李學(xué)亮，劉詩斌

(1.周口師范學(xué)院 機(jī)械與電氣工程學(xué)院，河南 周口466001；2.西北工業(yè)大學(xué) 電子信息學(xué)院，陜西 西安710072)

1988 年，美國加州分子器件公司Dean G. Hafeman等人[1]提出了光尋址電位傳感器(Light-Addressable Potentiometric Sensor，LAPS)。 LAPS 是一種新型的半導(dǎo)體化學(xué)/生物傳感器，具有典型的電解液-絕緣體-半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)，其獨(dú)特的光尋址特性可以在一塊傳感器上實(shí)現(xiàn)多個(gè)點(diǎn)的測量。 此外，由于LAPS 表面平坦，非常易于在其表面構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的微流路[2-3]，因此，LAPS 非常適合作為微流路分析系統(tǒng)中的傳感器。近年來，很多學(xué)者對LAPS 在微流控領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究工作，Bousse 等人[4]在LAPS 芯片微流路內(nèi)對細(xì)胞的生理代謝進(jìn)行了研究。 Hu 等人[5]在LAPS 芯片微流路內(nèi)對細(xì)胞生理代謝以及快速藥物篩選進(jìn)行了研究。 Liang 等人[6]以LAPS 為傳感基底構(gòu)建了微流控系統(tǒng)，用來實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞膜電位。 Du 等人[7]以LAPS 為基底構(gòu)建了微流控系統(tǒng)，對味覺細(xì)胞生理活動(dòng)進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測。 Miyamoto 等人[8]在LAPS芯片微流路內(nèi)對生物酶活性進(jìn)行了化學(xué)成像研究。同時(shí)，LAPS 微流控系統(tǒng)也可被用來分析微流路內(nèi)的層流現(xiàn)象[9-10]。 然而，連續(xù)流LAPS 微型化學(xué)分析系統(tǒng)存在大量死體積，樣品消耗量大，尤其不適宜微量生物樣品檢測。 Miyamoto等人[11]采用蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)微流體，構(gòu)建了一種液滴型LAPS 分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠檢測的最小分析樣品體積為400 nL。 前期，作者對降低電滲微泵的驅(qū)動(dòng)電壓進(jìn)行了深入的研究[12-15]，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)液滴型LAPS 分析系統(tǒng)的集成化，本文通過采用在微流路內(nèi)嵌入電滲微泵，并聯(lián)合微量進(jìn)樣器以產(chǎn)生微液滴的方法，構(gòu)建了一種液滴型LAPS 分析系統(tǒng)。 該微分析系統(tǒng)采用電滲驅(qū)動(dòng)的方法產(chǎn)生了樣品液滴，并對不同體積的樣品液滴的I/t 特性以及I/V 特性進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 LAPS 芯片制備

LAPS 芯片采用標(biāo)準(zhǔn)的MEMS 工藝制備[14-15]，其總厚度約為200 μm。 首先，采用熱生長的方法在N 型硅襯底表面生長一層厚度為60 nm 的SiO2絕緣層；然后采用化學(xué)氣相沉積的方法在SiO2表面生長一層厚度為50 nm 的Si3N4敏感薄膜；接著在背面濺射、刻蝕一層厚度為300 nm 的金膜作為歐姆接觸電極端子；最后切割成1.5 cm×1.5 cm 的芯片。

1.2 微流路及驅(qū)動(dòng)電極制備

微流路制作工藝:首先，在玻璃片上用SU-8 光刻膠(MicroChem Corp.)制作出微流路圖案，微流路長度寬度分別為300 μm 和80 μm，厚度在微米級(jí)；然后，將PDMS(Polydimethylsiloxane，Silpot184，Dow Corning Corp.)溶液澆筑在微流路圖案上加熱(1 h，85 ℃)固化；最后，揭下PDMS 微流路，將LAPS 芯片和微流路放進(jìn)等離子鍵合機(jī)(E102，Hitachi，Ltd.)中鍵合、綁定，形成液滴芯片。

如圖2 所示，驅(qū)動(dòng)電極制備工藝描述如下:首先將驅(qū)動(dòng)電極掩模版覆蓋在ITO 導(dǎo)電玻璃表面，然后將含有鋅粉的甘油溶液均勻涂抹在導(dǎo)電玻璃表面，晾干后將其置入稀鹽酸溶液中刻蝕掉未遮蔽部分，形成驅(qū)動(dòng)電極。

圖1 PDMS 微流路制備工藝

圖2 驅(qū)動(dòng)電極制備工藝

1.3 LAPS 的靈敏度

Nernst 方程[2]從電化學(xué)的角度描述了固-液界面雙電層的電荷、電勢分布，以H+離子為例，簡化后的方程為:

式中:ES為Nernst 電壓，R為氣體常數(shù)；F為法拉第常數(shù)；T為熱力學(xué)絕對溫度。 常溫下，LAPS 的靈敏度約為59 mV/pH，即不同的離子濃度對應(yīng)不同的輸出電位，離子濃度發(fā)生變化時(shí)，與之對應(yīng)的I-V特性曲線會(huì)發(fā)生偏移，偏移量與離子濃度變化量呈線性關(guān)系，這就是檢測離子濃度的原理。

1.4 檢測系統(tǒng)

液滴型LAPS 檢測系統(tǒng)如圖3 所示，該測量系統(tǒng)主要包括流體檢測單元和流體驅(qū)動(dòng)單元兩個(gè)部分。 流體檢測部分采用LAPS 傳感器。 LAPS 傳感器結(jié)構(gòu)從上至下依次是敏感層Si3N4、絕緣層SiO2、硅襯底n-Si、歐姆接觸黃金薄膜。 其中LAPS 表面的Si3N4薄膜對氫離子敏感，因此可以用來檢測溶液的pH 值。 LAPS 信號(hào)檢測系統(tǒng)包括紅外LED 光源，函數(shù)發(fā)生器，前置放大器，NI myDAQ 數(shù)據(jù)采集卡，LabVIEW 上位機(jī)程序以及計(jì)算機(jī)組成。 其中以紅外LED 作為光源，用直徑為500 μm 的光纖將調(diào)制光引導(dǎo)到待檢測點(diǎn)；調(diào)制光頻率為1.7 kHz；偏置電壓由數(shù)據(jù)采集卡輸出，范圍為-1.5 V～0 V；數(shù)據(jù)采集卡的采樣率為100 kHz； 前置放大器及LabVIEW 上位機(jī)程序由實(shí)驗(yàn)室制作；為避免室外光影響，芯片放入屏蔽箱中；所有實(shí)驗(yàn)過程均在常溫下進(jìn)行。 流體驅(qū)動(dòng)單元主要采用電滲微泵驅(qū)動(dòng)微流體，具體驅(qū)動(dòng)過程描述如下:采用軟光刻技術(shù)在LAPS 表面構(gòu)筑一個(gè)一字型PDMS 微流路，并在微流路內(nèi)部嵌入一個(gè)電滲微泵。 以去離子水作為電滲微泵的工作流體，用微量進(jìn)樣器在微流路出口處注射一定量的分析液。 啟動(dòng)電滲微泵，當(dāng)工作流體向左移動(dòng)時(shí)，會(huì)帶動(dòng)流路出口處的分析液一起向左移動(dòng)，形成一個(gè)微小液滴。 在微流路末端嵌入一根鉑絲充當(dāng)參比電極，當(dāng)緩沖液微滴移動(dòng)到待檢測點(diǎn)時(shí)，參比電極將與微滴接觸，形成通電回路。 當(dāng)在參比電極和LAPS 傳感器之間施加直流偏置電壓時(shí)，在SiO2/Si 界面附近會(huì)產(chǎn)生一層耗盡層，耗盡層的寬度可通過偏置電壓調(diào)控。 當(dāng)用調(diào)制光照射被檢測區(qū)域時(shí)，耗盡層的寬度會(huì)發(fā)生變化，同時(shí)在回路中會(huì)產(chǎn)生交變的光電流。 施加掃描偏置電壓可得到LAPS 光電流特性曲線。 當(dāng)LAPS 檢測結(jié)束時(shí)，切換電滲驅(qū)動(dòng)電壓方向，啟動(dòng)電滲微泵，將分析樣驅(qū)動(dòng)至流路出口，完成一次LAPS 檢測。 更換不同的緩沖液分析樣，如此重復(fù)以上過程，完成對不同緩沖液分析樣的分析檢測。 LAPS 光電流特性曲線的偏移量與pH 緩沖液的濃度成線性關(guān)系，進(jìn)而可推算出LAPS 的靈敏度。

圖3 液滴LAPS 檢測系統(tǒng)示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 液滴產(chǎn)生

液滴產(chǎn)生過程描述如下:用微量進(jìn)樣器在微流路出口處滴加一定量的樣品溶液，啟動(dòng)電滲微泵，樣品溶液將會(huì)隨著電滲流一起向微流路進(jìn)口方向移動(dòng)，此時(shí)樣品溶液在微流路內(nèi)形成一定長度的液體注，即樣品液滴，如圖4 所示。

圖4 液滴產(chǎn)生

2.2 1 μL 微滴I/t 特性研究

圖5 表示當(dāng)樣品液滴經(jīng)過LAPS 芯片光照檢測點(diǎn)時(shí)光電流的變化情況。 首先，用微量進(jìn)樣器在微流路出口處滴加1 μL 的pH ＝7 的緩沖液；然后，啟動(dòng)電滲微泵，電滲流向左移動(dòng)，此時(shí)，待測液滴將會(huì)隨著電滲流一起向左移動(dòng)(待測微滴和電滲工作流體之間有空氣間隔形成電氣隔離)，當(dāng)待測微滴流經(jīng)檢測點(diǎn)時(shí)，光電流突然升高至0.1 μA 左右，當(dāng)微滴流出檢測位置時(shí)，光電流迅速下降到初始值。 切換電滲驅(qū)動(dòng)電壓方向，待測液滴將會(huì)隨著電滲流一起向右移動(dòng)至微流路出口，完成一次樣品液滴的檢測。

圖5 當(dāng)微液滴經(jīng)過LAPS 檢測點(diǎn)時(shí)的輸出光電流變化

2.3 不同體積不同pH 值的樣品微滴I/V 特性研究

在分析緩沖液液滴時(shí)，將偏置電壓固定在-0.5 V，并且在測量過程中，以10 mV 的增量將偏置電壓從-1 V 增加到1 V 的同時(shí)測量光電流值的大小。 光源調(diào)制頻率為1.7 kHz，采樣頻率為100 kHz，樣本數(shù)量為10 000，電滲微泵的抽吸速度為1.4 mL/h，測量結(jié)果如圖6(a)所示。 由圖可知，可以獲得不同pH 值液滴的I-V 特性曲線。 還可以看出，隨著分析樣pH 值的增加，獲得LAPS 的I-V特性曲線在偏壓軸方向上向右移動(dòng)。 圖6(b)顯示了從該I-V 特性獲得的每種pH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的拐點(diǎn)電壓(拐點(diǎn)電壓為I-V 特性曲線斜率最大值處的電壓，確定拐點(diǎn)電壓的方法通常采用求導(dǎo)法)，從結(jié)果可以看出，拐點(diǎn)電壓相對于pH 線性變化。 通過擬合直線的斜率，可以確定LAPS 的pH 靈敏度為47.7 mV/pH。 根據(jù)這些結(jié)果，可以通過液滴型LAPS 分析系統(tǒng)進(jìn)行pH 測量，而傳統(tǒng)的LAPS 的檢測系統(tǒng)通常消耗樣品溶液在數(shù)毫升級(jí)別，但是液滴型LAPS 的測試溶液消耗量非常少，僅為1 μL。

圖6 1 μL 時(shí)不同pH 值的樣品液滴I/V 特性

在上一節(jié)中，使用1 μL 的緩沖液進(jìn)行pH 測量。 可以通過減小流路的尺寸，進(jìn)一步減少分析樣品的消耗量。 分別對寬度為1 mm 深度為1 000 μm以及寬度為1 mm 深度為200 μm 的微流路進(jìn)行了芯片制作測試。 由于0.5 mm 寬的流路比較狹窄，難以將氯化銀油墨用于參比電極，因此不能用來制作檢測芯片。 然而1 mm 寬的流路，可以在任一高度上制造測量芯片，并且可以通過電滲微泵驅(qū)動(dòng)液滴的運(yùn)動(dòng)，因此，選擇了可以產(chǎn)生體積更小液滴、寬度為1 mm、深度為200 μm 的微流路。 當(dāng)在該流路中滴入200 nL 分析樣品時(shí)，在流路中會(huì)形成長度為1 mm 的液滴。

使用制備的測量芯片，在200 nL 的測試溶液體積下測量pH 標(biāo)準(zhǔn)溶液(pH 5、pH 7、pH 9)的I-V 特性。 將NaCl 添加到pH 標(biāo)準(zhǔn)溶液中，以使氯離子濃度為0.05 mol/L，并使用微量稀釋器滴加。 在監(jiān)視測試溶液期間，將偏置電壓固定為-0.5 V，并且在測量期間，以10 mV 的增量將偏置電壓從-1 V 增加到0.5 V的同時(shí)，測量光電流值的大小。 LED 調(diào)制頻率為1.7 kHz，采樣頻率為100 kHz，采樣點(diǎn)數(shù)為10 000，電滲微泵的抽吸速度為1.4 mL/h，測量結(jié)果如圖7(a)所示。 可以看出，隨著溶液的pH 值增加，獲得的I-V 特性在偏壓軸方向右移動(dòng)。 圖7(b)顯示了從該I-V 特性獲得的每種pH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的拐點(diǎn)電壓。 從該結(jié)果可知，pH 與拐點(diǎn)電壓之間呈線性關(guān)系，從近似直線的斜率可知傳感器的pH 靈敏度為45.8 mV/pH。 與上一節(jié)中顯示的1 μL 測試溶液的測量結(jié)果相比，所獲得的光電流值沒有顯著差異，并且pH 敏感性大致相同。 這是因?yàn)槊看螠y定中使用的測定芯片的流路寬度相同，并且即使測試溶液的量減少也不會(huì)改變光照射面積。 根據(jù)這些結(jié)果，可以通過減小流路尺寸而將測量所需的測試溶液的量減少至200 nL。

圖7 200 nL 時(shí)不同pH 值的樣品液滴I/V 特性

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的連續(xù)流LAPS 分析系統(tǒng)存在樣品溶液消耗量大的問題，本文提出了一種液滴型LAPS 微流控芯片結(jié)構(gòu)，并對該芯片進(jìn)行了研究。 系統(tǒng)采用電滲微泵驅(qū)動(dòng)微流體，采用吸入法將樣品溶液引流至流路內(nèi)，形成了單個(gè)樣品液滴。 研究了樣品液滴I/t特性曲線，當(dāng)樣品液滴流經(jīng)檢測點(diǎn)時(shí)，光電流突然升高至0.1 μA 左右，當(dāng)樣品液滴流出檢測點(diǎn)時(shí)候，光電流降至最小。 之后研究了1 μL 樣品微滴，并測量了pH 5、pH 7、pH 9 的緩沖液微滴的I/V 特性曲線，得出傳感器的靈敏度為47.7 mV/pH，改變微流路深度，獲得200 nL 的樣品液滴，并測量了pH 5、pH 7、pH 9 的緩沖液液滴的I/V 特性曲線，得出傳感器的靈敏度為45.8 mV/pH。 深度不同但寬度相同的微流路，由于光照面積一致，光電流大小無明顯變化。與1 μL 測試溶液的測量結(jié)果相比，所獲得的光電流值沒有顯著差異，并且pH 敏感性大致相同。 這是因?yàn)槊看螠y定中使用的測定芯片的流路寬度相同，因此即使測試溶液的量減少也不會(huì)改變光照射面積。 本文的研究成果有望在生物/化學(xué)微量樣品分析領(lǐng)域得到進(jìn)一步應(yīng)用。