丁彤彤，王君萍，李祖云

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科，南寧 530021）

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)最多的癌癥之一[1]。肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）作為肺癌最常見的病理類型之一，因其獨特的臨床病理表現(xiàn)和基因突變特征，預(yù)后較差且目前的靶向藥物對LUSC 患者治療效果不佳[2-3]，因此尋找研究新的靶向目標(biāo)是非常有價值的。BUB1有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸激酶B（BUB1B）是紡錘體裝配檢查點蛋白家族的成員之一。紡錘體裝配檢查點（SAC），也稱為有絲分裂檢查點，主要作用是在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中，通過延遲細(xì)胞分裂直至確保正確的染色體分離來維持基因組的穩(wěn)定性[4]。BUB1B已經(jīng)被證明與多種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)，如FOXM1/BUB1B信號通路的激活與橫紋肌肉瘤[5]及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6]的發(fā)生有關(guān)。BUB1B的過表達(dá)有助于前列腺癌的進(jìn)展[4]。BUB1B 通過激活mTORC1信號通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展[7]，也可以通過JNK/c-Jun 通路促進(jìn)肝外膽管癌進(jìn)展[8]。BUB1B 的表達(dá)促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展[9]。BUB1B在腎透明細(xì)胞癌中顯著高表達(dá)，可作為腎透明細(xì)胞癌新的預(yù)后生物標(biāo)志物和免疫治療靶點[10]。但在LUSC 中尚未見關(guān)于BUB1B 及相關(guān)機制的報道。本研究擬通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）、免疫組化技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）及公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)綜合分析BUB1B 在LUSC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 LUSC中BUB1B表達(dá)數(shù)據(jù)的收集

從TCGA（The Cancer Genome Atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/）獲取LUSC 和癌旁組織BUB1BmRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)，包括502 例LUSC 和49 例非癌對照的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。從GEO 數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）獲取LUSC 相關(guān)高通量數(shù)據(jù)，共納入22 個數(shù)據(jù)集（GSE1987、GSE2088、GSE3268、GSE4824、GSE6044、GSE8569、GSE11117、GSE11969、GSE19188、GSE21933、GSE27489、GSE29249、GSE30219、GSE31446、GSE32036、GSE33479、GSE40275、GSE62113、GSE74706、GSE84784、GSE103512、GSE67061）包括455 例LUSC 樣本和379 例非癌樣本。對所有原始表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，所有表達(dá)數(shù)據(jù)均經(jīng)log2轉(zhuǎn)化。

1.2 細(xì)胞株

人LUSC 細(xì)胞（NCI-H2170）和人正常肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）均購自上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司；H2170 培養(yǎng)環(huán)境為含12%FBS 及1%雙抗的1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2；BEAS-2B培養(yǎng)環(huán)境為含1%上皮細(xì)胞生長因子及1%雙抗的支氣管上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，37℃，5%CO2。

1.3 RT-qPCR檢測ENSR00000075512 和BUB1B mRNA的表達(dá)情況

采用離心柱式總RNA提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）提取細(xì)胞總RNA，Prime-ScriptTM RT 試劑盒（Takara）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用PowerUp SYBR Master Mix（Thermo）進(jìn)行RT-qPCR。所有實驗操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。引物序列如下，ENSR00000075512上游：5’-GAGGCAGGAGAATCGCTTGAACC-3’，下游：5’-GAGATGGAGTCTTGCTCTTGTCACC-3’；BUB1B上游：5’-ATGGGTCCTTCTGGAAACTTAG-3’，下游：5’-GGAATGTAGTGTCAAAAACCCC-3’；GAPDH上游：5’-CCAACCGCGAGAAGATGACC-3’，下游：5’-GAGTCCATCACGATGCCAGT-3’。BUB1B及ENSR00000075512引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計和合成，GAPDH引物序列由捷尼斯生物科技有限公司設(shè)計和合成。最后采用2-△△CT方法分析mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 IHC檢測BUB1B的蛋白表達(dá)情況

1.4.1 標(biāo)本及相關(guān)病理學(xué)資料收集 LUSC組織以及癌旁組織均來源于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2019年4月至2021年6月經(jīng)病理科確診的LUSC患者穿刺或手術(shù)切除標(biāo)本的石蠟包埋組織，所有患者均簽署了知情同意書。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2018 年版）》的標(biāo)準(zhǔn)，初次確診為原發(fā)性LUSC的患者；（2）患者在就診前未接受放療或化療等其他形式的輔助治療；（3）LUSC是患者發(fā)現(xiàn)的第一個原發(fā)腫瘤，非轉(zhuǎn)移性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）無詳細(xì)臨床病理參數(shù)的患者；（2）在存檔的石蠟標(biāo)本中，LUSC 組織太小而不能再次進(jìn)行切片的患者。收集相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、臨床分期、原發(fā)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、有無吸煙史等參數(shù)。

1.4.2 免疫組化實驗主要試劑和方法 制作厚度4 μm的石蠟切片，75 ℃烘烤2 h，使用二甲苯及梯度酒精脫蠟，EDTA 抗原修復(fù)3 min，采用通用二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，重組Anti-BubR1 抗體（購自abcam 抗體官方網(wǎng)站），按1∶100 稀釋，37 ℃濕盒中孵育90 min，順序滴加通用二步法檢測試劑盒中的反應(yīng)增強液和增強酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，均在室溫下濕盒中孵育20 min，DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）顯色，蘇木精復(fù)染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4.3 染色結(jié)果評估 根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞百分率對切片進(jìn)行評分分級：（1）染色強度：沒有著色0分，淺著色1分，中等著色2分，強著色3分；（2）陽性細(xì)胞百分率：0～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3 分；76%～100%為4 分；兩者乘積：0～1 分為陰性；2～4 分為弱陽性；5～8 分為中等陽性；9～12 分為強陽性。本文界定“0～8 分”為BUB1B蛋白為低表達(dá)，“9～12分”為高表達(dá)。

1.5 從數(shù)據(jù)庫中查詢在LUSC 中與BUB1B 表達(dá)相關(guān)eRNA

使用enhancer RNA in cancers（eRic）數(shù)據(jù)庫（https://hanlab.uth.edu/eRic）查詢在LUSC中與BUB1B表達(dá)相關(guān)增強子RNA（eRNA），及eRNA 在LUSC組織和正常肺組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗。計數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用STATA 12.0 計算綜合的總標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（SMD）并繪制森林圖和集成ROC（summary ROC，sROC）曲線。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于數(shù)據(jù)庫的BUB1B mRNA差異表達(dá)

合并GEO 芯片數(shù)據(jù)與TCGA 序列數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析，結(jié)果表明：BUB1B在LUSC組織中的mRNA表達(dá)水平高于正常組織（SMD=2.37；95%CI：1.72～3.03；I2=91.9%）（圖1A）；sROC 曲線下面積（AUC）為0.98（95%CI：0.97～0.99）（圖1B），提示BUB1BmRNA 的高表達(dá)具有良好的區(qū)分LUSC 和正常肺組織樣本的能力。BUB1B的合并的敏感性為0.94（圖2A），合并的特異性為0.92（圖2B），合并的陽性似然比（PLR）為9.67（圖2C），合并的陰性似然比（NLR）為0.11（圖2D）和合并的診斷優(yōu)勢比（DOR）為90.65（圖2E）。以上結(jié)果均顯示BUB1B在LUSC中表達(dá)上調(diào)。

圖1 TCGA序列數(shù)據(jù)和GEO芯片數(shù)據(jù)綜合分析BUB1B mRNA表達(dá)情況

圖2 集成所有數(shù)據(jù)集的診斷價值

2.2 RT-qPCR結(jié)果

檢測LUSC細(xì)胞株H2170及人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B中BUB1B的表達(dá)。結(jié)果顯示，LUSC細(xì)胞中BUB1BmRNA 表達(dá)水平高于正常肺上皮細(xì)胞（t=-5.883，P=0.004），見圖3。

圖3 BUB1B在LUSC細(xì)胞株H2170和人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B中的表達(dá)

2.3 HIC實驗結(jié)果

總共收集61 例LUSC 組織和對應(yīng)54 例癌旁或正常肺組織，HIC 染色鏡下觀見圖4 A～圖4 D。BUB1B蛋白在LUSC組織細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色陽性表達(dá)。LUSC 組織中BUB1B蛋白染色評分分級為陰性0 例，弱陽性者23 例，中等陽性者20例，強陽性者18例，而癌旁/正常肺組織中BUB1B 蛋白染色評分分級為陰性48 例，弱陽性者6 例，中等陽性者0 例，強陽性者0 例，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 BUB1B蛋白染色評分分級與樣本組織類型之間的關(guān)系n（%）

圖4 LUSC組織和癌旁或正常肺組織IHC染色結(jié)果（×400）

2.4 BUB1B 蛋白表達(dá)水平與LUSC 患者臨床病理特征之間的關(guān)系

分析BUB1B 表達(dá)水平與LUSC 患者不同的臨床病理特征之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，BUB1B 蛋白在原發(fā)腫瘤大小、臨床分期中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度、吸煙史中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 BUB1B 蛋白表達(dá)水平與LUSC 患者臨床病理特征之間的關(guān)系

2.5 BUB1B在LUSC中的潛在調(diào)節(jié)途徑

在eRic 數(shù)據(jù)庫中查找在LUSC 組織中與BUB1B表達(dá)相關(guān)的eRNA，得到ENSR00000075512（15：40395501-40401501），基于eRic 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，ENSR00000075512在LUSC 中表達(dá)高于非癌組織（P＜0.01），且在不同亞型中的差異表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5）。RT-qPCR檢測ENSR00000075512在LUSC 細(xì)胞株H2170 及人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B中的表達(dá)（圖6），結(jié)果顯示，LUSC細(xì)胞中ENSR00000075512表達(dá)水平高于正常肺上皮細(xì)胞（t=-7.427，P=0.002），提示BUB1B和ENSR 00000075512可能通過相互作用參與LUSC發(fā)生發(fā)展。

圖5 基于eRic 數(shù)據(jù)庫ENSR00000075512在LUSC組織中表達(dá)

圖6 ENSR00000075512在LUSC細(xì)胞株H2170和人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B中的表達(dá)

3 討論

BUB1B 作為SAC 蛋白家族成員，在SAC 信號傳導(dǎo)和著絲點與紡錘體微管的穩(wěn)定附著中起著核心作用[8]。在多種癌癥中的高表達(dá)以及促癌作用已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報道[4-10]，Shin 等[11]和Park 等[12]也發(fā)現(xiàn)BUB1B 的低表達(dá)參與了結(jié)腸腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。由于癌癥的發(fā)展機制十分復(fù)雜，涉及的分子機制非常多，BUB1B 在不同癌癥中調(diào)節(jié)機制也不盡相同，如FoxM1 通過調(diào)節(jié)BUB1B 影響橫紋肌肉瘤[5]和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6]的生物學(xué)行為；在肝外膽管癌中，JNKc-Jun 信號通路可能被BUB1B 調(diào)控[12]；Qiu 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)BUB1B在肝細(xì)胞癌中通過上調(diào)mTORC1 信號通路發(fā)揮致癌作用。目前尚無BUB1B 在LUSC中的差異表達(dá)及潛在分子機制的系統(tǒng)研究。

本研究通過對包含基因芯片和RNA 測序等的數(shù)據(jù)綜合分析，同時結(jié)合RT-qPCR、IHC進(jìn)一步驗證BUB1B 在LUSC 中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，BUB1B在LUSC 組織中的表達(dá)水平高于非癌組織；RTqPCR 結(jié)果顯示，BUB1B在LUSC 細(xì)胞株H2170 中的表達(dá)高于肺正常上皮細(xì)胞系，IHC 實驗證實LUSC 組織BUB1B 蛋白表達(dá)水平高于癌旁或正常肺組織，且BUB1B蛋白在原發(fā)腫瘤大小、臨床分期中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示，BUB1BmRNA 的高表達(dá)具有良好的區(qū)分LUSC 和正常肺組織樣本的功能。

增強子是一類增強靶基因轉(zhuǎn)錄活性的DNA 順式作用元件，可以不依賴距離和方向，通過形成染色體環(huán)來促進(jìn)基因啟動子的正確激活[13]。eRNA是從增強子轉(zhuǎn)錄的一種非編碼RNA[14]。過去很長一段時間人們普遍認(rèn)為eRNA 只是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，但隨著近些年對eRNA 的深入研究，eRNA 的許多功能已經(jīng)被證明在乳腺癌[14-18]、膀胱癌[19-21]、T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病[22]、頭頸鱗癌[23-24]、肝細(xì)胞癌[25-28]等多種癌癥中發(fā)揮作用。Zhang等[15]通過整合大規(guī)?；颊邩颖竞桶┘?xì)胞系的多組學(xué)和藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)，鑒定了相當(dāng)數(shù)量的臨床相關(guān)eRNA，建立了一個數(shù)據(jù)門戶網(wǎng)站，即eRic，為研究eRNA 的表達(dá)情況、靶基因及其在腫瘤發(fā)生中的功能提供了全面的支持。通過eRic數(shù)據(jù)庫，筆者得到與BUB1B表達(dá)相關(guān)的增強子ENSR00000075512，RT-qPCR 結(jié)果顯示，ENSR00000075512在LUSC細(xì)胞株H2170中的表達(dá)高于肺正常上皮細(xì)胞系。以上結(jié)果提示在LUSC中ENSR00000075512和BUB1B可能存在調(diào)控關(guān)系并起到促癌作用。但二者具體如何對LUSC細(xì)胞起調(diào)控作用，尚有待通過體外、體內(nèi)實驗等其它實驗方法進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，BUB1B在LUSC 組織中表達(dá)上調(diào)，可能促進(jìn)LUSC的發(fā)生發(fā)展，BUB1BmRNA 的高表達(dá)具有良好的區(qū)分LUSC 和正常肺組織樣本的功能，是一個具有潛在應(yīng)用前景的預(yù)后生物標(biāo)志物。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討B(tài)UB1B 促進(jìn)LUSC 發(fā)生發(fā)展的分子機制，有望為LUSC 的靶向治療提供新的靶點和理論依據(jù)。