張文娟，胡敏，張婷婷，陳若虹（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗(yàn)科，長沙410011）

肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）是一種為人熟知的心肌損傷標(biāo)志物。有臨床醫(yī)生咨詢CK-MB活性檢測結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符的原因，經(jīng)核實(shí)發(fā)現(xiàn)樣本有輕度溶血，導(dǎo)致結(jié)果假性升高。樣本溶血在日常工作中并不少見，溶血時(shí)，紅細(xì)胞破壞，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，可通過光學(xué)干擾以及與試劑成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等機(jī)制使檢驗(yàn)結(jié)果假性升高或降低［1］，最佳處理方式為重新抽血，但聯(lián)系臨床重新抽血會延長檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告時(shí)間，而且部分患者重新抽血困難較大?！杜R床標(biāo)本溶血檢測與檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告專家共識》［2］建議實(shí)驗(yàn)室應(yīng)驗(yàn)證檢驗(yàn)項(xiàng)目的溶血干擾閾值，即溶血造成的檢驗(yàn)結(jié)果改變超出允許偏差時(shí)的標(biāo)本血紅蛋白濃度，常以溶血指數(shù)（haemolytic index，HI）表示，當(dāng)標(biāo)本HI低于檢驗(yàn)項(xiàng)目的溶血干擾閾值時(shí)，實(shí)驗(yàn)室可以報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果，因此提高檢測系統(tǒng)的溶血干擾閾值，即抗溶血干擾能力，也是應(yīng)對溶血的有效手段。本研究對3種不同品牌的CK-MB活性檢測試劑進(jìn)行溶血干擾實(shí)驗(yàn)，以了解溶血對CK-MB活性檢測的干擾程度，并尋找有較強(qiáng)的抗溶血干擾能力的試劑。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2021年5月中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院患者血清標(biāo)本40份，CK-MB濃度分布在3～150 U/L范圍內(nèi)，同時(shí)收集CK-MB接近醫(yī)學(xué)決定水平25 U/L和90 U/L的2份血清標(biāo)本，所有標(biāo)本均無脂血、溶血及黃疸。

1.2 主要儀器與試劑 7600型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司），XN-20型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本希森美康公司），CK-MB活性檢測試劑盒及配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品（寧波美康公司、羅氏公司以及日本關(guān)東化學(xué)公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 檢測前確保儀器性能正常，使用試劑盒配套的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器（兩點(diǎn)法定標(biāo)）并檢測配套的雙水平質(zhì)控品，質(zhì)控結(jié)果均在控后才開始檢測。

1.3.1 溶血前后的比對 40份血清樣本用3種試劑分別檢測CK-MB活性及HI 2次，檢測完成后，將樣本隨機(jī)分成3組，樣本數(shù)分別為14、13、13，用潔凈玻璃棒攪拌試管底部紅細(xì)胞，1～3組的攪拌時(shí)間分別為10、20、40 s，造成不同程度的溶血，離心后重新檢測CK-MB、HI以及血紅蛋白濃度，比較溶血前后CK-MB的差異以及分析偏差與HI的關(guān)系。

1.3.2 溶血干擾實(shí)驗(yàn) 取血細(xì)胞分析檢測結(jié)果全為正常的EDTA-K2抗凝血一份，離心后去上清液，加入用生理鹽水洗滌的紅細(xì)胞，離心后去上清液，重復(fù)洗滌3次，加入去離子水并充分震蕩使紅細(xì)胞裂解，離心后取上清液作為溶血干擾母液。依據(jù)EP7-A2［3］的方法，收集CK-MB活性接近醫(yī)學(xué)決定水平25 U/L和90 U/L血清標(biāo)本，在標(biāo)本中加入溶血母液制備成干擾高值樣品，加入等量的去離子水制備成干擾低值樣品，加入體積不超過總體積的10%。用血細(xì)胞分析儀檢測干擾高值樣品的血紅蛋白濃度，重復(fù)檢測3次取均數(shù)。干擾低值（L）和高值（H）樣品按L、3L+1H、2L+2H、1L+3H、H的比例混合，配制成不同濃度梯度的干擾血清。每份樣品測定CK-MB及HI 3次取均值，計(jì)算干擾樣品中血紅蛋白濃度以及CK-MB的偏差。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 非正態(tài)分布計(jì)量資料用M（P25，P75）表示，溶血前后的差異比較采用配對t檢驗(yàn)，采用線性回歸分析偏差與HI的關(guān)系。采用Excel 2016和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，溶血造成結(jié)果偏差的允許范圍設(shè)為10%。

2 結(jié)果

2.1 溶血前后結(jié)果的比較 40例樣本溶血前HI均為0，溶血后HI為2～20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝7.475，P＜0.01），用血細(xì)胞分析儀檢測溶血后血清中的血紅蛋白約為0～600 mg/dL。對溶血前后的CK-MB檢測結(jié)果作配對t檢驗(yàn)，關(guān)東試劑的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.033，P＝0.974），美康（t＝6.966，P＜0.01）和羅氏（t＝7.824，P＜0.01）的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3種試劑檢測溶血前及溶血后的CK-MB活性、偏差和HI見表1。將溶血前后CK-MB的絕對差值與HI作線性回歸，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見圖1。

表1 溶血前后檢測結(jié)果的比較［M（P25，P75）］

圖1 溶血前后CK-MB差值與HI的散點(diǎn)圖

2.2 溶血干擾實(shí)驗(yàn) 在血細(xì)胞分析儀上測得干擾高值樣品中的血紅蛋白濃度為500 mg/dL。干擾低值與干擾高值樣品按不同比例混合后得到血紅蛋白濃度呈梯度排列的5個(gè)樣品，計(jì)算得到樣品中血紅蛋白濃度分別為：0、125、250、375、500 mg/dL。分別用3種試劑檢測干擾樣品中的CK-MB活性3次，以血紅蛋白濃度為0的樣本為對照樣本，計(jì)算各樣本的CK-MB活性均值以及與對照樣本的偏差，結(jié)果見表2。

表2 干擾樣本中CK-MB活性的均值及與對照樣本的偏差

3 討論

本研究分析的溶血干擾由紅細(xì)胞裂解產(chǎn)生，模擬了日常工作中的真實(shí)情況，缺點(diǎn)是干擾物的成分及濃度難以確定，因?yàn)槌思t細(xì)胞外，其他血細(xì)胞如白細(xì)胞、血小板等細(xì)胞的內(nèi)容物也會釋放出來，還有由干擾母液帶入的外源性干擾，使得干擾因素復(fù)雜化，但本研究的目的是比較不同試劑的抗干擾能力，由于所有樣本都是用3種試劑同時(shí)檢測，干擾條件對3種試劑來說都是相同的，因此可暫不分析具體是哪些物質(zhì)造成的干擾，如果在多種干擾因素同時(shí)存在的情況下，偏差仍然在允許范圍內(nèi)，更能反映該試劑的抗干擾能力優(yōu)秀。細(xì)胞裂解后釋放的干擾物總量，應(yīng)該與血紅蛋白的濃度成正比，因此我們同時(shí)檢測了溶血指數(shù)和血紅蛋白濃度，可間接反映血細(xì)胞裂解后各種干擾物的濃度。

溶血前后CK-MB活性的比對結(jié)果顯示，美康和羅氏的檢測結(jié)果在溶血后明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過控制攪拌時(shí)間，40份血清HI呈梯度排列，溶血后的偏差與HI呈線性正相關(guān)，說明溶血越嚴(yán)重，偏差越大。而關(guān)東試劑溶血后的結(jié)果與溶血前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表1和圖1顯示CK-MB溶血前后的差異遠(yuǎn)小于其他2種試劑，絕對偏差在-5.2～6.6 U/L之間，且與HI無明顯相關(guān)性。

溶血干擾實(shí)驗(yàn)顯示，幾乎所有的美康和羅氏的干擾樣本的偏差均超過了10%，而且隨著血紅蛋白濃度增加，偏差也隨之增大。而對于關(guān)東試劑，低值樣本在血紅蛋白為250 mg/dL，高值在血紅蛋白為500 mg/dL時(shí)，其檢測結(jié)果的偏差仍未超過10%的設(shè)定目標(biāo)，抗干擾能力遠(yuǎn)強(qiáng)于其他兩種試劑。

CK-MB作為一種經(jīng)典的心肌損傷標(biāo)志物，被各大臨床診療指南［4-7］推薦，它對心肌損傷的時(shí)間判定和檢出早期再梗死有重要價(jià)值［8］。CK-MB可以通過特異的單克隆抗體檢測質(zhì)量［9］，干擾因素少但成本較高，CK-MB活性檢測成本低廉，仍是目前常用的檢測方法。目前CK-MB活性檢測多為免疫抑制法，有較多干擾因素，血紅蛋白引起的光學(xué)干擾可以通過樣品空白、雙波長等方法消除，其他已知的干擾物質(zhì)主要有血清中的CK-BB、巨CKⅠ、巨CKⅡ以及紅細(xì)胞中的腺甘酸激酶（Adenylate Ki-nase，AK）等，CK-BB含有B亞基，巨CKⅠ被免疫蛋白包裹，均難以消除，巨CKⅡ可通過特異性抗體屏蔽［10］，AK可通過添加抑制劑以及雙項(xiàng)同測［11］等方法消除干擾，但大多數(shù)廠商并未采取相應(yīng)措施［12］。關(guān)東試劑采用雙試劑、雙波長以及雙動(dòng)力反應(yīng)模式消除溶血引起的干擾，效果明顯。雙動(dòng)力反應(yīng)模式的抗干擾原理與雙向同測法［11］類似。