液的制備 稱取6.6 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂于200 mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至46℃?zhèn)溆谩７Q取0.9 g營(yíng)養(yǎng)肉湯溶解于50 mL蒸餾水中，在121℃下高壓滅菌15 min，得營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。然后用接種環(huán)挑取一環(huán)金黃色葡萄球菌于裝有50 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在27℃搖床下振蕩4 h，制成菌懸液，備用。

3）抑菌圈半徑測(cè)定 在超凈工作臺(tái)上用移液槍吸取0.2 mL菌懸液于平板上，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，迅速搖勻，等待其凝固。采用“濾紙片法”，用鑷子將無(wú)菌的直徑為6 mm的雙層濾紙片取出貼在平板上，吸取20μL樣品液于濾紙片上。將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈大小。

1.4.2 DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)

1）樣品液制備 基于王余宸銘等人[17]的研究，作者將蟬花孢子粉、孢子梗、培養(yǎng)基質(zhì)部位樣品溶液冷凍干燥后，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醇復(fù)溶為質(zhì)量濃度10 mg/mL的樣品溶液，以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，4℃冰箱保存待用。取DPPH固體1 mg溶于24 mL 10%甲醇中，超聲10 min，充分振搖使上下部分均勻。

2）DPPH測(cè)試液制備 取1 mL DPPH溶液，加入0.5 mL 10%甲醇稀釋后，使其吸光度在0.6~1.0。根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用同樣方法處理蟬花兩部位9批次。于96孔板中加入270μL DPPH和30 μL 10%甲醇溶液作為對(duì)照空白；其余每孔中分別加入270μL DPPH和30μL的蟬花孢子粉、孢梗束提取液（9批次）作為試驗(yàn)組，每個(gè)樣品平行測(cè)3份，暗處放置30 min后在517 nm處測(cè)定吸光度。按照以下公式進(jìn)行計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度值；A1為樣品組吸光度值。

1.5 譜效分析

1.5.1 聚類分析 采用SPSS 19.0軟件，以人工蟬花共有峰峰面積為變量，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用組間平均聯(lián)接法，以?shī)A角余弦為樣品相似度，對(duì)人工蟬花不同批次的兩個(gè)部位進(jìn)行聚類分析。

1.5.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 兩個(gè)系統(tǒng)或者兩個(gè)因素間關(guān)聯(lián)性大小的量度稱為關(guān)聯(lián)度。灰色關(guān)聯(lián)度分析是根據(jù)因素間發(fā)展趨勢(shì)的相似或者相異程度，利用確定參考數(shù)據(jù)列和若干比較數(shù)據(jù)列的幾何相似程度，對(duì)不同因素間關(guān)聯(lián)度大小進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析的一種度量方法。作者以蟬花抑菌圈半徑（cm）和抗DPPH值為參考序列，以指紋圖譜共有峰面積數(shù)據(jù)為比較序列，對(duì)孢子粉和孢子梗部位共有峰峰面積進(jìn)行均一化處理，再通過(guò)DPS軟件中灰色關(guān)聯(lián)度程序（V3.0）將指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)分別與2組藥效數(shù)值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花不同指紋圖譜的建立

2.1.1 指紋圖譜的建立 將9批次樣品制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄各樣品的UPLC圖。將孢子粉和孢子梗樣品圖譜以cdf格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版）”，以2019.2.22批次樣品圖為參照?qǐng)D譜，對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行多點(diǎn)校正，時(shí)間寬度為0.1 min，分別生成孢子粉和孢子梗部位的對(duì)照指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.精益求精，力爭(zhēng)打造教、康、保三位一體整合服務(wù)模式的典范。教、康、保三位一體整合服務(wù)模式現(xiàn)階段還處于實(shí)踐階段，由于操作時(shí)間短，個(gè)案量和個(gè)案經(jīng)驗(yàn)都非常有限，在今后的工作中，莊園將會(huì)為更多孤殘兒童提供教、康、保整合的服務(wù)。通過(guò)實(shí)踐，不斷精進(jìn)，打造出可以推廣的、較為先進(jìn)的服務(wù)模式。

圖2 人工蟬花不同部位指紋圖譜疊加圖Fig.2 Fingerprint overlay of different parts of artificially cultivated Ic M

2.1.2 相似度評(píng)價(jià)及共有峰指認(rèn) 按照色譜方法進(jìn)樣，得到的指紋圖譜色譜峰分離度良好。人工蟬花孢子粉和孢梗束部位在2個(gè)部位的指紋圖譜來(lái)源于9批不同制備時(shí)間的人工蟬花樣品，并分別與其生成的對(duì)照?qǐng)D譜比較。其中，蟬花孢子粉部位相似度較高，分別為0.942、0.988、0.958、0.980、0.975、0.989、0.988、0.982、0.980。孢梗束部位相似度分別為0.910、0.942、0.538、0.940、0.941、0.946、0.437、0.953、0.933。2019.3.1和2019.4.3批次孢梗束差別較大。其中孢子粉有28個(gè)共有峰，孢梗束有15個(gè)共有峰。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)成分在各批次樣品圖譜中均有發(fā)現(xiàn)，保留時(shí)間一致，故確定8號(hào)峰為尿苷，12號(hào)峰為蟲草素，11號(hào)峰為鳥苷，19號(hào)峰為腺苷，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各成分UPLC圖譜Fig.3 UPLC chromatogram of each component

2.2 樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

精密吸取一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行進(jìn)樣分析，以對(duì)照品的峰面積（Y）及相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種目標(biāo)成分的回歸方程Table 2 Regression equations of five targeted constituents

根據(jù)相關(guān)線性方程，用Excel和Graph Pad軟件繪制，分別計(jì)算蟬花不同批次孢子粉和孢子梗中尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷、蟲草素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/g）結(jié)果見(jiàn)表3和圖4~5。

圖4 蟬花不同部位各成分的百分比Fig.4 Percentage content of various components in different parts of Ic M

表3 蟬花不同部位各類目標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Content of various components in different parts of Ic M μg/g

由表3和圖4可知，不同采收時(shí)間的蟬花中5種活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有一定的差異，其中孢子梗部位尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體高于孢子粉部位，而蟲草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)二者較為接近。

由圖5可知，蟬花孢子粉和孢子梗部位所測(cè)成分中，尿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，占所測(cè)總成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的一半以上，而尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，孢子粉部位中尿嘧啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，占比為1.023 45%，而孢子梗部位中以蟲草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，僅占所測(cè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.985 26%。

圖5 蟬花不同部位中5種目標(biāo)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的柱狀圖Fig.5 Histogram of total contents of five targeted components in different parts of Ic M

2.3 抑菌作用

蟬花不同部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果見(jiàn)表4。

表4 人工蟬花不同部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用結(jié)果Table 4 Inhibitory results of Staphylococcus aureus from different parts of artificial cultivated Ic M

由表5可知，蟬花不同部位提取液對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑制作用，空白組（pH 8的碳酸鈉溶液）的抑菌圈直徑＜0.6 cm，基本認(rèn)定無(wú)抑菌作用，而樣品液在pH 8時(shí)抑菌效果良好，且同一批次的人工蟬花孢子粉部位的抑菌效果要優(yōu)于蟬花孢子梗部位。

2.4 自由基清除能力對(duì)比

從圖6可以看出，陽(yáng)性對(duì)照組（維生素C）的自由基清除率可達(dá)86%~95%，人工蟬花清除自由基效果最高可達(dá)陽(yáng)性對(duì)照的一半，孢子粉效果最佳。蟬花孢子梗和孢子粉部位對(duì)氧自由基均有一定清除能力，同一制備時(shí)間的人工蟬花孢子粉和孢子梗部位對(duì)氧自由基清除能力不同，均以孢子粉部位清除能力較好，其中2019.4.17批次孢子粉抗氧化最佳。從整體孢子梗各批次來(lái)看，2019.3.1和2019.4.3兩個(gè)批次孢子?？寡趸芰^好。

圖6 蟬花不同部位DPPH清除率Fig.6 DPPH clearance rate in different parts of artificial cultivated Ic M

2.5 譜效分析

2.5.1 聚類分析 由圖7可知，人工蟬花兩個(gè)部位通過(guò)聚類分析法得到了良好的區(qū)分，其中孢子粉部位（S10-S18）被歸為一類，共有峰的相對(duì)峰面積均值較為統(tǒng)一；孢子梗部位與孢子粉部位區(qū)別明顯，可以較好地進(jìn)行區(qū)別。在不同批次蟬花孢子梗中，不同制備時(shí)間帶來(lái)成分上的差異較為明顯，其中S1、S9、S4、S8、S5、S6、S2為一類，S3和S7為一類。此方法相較于蟬花相似度計(jì)算的結(jié)果更為直觀，兩種分析手段由此相互補(bǔ)充證實(shí)。

圖7 人工蟬花不同部位聚類分析Fig.7 Cluster analysis of different parts of artificial cultivated Ic M

2.5.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 將不同批次蟬花的兩個(gè)部位的共有峰面積與相對(duì)應(yīng)的蟬花樣品液在pH 8條件下的抑菌圈直徑以及不同批次DPPH值相關(guān)聯(lián)，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可以看出，一共得到了2組關(guān)聯(lián)度結(jié)果。對(duì)蟬花抑菌作用貢獻(xiàn)度較大的有2、5、11、19、23號(hào)峰（關(guān)聯(lián)度均大于0.85），對(duì)抗氧化作用貢獻(xiàn)度較大的有2、6、11、19、23號(hào)峰。綜合來(lái)看2、11、19、23號(hào)峰對(duì)人工蟬花抑菌和抗氧化的貢獻(xiàn)度都較大。

表5 人工蟬花不同部位共有峰數(shù)據(jù)與其藥效相關(guān)性Table 5 Correlation between the common peak data of different parts of artificial cultivated Ic M and its pharmacodynamics

3 結(jié) 語(yǔ)

采用人工蟬花進(jìn)行譜效分析，目的不在于對(duì)其進(jìn)行溯源，也不是對(duì)藥材的真假鑒別。一是目前有關(guān)蟬花的活性研究得到的有價(jià)值的活性成分信息很少，本研究的目的是想通過(guò)“譜”和“藥效”的結(jié)合來(lái)篩選出人工蟬花對(duì)藥效貢獻(xiàn)度大的關(guān)鍵性成分，以便為今后探究人工蟬花不同部位關(guān)鍵性成分的含量及活性研究提供基礎(chǔ)；其次也為了考察栽培蟬花質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性。結(jié)合指紋圖譜與聚類分析結(jié)果可知，9批次蟬花孢子粉的相似度較高，均大于0.90，即孢子粉樣品與批次相關(guān)性不大。但是蟬花和其他絲狀菌一樣，菌株在人工培養(yǎng)基上傳代，由于菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速率的改變等生物學(xué)性狀的變異，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)孢子梗能力和目標(biāo)活性物質(zhì)產(chǎn)量等生產(chǎn)性狀的退化現(xiàn)象，從而影響人工蟬花不同批次孢子梗產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，這也是導(dǎo)致孢子梗中有部分批次差異度比較大，從而被單獨(dú)聚類的原因之一。

前期研究發(fā)現(xiàn)，人工蟬花對(duì)腸道炎癥有快速的治療效果，但蟬花提取液并無(wú)明顯的體外抑菌活性，當(dāng)pH調(diào)至8，可以達(dá)到良好的抑菌效果，說(shuō)明蟬花的抗菌活性與pH值有關(guān)。微堿性條件同機(jī)體腸道部位pH值相近，前期的研究也證實(shí)，作者所在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的人工蟬花對(duì)5-氟尿嘧啶造成的小鼠結(jié)腸黏膜損傷有快速修復(fù)作用，腸道黏膜損傷后會(huì)造成腸道炎癥，而腸道黏膜損傷和自由基含量過(guò)多有較大關(guān)聯(lián)。所以，在抗氧化指標(biāo)方面，選用具有代表性的DPPH法來(lái)測(cè)定人工蟬花不同部位清除自由基的能力。作者所在實(shí)驗(yàn)室栽培的人工蟬花在產(chǎn)生抑菌效果的同時(shí)不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響，這一點(diǎn)同抗生素的抑菌作用有著較大的區(qū)別?？股氐囊志cpH值無(wú)關(guān)，多是微生物產(chǎn)生或化學(xué)合成的具有抑菌或者殺菌活性的物質(zhì)，且容易對(duì)機(jī)體造成不良反應(yīng)，如腹瀉、惡心、頭暈等。而本研究中人工栽培蟬花在抑菌的同時(shí)不會(huì)對(duì)腸道功能造成不良影響?；谶@些原因，選擇抑菌、抗氧化指標(biāo)來(lái)對(duì)人工蟬花的藥效活性進(jìn)行探究。此外，從不同批次蟬花不同部位的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)看，蟬花孢子梗中尿嘧啶、腺苷、鳥苷、尿苷、蟲草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值顯著高于孢子粉，且各批次的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有區(qū)別。然而在藥效實(shí)驗(yàn)中，孢子粉對(duì)金葡菌的抑制效果和自由基清除效果均優(yōu)于孢子梗。結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果可以推測(cè)，這5種活性成分需要合適的配比才能在蟬花抑菌和抗氧化中起到較為重要的作用，質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高或者過(guò)低可能對(duì)藥效均有較大影響，比如孢子粉部位中尿嘧啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，而孢子梗部位蟲草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。

由灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果可以看出，不同指標(biāo)對(duì)同一個(gè)特征峰會(huì)表現(xiàn)出各自不同的關(guān)聯(lián)度，這表明不同指標(biāo)受到某一成分的調(diào)控作用有差異性。作者以2組關(guān)聯(lián)度的均值作為綜合關(guān)聯(lián)度來(lái)判斷共有峰對(duì)藥效的貢獻(xiàn)度，2、11、19、23號(hào)峰（關(guān)聯(lián)度均大于0.85）代表的化學(xué)成分是對(duì)蟬花抑菌抗氧化作用貢獻(xiàn)較大的成分，將孢子粉和孢子梗部位的上述共有峰的峰面積相加，占蟬花孢子粉部位峰面積的50%以上，表明這些峰所代表的化學(xué)成分在人工蟬花孢子粉中量較多，和藥效試驗(yàn)部分的結(jié)果相符，即人工蟬花孢子粉部分表現(xiàn)出更好的抑菌抗氧化趨勢(shì)。但對(duì)于上述共有峰，目前從液相色譜比對(duì)中只確定了8、11、19號(hào)，分別是尿苷、鳥苷、腺苷，其他關(guān)聯(lián)度高的未知化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)有待后期研究。

另外，發(fā)現(xiàn)11、19、23號(hào)峰在蟬花孢子粉和孢子梗間、不同批次間峰面積減小時(shí)，2號(hào)峰面積增加，且2、11號(hào)峰增減最為明顯，而與其臨近的1、10號(hào)峰峰面積也相應(yīng)變化。這幾個(gè)共有峰對(duì)抑菌抗炎作用的貢獻(xiàn)度都較大，推測(cè)這些配對(duì)峰在蟬花生長(zhǎng)過(guò)程中，不同的部位可能發(fā)生了轉(zhuǎn)化[18]，比如從孢子萌發(fā)和菌落生長(zhǎng)速度看，其最佳溫為24~26℃。但孢梗束生長(zhǎng)溫度有明顯偏低現(xiàn)象，24℃以上不能形成孢梗束[19]。

通過(guò)采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法分析了蟬花抑菌抗氧化的藥效與化學(xué)成分之間的關(guān)聯(lián)度，但此法不能反映出成分對(duì)不同藥效的綜合貢獻(xiàn)度。所以在后期試驗(yàn)中將灰色關(guān)聯(lián)度與主成分分析法結(jié)合使用，并對(duì)蟬花的體內(nèi)藥效進(jìn)行探究，即完整的體內(nèi)體外藥效多重指標(biāo)，以便客觀地體現(xiàn)各成分的作用和影響，為后期蟬花藥效物質(zhì)研究提供思路。